小鼠孕早期暴露量子點(diǎn)對妊娠結(jié)局和CD4+CD25+Tre g細(xì)胞的影響*

鄭鳳霞，許恒毅，傅芬

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

論著

小鼠孕早期暴露量子點(diǎn)對妊娠結(jié)局和CD4+CD25+Tre g細(xì)胞的影響*

鄭鳳霞1，許恒毅2，傅芬1

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

目的探討小鼠孕早期暴露硫化鋅量子點(diǎn)（Q Ds）對妊娠結(jié)局和外周血C D4+C D25+T r e g細(xì)胞的影響。方法制備成年健康孕鼠并將其隨機(jī)分為高劑量Q Ds組、低劑量Q Ds組和對照組，分別于妊娠第3～5天尾靜脈注射0.50和0.05μm ol/L Q Ds，以及生理鹽水各100μl，于妊娠第15天觀察妊娠結(jié)局，并采用流式細(xì)胞術(shù)分析孕鼠外周血C D4+C D25+T r e g細(xì)胞比例。結(jié)果Q Ds可引起流產(chǎn)、吸收胎和死胎等不良妊娠結(jié)局，高劑量Q Ds使胚胎平均著床數(shù)、胎鼠均重及胎盤均重低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且Q Ds暴露孕鼠外周血C D4+C D25+T r e g細(xì)胞的比例低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論小鼠孕早期暴露Q Ds具有胚胎毒性，且其毒性機(jī)制可能與降低外周血中C D4+C D25+T r e g細(xì)胞比例、擾亂妊娠免疫耐受有關(guān)。

量子點(diǎn)；生殖毒理；C D4+C D25+T r e g細(xì)胞；妊娠免疫耐受

近年隨著納米材料的規(guī)?；a(chǎn)和納米產(chǎn)品的普及，人類主動或被動接觸納米材料的機(jī)會越來越多，但納米材料兼有材料本身引起的毒性和納米尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等而致的特殊毒性，納米毒理學(xué)成為納米技術(shù)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是現(xiàn)代毒理學(xué)的前沿領(lǐng)域。生殖毒理學(xué)是一個關(guān)乎人類繁衍健康和社會發(fā)展的多領(lǐng)域交叉學(xué)科，研究納米材料的生殖毒理具有重要意義。量子點(diǎn)（q u ant u m dots，Q Ds）作為新型無機(jī)熒光納米粒子具有熒光壽命長、耐光漂白、發(fā)射光譜窄而對稱、激發(fā)光譜寬而連續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如生物分子檢測、生物熒光標(biāo)記、活體成像、熒光定位和動態(tài)示蹤等表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力［1-2］。相對于量子點(diǎn)細(xì)胞毒性和一般活體毒性的研究而言，關(guān)于量子點(diǎn)生殖毒性及用于篩選和評價生殖損傷觀察指標(biāo)的研究報道較少［3-4］。妊娠是一個復(fù)雜而又協(xié)調(diào)的過程，母胎界面正常免疫耐受的建立和維持是妊娠成功的關(guān)鍵。C D4+C D25+Tre g細(xì)胞起源于胸腺，可以抑制同種異體移植物的排斥反應(yīng)，在妊娠免疫耐受中的作用備受關(guān)注。大量研究表明，其不但參與母胎免疫耐受機(jī)制的形成，而且對其維持發(fā)揮積極作用，C D4+C D25+Tre g細(xì)胞平衡的失調(diào)可影響妊娠的結(jié)局［5-6］。本文以量子點(diǎn)為研究材料，以成年健康孕鼠為評價模型，研究評估小鼠孕早期暴露量子點(diǎn)引發(fā)的生殖毒性，并從C D4+C D25+Tre g細(xì)胞比例變化的角度探究其毒性機(jī)制，為認(rèn)識量子點(diǎn)的生殖安全提供重要的實(shí)驗(yàn)參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

選擇健康出生7周齡的S P F級昆明雌性小鼠24只，雄性12只，體重28～30 g，由南昌大學(xué)動物科學(xué)部提供，動物合格證號為S Y X K（贛）2015-0002。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)動物研究倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為0064257。實(shí)驗(yàn)動物在南昌大學(xué)動物房內(nèi)飼養(yǎng)，室溫保持22～24℃，相對濕度為55%～60%，晝夜交替各12 h，自由攝食、飲水，定期更換墊料。

1.2主要試劑與儀器

硫化鋅量子點(diǎn)原液（濃度為10μmol/L，水化粒徑為8～10 nm，吸收光譜為400～600 nm，發(fā)射光譜為540～560 nm）購自美國O cean NanoTech公司，A nti-M o u se C D4-異硫氰酸熒光素（f l u orescein isothiocyanate，F(xiàn) I T C）單抗、A nti-M o u se C D25-藻紅蛋白（P hycoerythrin，P E）單抗、A nti-M o u se I g G2a抗體購自美國B D公司。流式細(xì)胞儀購自美國B D公司，超凈生物工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，電子天平購自上海梅特勒-托利多有限公司，恒溫水浴箱購自江蘇金壇市中大公司，離心機(jī)購自安徽中科中佳科學(xué)儀器公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動物分組及染毒

將所購小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，于下午5∶00將雌性、雄性小鼠以2∶1比例合籠，次日清晨8∶00檢查陰栓，以查見陰栓日為妊娠第1天，其余妊娠天數(shù)依次類推。參照文獻(xiàn)［7-8］的量子點(diǎn)染毒劑量，將所得24只妊娠早期雌鼠完全隨機(jī)化分為3組，分別為對照組（生理鹽水）、低劑量（0.05μmol/L）和高劑量（0.50μmol/L）Q Ds組，每組8只，于妊娠第3、4和5天采用尾靜脈注射方式染毒，染毒容量為100μl/只，1次/d，連續(xù)染毒3 d。實(shí)驗(yàn)期間，每天上午9∶00稱量記錄孕鼠體重，并觀察記錄其呼吸、神態(tài)、活動和陰道出血等情況。

1.4孕鼠的解剖和胚胎毒性的觀察

將所有孕鼠于妊娠第15天摘除眼球，收集新鮮抗凝血后頸椎脫臼處死，迅速沿腹中線剖開腹腔暴露子宮。首先觀察記錄死胎、活胎和吸收胎，然后剪除子宮，去掉血污后依次分離胎盤、胎鼠，稱量胎鼠、胎盤的重量。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測孕鼠外周血CD4+CD25+Tre g細(xì)胞的比例

取新鮮抗凝血100μl，加入A nti-M o u se C D4-F I T C單抗10μl、A nti-M o u se C D25-P E單抗10μl（同時設(shè)置A nti-M o u se I g G2a同型陰性對照反應(yīng)管、A nti-M o u se C D4-F I T C單陽管和 A nti-M o u se C D25-P E單陽管）輕微混勻，室溫避光孵育25min，加入紅細(xì)胞裂解液2ml，避光裂解10min，1 200 r/min離心5min，棄上清液，加入1 ml磷酸鹽緩沖溶液（phosphate b uff er saline，P B S）洗滌細(xì)胞，1 200 r/min離心5min后棄上清液。再加入500μl P B S重懸細(xì)胞，30min內(nèi)在流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，根據(jù)前向角散射（f or w ard scatter，F(xiàn) S C）和側(cè)向角散射（side scatter，SS C）光信號圈定淋巴細(xì)胞群，根據(jù)同型陰性對照樣品（小鼠I g G2a同型對照反應(yīng)管）來調(diào)整儀器電壓，用C D4單陽和C D25單陽樣品來調(diào)整F I T C和P E之間的熒光補(bǔ)償，以淋巴細(xì)胞群設(shè)門來計算C D4+淋巴細(xì)胞的比例，以C D4+設(shè)門來計算C D4+C D25+Tre g細(xì)胞占C D4+T細(xì)胞比例。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用S P SS 19.0統(tǒng)計軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析（O ne-w ay，A N OV A）及LS D檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般觀察結(jié)果

觀察期間各組孕鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，高劑量Q Ds組孕鼠進(jìn)食、進(jìn)水量較對照組和低劑量Q Ds組明顯減少，其毛色晦暗，嗜睡，活動減少，精神萎靡，其中有3只孕鼠出現(xiàn)陰道流血、體重驟降等癥狀；低劑量Q Ds組孕鼠注射藥物后出現(xiàn)易激惹、躁動不安等癥狀；對照組所有孕鼠未發(fā)現(xiàn)異常。觀察期間高劑量Q Ds組、低劑量Q Ds組孕鼠體重凈增長率［孕期體重凈增長率=（妊娠當(dāng)日體重-妊娠第1天體重）/妊娠第1天體重×100%］較對照組減少。見附圖。

2.2量子點(diǎn)對妊娠結(jié)局的影響

本研究觀察期間高劑量Q Ds組有3只孕鼠發(fā)生流產(chǎn)，解剖其余5只孕鼠見3只死亡胚胎及4個吸收胎等不良妊娠結(jié)局，各組胚胎平均著床數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.927，P=0.002）。各組胎鼠均重比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=87.824，P=0.000）。各組胎盤均重比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=21.640，P=0.000）。量子點(diǎn)暴露孕鼠平均著床數(shù)、胎鼠均重和胎盤均重低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3Q Ds對CD4+CD25+Tre g細(xì)胞的影響

附圖　量子點(diǎn)對孕鼠凈體重變化的影響

高劑量Q Ds組、低劑量Q Ds組孕鼠外周血中C D4+T細(xì)胞的比例比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.199，P=0.000）。C D4+C D25+Tre g細(xì)胞占C D4+T細(xì)胞比例比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=210.998，P=0.000）。Q Ds暴露孕鼠外周血中C D4+T細(xì)胞的比例及C D4+C D25+Tre g細(xì)胞占C D4+T細(xì)胞比例低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1　孕鼠妊娠早期暴露量子點(diǎn)對妊娠結(jié)局的影響（n=8，）

表1　孕鼠妊娠早期暴露量子點(diǎn)對妊娠結(jié)局的影響（n=8，）

注：t1、P1值：低劑量Q Ds組與對照組比較；t2、P2值：高劑量Q Ds組與對照組比較

組別胎盤均重/ g對照組　1 5 . 1 3 ± 2 . 6 4 　0 . 3 3 ± 0 . 2 5 　0 . 1 4 ± 0 . 0 1低劑量Q D s組　1 2 . 6 7 ± 1 . 8 6 　0 . 2 9 ± 0 . 0 1 　0 . 1 2 ± 0 . 1 0高劑量Q D s組　9 . 0 0 ± 3 . 2 4 　0 . 2 3 ± 0 . 1 3 　0 . 1 0 ± 0 . 0 1 t1值　3 . 5 2 7 　-1 8 . 2 0 5 　-4 . 1 2 3 P1值　0 . 0 1 0 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 4 t2值　-4 . 2 3 0 　1 2 . 8 0 2 　-1 2 . 6 9 4 P2值　0 . 0 1 3 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0平均著床數(shù)/個胎鼠均重/ g

表2　孕鼠妊娠早期Q Ds對外周血CD4+CD25+Tre g細(xì)胞的影響 （n=8，%）

表2　孕鼠妊娠早期Q Ds對外周血CD4+CD25+Tre g細(xì)胞的影響 （n=8，%）

注：t1、P1值：低劑量Q Ds組與對照組比較；t2、P2值：高劑量Q Ds組與對照組比較

組別C D 4+C D 2 5+/ C D 4+對照組　3 1 . 9 0 ± 2 . 7 5 　3 7 . 1 3 ± 2 . 6 0低劑量Q D s組　2 6 . 8 8 ± 1 . 9 1 　2 3 . 7 0 ± 1 . 0 7高劑量Q D s組　1 8 . 5 7 ± 0 . 6 1 　1 9 . 9 0 ± 0 . 8 7 t1值　-8 . 2 3 0 　-2 9 . 3 2 7 P1值　0 . 0 1 7 　0 . 0 2 5 t2值　-5 6 . 0 8 7 　-5 1 . 0 9 5 P2值　0 . 0 0 0 　0 . 0 1 1 C D 4+

3　討論

納米材料的生殖毒性研究主要包括對生殖能力、宮內(nèi)胚胎發(fā)育和子代的影響等方面。2008年C H A N等［9］發(fā)現(xiàn)，Q Ds具有小鼠囊胚發(fā)育毒性，可誘導(dǎo)囊胚凋亡，經(jīng)Q Ds染毒后的囊胚種植到子宮內(nèi)膜后，其發(fā)育較對照組緩慢。H S I E H等［10］通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Q Ds有較明顯的胚胎發(fā)育毒性，經(jīng)Q Ds干預(yù)后發(fā)育的胚胎著床后吸收胎率增加，胎盤及胎兒重量明顯減輕。但目前關(guān)于妊娠早期Q Ds的生殖毒性及其機(jī)制的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)較少見，且妊娠早期是哺乳動物最為敏感的時期，妊娠母體在該階段接觸藥物或化學(xué)材料更易對子代造成不同程度的影響，研究納米材料的胚胎毒性對環(huán)境保護(hù)和健康有重要意義。本實(shí)驗(yàn)在小鼠妊娠的第3～5天經(jīng)尾靜脈注射Q Ds，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Q Ds暴露孕鼠的平均胎仔數(shù)、胎鼠均重和胎盤均重等較對照組減少，且高劑量Q Ds組孕鼠出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎及吸收胎等不良妊娠結(jié)局，表明小鼠孕早期以靜脈注射方式暴露一定量的Q Ds可導(dǎo)致胚泡著床障礙和胚胎宮內(nèi)發(fā)育遲緩等毒性。

納米材料本身及其釋放的重金屬離子毒性可與其干擾性激素水平、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和相關(guān)氧化應(yīng)激水平等因素相關(guān)［11-12］。從生殖免疫學(xué)觀點(diǎn)來看，胚胎擁有一半父源性遺傳物質(zhì)，一次成功的妊娠形同一次成功的同種異體移植，胚胎所攜帶的父源性抗原刺激母體免疫活性細(xì)胞進(jìn)行免疫應(yīng)答，但同時母體內(nèi)具有免疫抑制功能的細(xì)胞也增加，使免疫應(yīng)答和免疫抑制相平衡，才能使胎兒正常發(fā)育直至分娩，母胎界面正常免疫耐受的建立和維持是妊娠成功的關(guān)鍵。C D4+C D25+Tre g細(xì)胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞群，是機(jī)體調(diào)控不適當(dāng)或者過強(qiáng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵機(jī)制之一，其通過調(diào)控抑制性T細(xì)胞，抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞，亦能促進(jìn)一些抑制性細(xì)胞因子（如轉(zhuǎn)化生長因子和白細(xì)胞介素-10）的分泌等，在防止自身免疫性疾病及母胎免疫耐受機(jī)制的形成和維持中發(fā)揮重要作用［5-6］。研究表明，正常妊娠時孕體外周血中C D4+C D25+Tre g細(xì)胞比例升高，而不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者或其他病理妊娠機(jī)體外周血中C D4+C D25+Tre g細(xì)胞比例較正常妊娠者減少［13-14］。R OW E等［15］報道在易發(fā)流產(chǎn)的機(jī)體外周血中C D4+C D25+Tre g細(xì)胞數(shù)量較正常妊娠組明顯減少，C D4+C D25+Tre g細(xì)胞缺乏可導(dǎo)致母體產(chǎn)生針對胎兒的免疫排斥，使流產(chǎn)率增加。本實(shí)驗(yàn)中通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組孕鼠外周血C D4+C D25+Tre g細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Q Ds暴露孕鼠外周血中C D4+C D25+Tre g細(xì)胞比例較對照組降低，且高劑量Q Ds組最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。推測孕鼠妊娠早期暴露于Q Ds引發(fā)的胚泡著床障礙、胚胎宮內(nèi)發(fā)育遲緩等胚胎毒性，可能與其降低C D4+C D25+Tre g細(xì)胞比例破壞母胎免疫耐受平衡有關(guān)，但關(guān)于新型納米材料量子點(diǎn)的生殖毒性的具體機(jī)制及其有關(guān)因素有待進(jìn)一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Effects of quantum dots on pregnancy outcomes and CD4+CD25+regulatory T cells in early pregnant m ice*

Feng-xia Zheng1，Heng-yi Xu2，F(xiàn)en Fu1
（1.Department of Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China；2.National Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330047，China）

Objective To investigate the effects of quantum dots（QDs）on pregnancy outcomes and CD4+CD25+regulatory T cells in early pregnant mice.M ethods The pregnant mice were randomly divided into three groups（QDs high-dose exposure group treated with 0.5μmol/L QDs，100μl/mice per day；low-dose exposure group treated with 0.05μmol/L QDs，100 ul/mice per day；and normal saline group treated with 0.9% NS，100μl/mice per day）.Solutions of the different treatment materials were administered by tail vein injection on the 3rd-5th GD.The pregnant outcomes were observed and CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood were detected by flow cytometry on the 15th GD.Results In the QDs exposure groups，the pregnant mice showed abnormal pregnancy outcomes（abortion，stillbirth and fetal absorption）.The avrage number of embryo implantation，offspring's body weight and placental weight in the high-dose exposure group were significantly lower than those of the control group（P＜0.05）.The proportion of CD4+CD25+regulatory T cells in CD4+T cells in the QDs groups was significantly lower than that of the control group（P＜0.05）. Conclusions The exposure of pregnant mice to QDs during early pregnancy is harm ful to embryos.One of the toxicity mechanisms may be related to the decrease of CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood.

quantum dot；reproductive toxicology；CD4+CD25+regulatory T cell；pregnancy immune tolerance

R 994

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.005

1005-8982（2016）15-0028-04

2015-12-25

江西省青年科學(xué)基金（No：20143A C B21003）

傅芬，E-mail：fu_f en@163.com