NADPH氧化酶抑制劑apocynin對力竭運動大鼠運動性蛋白尿的影響*

陳麗娜，周　剛，吳　樂，侯少華

(湖南大學體育學院，長沙 410082)

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NADPH氧化酶抑制劑apocynin對力竭運動大鼠運動性蛋白尿的影響*

陳麗娜，周剛△，吳樂，侯少華

(湖南大學體育學院，長沙 410082)

目的：研究 NADPH氧化酶抑制劑apocynin對力竭運動大鼠運動性蛋白尿產(chǎn)生的影響及其機制。方法：32只SD雄性大鼠隨機分為安靜對照組(C組)、對照+藥物組(CA組)、力竭運動組(E組)、力竭運動+藥物組(EA組)。藥物注射按10 mg/kg體重，每天一次，連續(xù)3 d，并在末次藥物注射1 h后進行一次性跑臺力竭運動。測定運動后尿UP、血液BUN水平、腎臟ROS濃度、NOS活性、NOS與3-NT蛋白含量。結果：結果顯示，E組UP、腎臟ROS、iNOS含量及活性、3-NT明顯升高，而EA組的這些指標與C組相比無顯著性差異。結論：力竭運動可明顯增加腎組織NADPH氧化酶活性，從而產(chǎn)生大量的ROS，后者可迅速地與由腎臟iNOS催化生成的NO反應，產(chǎn)生過量的ONOO-，誘發(fā)運動性蛋白尿的生成。

NADPH氧化酶；運動性蛋白尿；活性氧；過氧亞硝基陰離子；一氧化氮

自1877年Vonleub首次報告士兵行軍和野營訓練后出現(xiàn)蛋白尿以來，運動性蛋白尿的研究已有一百多年的歷史。關于運動性蛋白尿產(chǎn)生的機制，從氧自由基角度進行的研究越來越受關注。來自動物實驗和人體實驗的報告已證明運動導致的氧應激誘發(fā)了運動性蛋白尿的產(chǎn)生，然而，促使運動性蛋白尿生成的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的來源及其后續(xù)作用途徑并不清楚。

NADPH氧化酶是機體細胞ROS生成的最重要途徑之一。在病理條件下，腎臟NADPH氧化酶活性增加，促使腎組織ROS生成增加。已有研究表明，NADPH氧化酶誘導的ROS也是運動性蛋白尿生成的重要途徑[1]。組織中過量生成的ROS可與NO反應生成過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-)，而ONOO-是比O2-更強的氧化劑，它可以介導更強的氧化應激損傷。已有報道運動性蛋白尿生成時ONOO-增加[2]，但尚不清楚運動性蛋白尿伴隨的ONOO-生成是否依賴于NADPH氧化酶生成的ROS。本研究通過大鼠力竭跑臺運動構建運動性蛋白尿模型，對大鼠尾部注射NADPH氧化酶抑制劑apocynin，研究NADPH氧化酶依賴的ONOO-途徑對運動性蛋白尿生成的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SD雄性大鼠32只，體重240～260 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2013-0004。分籠飼養(yǎng)，每籠4只，室溫環(huán)境為20-25℃，自由飲食、飲水，自然晝夜變化光照。

1.2實驗分組及處理方法

32只大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為安靜對照組(C組)、對照+藥物組(CA組)、力竭運動組(E組)、力竭運動+藥物組(EA組)。

運動模型根據(jù)Kocer[1]的實驗改進，采用中等強度一次性力竭跑臺運動，具體運動強度參照Bedford[3]等人對大鼠最大攝氧量的研究。ZH-PT跑臺，購于淮北正華生物儀器設備有限公司。動物購入后飼養(yǎng)3 d，然后E組和EA組進行3 d跑臺適應性運動，5 m/min，每天1次，無坡度。正式運動時以5 m/min開始，每5 min增加5 m，直至增加到25 m/min，無坡度，持續(xù)運動至力竭，在整個運動過程中用電刺激進行強迫運動，電刺激強度小于1 mA。經(jīng)實驗統(tǒng)計，大鼠在力竭運動的時間平均在90～120 min之間，觀察到大鼠汗毛豎起，四肢癱軟，眼神無光，翻轉后無法進行翻正反射，電刺激無法繼續(xù)運動即為達到力竭狀態(tài)。

力竭運動前兩天開始各組大鼠進行尾部靜脈注射，其中CA組、EA組注射NADPH氧化酶抑制劑apocynin，購于Sigma-aldrich，STBD7270V。注射劑量為10 mg/kg體重，每天1次，連續(xù)3 d；C組、E組注射同等劑量的生理鹽水。E組和EA組在末次注射1 h后開始一次性力竭運動測試。

1.3樣本的采集與處理

1.3.1血液采集一次性力竭運動后，立刻乙醚麻醉，用5 ml一次性無菌注射器左心室取血，即刻測定血尿素氮(BUN)。

1.3.2尿的取樣用微量注射器抽取膀胱尿液，隨即檢測尿總蛋白濃度。

1.3.3腎組織的取樣迅速取出左右兩腎，置于冰上去除脂肪及結締組織，生理鹽水沖洗余血，并用濾紙吸干水分，密封保存在-80℃超低溫冰箱中以備勻漿。稱取腎組織1 g左右放于冰上剪碎，按1 mg∶5 μl的比例加入PBS勻漿液(PH 7.4，mmol/L,磷酸5、蔗糖250、EDTA 0.1、PMSF 1和DTT 1)，勻漿后分裝兩個離心管，一管以3 000 r/min，離心10 min，取上清液分裝后-80℃保存，用于ROS、NOS活性、蛋白定量測定；另一管以12 000 r/min，離心10 min，取上清液繼續(xù)離心10 min后取上清液分裝-80℃保存，用于神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、硝基酪氨酸(3-NT)蛋白測定。

1.4指標的測定

尿蛋白濃度(UP)：CBB法測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。血尿素氮(BUN)：比色法測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

腎活性氧(ROS)：采用熒光探針(DCFH-DA)檢測[4]，試劑購于碧云天生物技術研究所。96孔板中測定孔每孔加入200 μl腎組織勻漿液，及100 μmol/L NADPH(對照孔加入等量SOD)和10 μmol/L DCFH-DA，混勻，37℃恒溫孵育30 min，多功能酶標儀檢測，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm。

腎NOS活性：采用熒光探針法(DAF-2DA)檢測nNOS、iNOS、eNOS活性[4]，試劑均購于碧云天生物技術研究所。96孔板中測定孔每孔加入20 μl腎組織勻漿液,然后分別加入含NOS抑制劑(nNOS抑制劑Spermidine,iNOS抑制劑1400W，eNOS抑制劑L-NAME)的PBS 100 μl，再每孔加入100 μl DAF-2DA PBS(μmol/L L-arginine,2 mmol/L Ca2+,1 μmol/L DAF-2 DA)，37℃恒溫孵育60 min，多功能酶標儀檢測，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm。

腎NOS、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、3-NT蛋白：蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測腎臟nNOS、iNOS、3-NT蛋白含量，以GAPDH做內(nèi)參。GAPDH抗體購于杭州賢至生物科技有限公司，nNOS、iNOS、eNOS、二抗抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，3-NT抗體購于美國Sigma-aldrich公司。

腎組織蛋白定量：采用BCA蛋白濃度測定法，試劑盒購于碧云天生物技術研究所。

1.5統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1力竭運動對大鼠尿蛋白、血尿素氮的影響

由表1可見，通過一次性力竭運動，E組的尿蛋白濃度約是C組的3倍(P<0.01)，EA組UP與E組相比下降明顯(P<0.05)，表明一次性力竭運動可明顯導致運動性蛋白尿生成增加，而NADPH氧化酶抑制劑apocynin也明顯抑制了UP生成。

GroupUP(mg/L)BUN(mg/dl)C74.63±14.924.18±1.34CA60.37±8.344.04±0.20E228.16±40.26**##7.00±1.97*#EA161.39±24.75△7.47±1.45*#

C：Control group；CA：Control apocynin group；E：Exercise group；EA：Exercise apocynin group

*P<0.05，**P<0.01 vs C；#P<0.05，##P<0.01 vs CA；△P<0.05 vs E

2.2力竭運動對腎組織ROS的影響

由圖1可見，一次性力竭運動后，E組腎臟ROS與C組相比明顯升高(P<0.05)，提示力竭運動可明顯增加腎臟ROS生成；EA組較E組ROS生成量亦顯著性降低(P<0.05)，表明apocynin明顯抑制了NADPH氧化酶活性，導致ROS生成明顯減少。

C：Control group；CA：Control apocynin group；E：Exercise group；EA：Exercise apocynin group

*P<0.05 vs C；#P<0.05 vs E

2.3力竭運動對腎NOS的影響

腎組織的一氧化氮合酶(NOS)有nNOS、iNOS和eNOS三種亞型。分別用Spermidine,1400W和L-NAME抑制NOS的活性，檢測到E組和EA組腎iNOS活性較C組明顯增加(P<0.05)，而nNOS和eNOS的活性未見變化。同時，Western blot測定腎NOS蛋白，也僅見E組和EA組腎iNOS蛋白表達明顯增加(P<0.05)，而nNOS和eNOS未見變化。力竭運動后iNOS蛋白表達與活性的變化見圖2。

2.4力竭運動對腎ONOO-生成的影響

過氧亞硝酸陰離子ONOO-具有很強的氧化性，可使蛋白質(zhì)中的酪氨酸硝基化。ONOO-在機體內(nèi)產(chǎn)生后迅速消失，不易檢測，但可以通過檢測其反應的產(chǎn)物3-硝基酪氨酸(3-NT)來推測其生成量。由圖3可見，E組較C組腎3-NT生成量顯著增加(P<0.01)，而EA組與E組相比明顯降低(P<0.05)，說明一次性力竭運動明顯造成ONOO-生成量增加，而注射NADPH氧化酶抑制劑apocynin可減少ONOO-的生成。

Fig.2Effects of exhaustive exercise on iNOS protein expression and activity

C：Control group；CA：Control apocynin group；E：Exercise group；EA：Exercise apocynin group

*P<0.05 vs C；#P<0.05 vs CA

Fig.3Effects of exhaustive exercise on renal 3-NT generation

C：Control group；CA：Control apocynin group；E：Exercise group；EA：Exercise apocynin group

**P<0.01 vs C；#P<0.05 vs E

3　討論

安靜時正常人體的尿液中只有極微量的蛋白隨腎臟隨尿排出，但在急性的劇烈運動或長期過度訓練情況下，由于腎小球通透性增大，超出了腎小管的重吸收能力，導致運動性蛋白尿發(fā)生[5]。本研究采用了中等強度的跑臺力竭運動，大鼠力竭時間約在90～120 min。從大鼠力竭后膀胱抽取的尿液檢測到，力竭運動組尿蛋白含量較安靜組上升了近2倍(P<0.01)，同時，血BUN水平也明顯升高(P<0.05)。

造成力竭運動后尿蛋白增加的原因，可能與運動引起的腎臟缺血/再灌注引起的腎功能受損有關。運動時，骨骼肌血流量增加，而腎血流量急劇減少，并隨運動過程的持續(xù)和強度遞增表現(xiàn)得更加明顯。由于腎血流量的下降，腎小球的濾過率隨之下降，但濾過分數(shù)反而上升，這反而有利于血漿蛋白進入到原尿中。并且，腎臟在缺血一段時間后，血液再灌注時氧分子重新進入組織內(nèi)，反而使缺血造成的腎功能損傷加劇[6]。此外，在運動性蛋白尿增加的同時，由于腎功能受損，腎小球濾過率減少，尿素的清除率減低，致使這些含氮的產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積而潴留，血中非蛋白含量增高，尿素排出量減少，血中尿素增加[7]。

3.1力竭運動導致的蛋白尿依賴于NADPH氧化酶途徑生成的ROS

相關研究表明，腎臟的缺血/再灌注與腎臟組織ROS的生成有密切的聯(lián)系[6]，力竭運動可導致腎臟的氧化損傷,并進一步導致了蛋白尿的形成[1]。然而，誘導運動性蛋白尿生成的ROS的來源及其后續(xù)的作用機制并不清楚。

近年來，一些學者提出運動引起的骨骼肌以外組織的ROS增加源于NADPH氧化酶[1]。在腎臟中，NADPH氧化酶成分大量表達在腎血管、腎小球系膜、足細胞致密斑、厚升支段、遠端小管和集合管內(nèi)。在生理狀態(tài)下，這些細胞的NADPH氧化酶活性很低，而各種生長因子、細胞因子、高血糖和脂質(zhì)代謝障礙的刺激可使此酶激活，產(chǎn)生ROS[8]，作為信號傳遞分子或自由基的來源導致氧化損傷[9]。apocynin是一種NADPH氧化酶的強抑制劑。有研究表明apocynin可以降低NADPH氧化酶活性，抑制氧化應激，減少微量蛋白尿的分泌，延緩腎臟病進展，在糖尿病腎病中具有保護作用[10]。本研究采用apocynin來抑制NADPH氧化酶活性，結果提示一次性力竭運動可明顯增加腎組織ROS的生成，而注射apocynin的力竭運動組由于apocynin抑制了腎組織中NADPH氧化酶活性，使ROS的生成減少。因此，可以認為，力竭運動誘導的腎組織ROS生成增加，與NADPH氧化酶活性增加有關。

本研究參照了Kocer的力竭運動模型。在Kocer的研究中發(fā)現(xiàn)，運動性蛋白尿模型的跑臺力竭運動明顯造成大鼠腎臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和NADPH氧化酶活性增加，而給大鼠連續(xù)4天注射diphenyleneiodonium chloride(DPI，一種NADPH氧化酶的抑制劑)，力竭運動后大鼠腎臟NADPH氧化酶活性受抑制，ROS生成量減少，蛋白尿生成也隨之減少。推測腎臟NADPH氧化酶活性的增高可能源于力竭運動誘發(fā)的中性粒細胞或巨噬細胞對腎組織的浸潤,也可能是運動期間腎臟組織增加的自由基激活了位于腎小球的NADPH氧化酶[1]。

總之，本研究與Kocer等的研究結果均觀察到，抑制腎臟NADPH氧化酶活性可以消除力竭運動導致的腎臟氧應激的發(fā)生，并防止運動性蛋白尿的生成。這些研究結果表明，NADPH氧化酶活性的增加，是力竭運動導致腎臟ROS增加的一個重要來源，是誘發(fā)運動性蛋白尿的重要途徑。為了了解NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS的后續(xù)作用，即ROS是如何進一步誘導運動性蛋白尿生成的，本研究從ONOO-途徑進行了進一步研究。

3.2力竭運動誘導腎臟ONOO-生成

在NO存在的情況下，O2-.可與NO反應生成ONOO-。ONOO-具有很強的強氧化性和硝基化作用，可硝基化蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基并生成3-NT,并能改變酶活性、造成線粒體損傷及細胞凋亡。

由于ONOO-在體內(nèi)的半衰期極短，因此研究中常選擇ONOO-的生物標志物3-NT來推測ONOO-生成量。3-NT的檢測已被廣泛地運用于腎臟疾病的研究。在運動模型的研究中，李麗、田振軍等的研究均推測過度訓練導致腎臟產(chǎn)生過量NO可迅速與O2-.反應，結合生成ONOO-，并進一步造成腎組織的過氧化損傷[11]或直接造成DNA損傷[12]。然而，前述推測國內(nèi)并未見實證研究。本研究通過Western blot檢測到了力竭運動后腎臟3-NT的變化，顯示一次性力竭運動可明顯增加大鼠腎組織3-NT表達(P<0.01)，而力竭運動+藥物組大鼠與力竭運動組相比3-NT表達明顯降低(P<0.05)，提示力竭運動可導致腎組織ONOO-增加，而通過apocynin抑制NADPH氧化酶活性后，ONOO-生成減少，說明前述力竭運動導致的NADPH氧化酶途徑生成的ROS參與了腎組織ONOO-的生成。并且，NADPH氧化酶途徑的ROS生成量、ONOO-生成量與尿蛋白的生成保持同步變化，提示ONOO-的過量生成也可能是運動性蛋白尿形成的誘導因素。

Gülsen等[2]采用大鼠連續(xù)5 d的跑臺力竭運動，在末次運動24 h之后，檢測到力竭組大鼠尿液中蛋白質(zhì)和糖類均顯著增加，同時腎曲小管部位ONOO-顯著增加。作者認為，腎小球和腎小管是力竭運動導致蛋白質(zhì)、糖類及類固醇排泄增加的敏感區(qū)域，ONOO-也可能主要產(chǎn)生于這些部位。來自離體的腎缺血/再灌注的研究發(fā)現(xiàn)，小劑量的ONOO-可能對腎功能產(chǎn)生生理保護效應，而應用大劑量的ONOO-灌注,尿鈉排泄顯著增多,提示ONOO-對腎小管的重吸收功能有損傷作用[13]。運動性蛋白尿形成與腎小管的重吸收能力不足有關[5]，因此力竭運動時腎臟產(chǎn)生的過量ONOO-也可能損傷了腎小管的重吸收功能，從而導致蛋白尿的發(fā)生。

為進一步了解力竭運動導致腎臟ONOO-生成增加的NO的來源，本研究對力竭運動大鼠腎臟中三種NOS蛋白(nNOS、iNOS、eNOS)及其活性均進行了檢測，結果未檢測到nNOS和eNOS蛋白表達及其活性有變化，而無論是力竭組還是力竭+藥物組，均顯示iNOS蛋白表達明顯增加(P<0.05)，并且，與之相一致的是iNOS活性也見明顯增高(P<0.05)。可以認為，力竭運動通過激活腎臟iNOS蛋白表達及其活性，使腎臟組織內(nèi)NO生成增多。董靜梅[14]也證明了過度訓練可激活NADPH氧化酶活性，iNOS生成增多，ROS產(chǎn)生增加，并通過補充谷氨酰胺可抑制NADPH氧化酶活性，減少ROS生成。

有研究表明，在腎臟缺血/再灌注過程中，可引起腎iNOSmRNA表達上調(diào)，iNOS表達增多，而力竭運動所致的血液重新分配即可誘發(fā)腎臟缺血/再灌注。Evans研究發(fā)現(xiàn)，腎小球cNOS蛋白含量在缺血/再灌注1 h后明顯增高，而腎小管iNOS活性在5 h后表達明顯，iNOS活性增強后生成過量的NO導致腎組織器官損傷，而這一機制可能與ONOO-的生成有關[15]。田振軍等在一項不同強度的大鼠跑臺訓練的研究中發(fā)現(xiàn)，在運動狀態(tài)下，NOS的3種亞型的表達均呈增高趨勢，且運動強度越大，生成的NO越多，對腎臟的損傷也越大。結果表明，不同強度運動引起NOS在腎臟皮質(zhì)區(qū)的表達與缺血/再灌注可誘導其表達的情形相一致，表明運動狀態(tài)下NOS 在腎臟的表達類似于腎臟缺血/再灌注損傷。并進一步推測腎臟皮質(zhì)區(qū)過量生成的NO與O2-.反應生成更強氧化性的ONOO-[10]。

綜上所述，力竭運動可明顯增加腎組織NADPH氧化酶活性，從而產(chǎn)生大量的O2-.，后者可與主要由腎臟iNOS催化生成的NO反應，產(chǎn)生大量的ONOO-，進而引起運動性蛋白尿的生成。

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Effect of NADPH oxidase inhibitor apocynin on the exercise induced proteinuria in rats

CHEN Li-na，ZHOU Gang△,WU le,HOU Shao-hua

(College of Sport,Hunan University,Changsha 410082，China)

Objective:To investigate the effect of NADPH oxidase inhibitor apocynin on exercise-induced proteinuria and its related mechanism.Methods:Thirty-two SD rats were randomly divided into the control group(group C),control + drug group(group CA),exhaustive exercise group(group E),exhaustive exercise + drug group(group EA).The rats were administrated apocynin at 10 mg/kg weight,once a day for three days,and one hour after the drug injection,a one-time exhaustive exercise was performed.After exhaustive exercise,urine protein,blood urea nitrogen(BUN),and kidney reactive oxygen species(ROS)concentration,NOS activity,NOS and 3-NT concentration were detected.Results:In comparison to control group urinary protein(UP),ROS,inductible nitric oxide synthase(iNOS),3-NT levels increased significantly in group E while those in group EA did not change.Conclusion:The elevated renal NADPH oxidase activity by exhaustive exercise induced ROS that can rapidly react with NO,and then produces excess peroxynitrite,which contributes to occurrence of exercise-induced proteinuria.

NADPH oxidase;exercise-induced proteinuria;reactive oxygen species(ROS);peroxynitrite(ONOO-);nitric oxide

湖南省自然科學基金資助(12JJ3093)

2015-05-25

2015-11-11

△Tel：13548644844；E-mail：zg460@126.com

G804.5

A

1000-6834(2016)02-116-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.006