血必凈注射液對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌功能與結(jié)構(gòu)的影響*

何金波,楊　絮，羅梓垠，袁培根，宋　冬，項(xiàng)冰倩，陳錫文，王萬鐵△

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035;2.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)麻醉科,湖北 十堰 442000;3.溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州 325000;4.溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 溫州 325035)

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血必凈注射液對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌功能與結(jié)構(gòu)的影響*

何金波1,2+,楊絮3+，羅梓垠1，袁培根1，宋冬1，項(xiàng)冰倩1，陳錫文4△，王萬鐵1△

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035;2.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)麻醉科,湖北 十堰 442000;3.溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州 325000;4.溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 溫州 325035)

目的：探討不同劑量的血必凈注射液對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌功能的保護(hù)作用。方法：采用Langendorff方法制備大鼠離體心臟缺氧/復(fù)氧模型。130只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(sham組)，缺氧/復(fù)氧組(H/R組)，低、中、高劑量血必凈組(XBJL、XBJM、XBJH組),除對(duì)照組外，其他四組按復(fù)氧不同時(shí)相(復(fù)氧0.5 h、1 h、2 h)又分別分為3個(gè)亞組(n=10)。對(duì)照組在平衡灌注20 min時(shí)紀(jì)錄左室發(fā)展壓(LVDP)、左心室發(fā)展壓最大上升/下降速率(± dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓(LVP)、心率(HR)的值，ELISA檢測(cè)心肌中肌酸激酶同工酶(CK-MB)的濃度，光鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)的改變；其余各組平衡灌注20 min后，灌注ThomasⅡ停搏液使心臟完全停搏30 min之后復(fù)灌K-H液使其心臟復(fù)跳，連續(xù)記錄LVDP、±dp/dtmax、LVP、HR在復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化，ELISA檢測(cè)各組復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)心肌中CK-MB的濃度，光鏡下觀察各組復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：與sham組相比，其余各組LVDP、± dp/dtmax、LVP值均降低(P<0.05)，心肌中CK-MB濃度上升(P<0.05)，心肌組織結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，隨著復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)，以上指標(biāo)異常變化逐漸加劇；在復(fù)氧0.5 h、1 h、2 h，各劑量血必凈組 LVDP、±dp/dtmax、LVP的值均高于H/R組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的值(P<0.05)，心肌中CK-MB濃度均低于H/R組，心肌組織結(jié)構(gòu)異常變化減輕，以中劑量改善效果最佳(P<0.05)。結(jié)論：血必凈注射液能夠有效改善缺氧/復(fù)氧大鼠心肌的功能及形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，以中劑量血必凈(4 ml/100 ml)效果最佳。

心??；缺氧/復(fù)氧；血必凈；心肌功能；心肌結(jié)構(gòu)；大鼠

機(jī)體組織器官正常功能的維持取決于良好的血液循環(huán)，各種原因所引起的組織和器官的缺氧都會(huì)使機(jī)體發(fā)生缺氧性損傷，及時(shí)恢復(fù)氧供是治療的關(guān)鍵，但臨床中發(fā)現(xiàn)，缺氧組織或器官在恢復(fù)氧供后，反而產(chǎn)生了損傷加重的現(xiàn)象，即缺氧/復(fù)氧損傷。隨著近些年來心肌梗死后冠狀動(dòng)脈再灌注治療技術(shù)的發(fā)展，心肌缺氧/復(fù)氧損傷(myocardial hypoxia /reoxygenation injury，MH/RI)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。MH/RI在臨床上主要表現(xiàn)為再灌注性心律失常、心肌頓抑、心肌酶譜的升高、梗死面積擴(kuò)大等現(xiàn)象。研究表明，再灌注期間，自由基的大量生成、細(xì)胞鈣超載、炎癥反應(yīng)、凋亡是導(dǎo)致MH/RI的重要原因[1-3]。

血必凈注射液是由紅花、川芎、丹參、當(dāng)歸等具有活血化瘀作用藥物組成的復(fù)方中藥制劑，具有改善微循環(huán)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，可通過抑制白介素、腫瘤壞死因子、細(xì)胞間黏附分子等炎性因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，從而對(duì)機(jī)體的重要臟器起到保護(hù)作用。已有研究報(bào)道，血必凈注射液在MH/RI中起到一定的保護(hù)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過Langendorff心臟灌流系統(tǒng)建立大鼠心臟缺氧-復(fù)氧模型，模擬臨床的體外循環(huán)過程，通過對(duì)心功能、心肌酶譜、心肌形態(tài)學(xué)改變的觀察，來研究大鼠離體心臟缺氧-復(fù)氧后心肌功能、結(jié)構(gòu)的損傷，探究血必凈注射液對(duì)缺氧-復(fù)氧大鼠心肌功能及結(jié)構(gòu)的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠130只，體重(280±30)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SYXK(浙)2010-0150】。

1.2主要儀器與試劑

Langendorff離體心臟灌流裝置和PowerLab生物信號(hào)處理與分析系統(tǒng)由澳大利亞埃德儀器有限公司提供；血必凈注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040033)由天津紅日藥業(yè)股份有限公司提供；大鼠CK-MB ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供；其它試劑為市售分析純產(chǎn)品。改良克氏液(Krebs-Henseleit，K-H，mmol/L)：氯化鈉 118.5，氯化鉀4.8，硫酸鎂1.2，磷酸二氫鉀1.2，碳酸氫鈉25.0，氯化鈣2.5，葡萄糖11.1，pH 7.40±0.05。改良ThomasⅡ停搏液(mmol/L)：氯化鈉110，氯化鉀16，氯化鈣1.2，碳酸氫鈉1.0，氯化鎂16，pH 7.8±0.05。

1.3大鼠離體心臟缺氧-復(fù)氧模型的制備

采用Langendorff方法，大鼠稱重后，用5%水合氯醛(7～8 ml/kg)腹腔注射麻醉，開腹，經(jīng)下腔靜脈注射肝素(1000 U/kg)抗凝，迅速開胸取出心臟懸掛在langendorff離體心臟灌流裝置上，用95%O2+5%CO2飽和的K-H液經(jīng)主動(dòng)脈進(jìn)行逆行灌注。灌注液溫度為37℃±0.5℃，pH 7.40±0.05，灌注壓100 mmHg。

1.4實(shí)驗(yàn)分組

雄性健康SD大鼠130只，體重(280±30)g，隨機(jī)分為對(duì)照組(sham組)、缺氧/復(fù)氧組(H/R組)，低、中、高劑量血必凈組(XBJL、XBJM、XBJH組)，H/R組、XBJL組、XBJM組和XBJH組按復(fù)氧不同時(shí)相(復(fù)氧0.5 h、1 h、2 h)又分別分為3個(gè)亞組(n=10)。sham組平衡灌注20 min后將心臟保存；H/R 各組在用95% O2+5% CO2飽和的K-H液平衡灌注20 min后，灌注改良ThomasⅡ停搏液使心臟完全停搏30 min之后復(fù)灌95% O2+5% CO2飽和K-H液使其心臟復(fù)跳并持續(xù)灌注，復(fù)灌的時(shí)間分別為30 min、1 h、2 h；XBJL組、XBJM組和XBJH組分別在改良ThomasⅡ停搏液中加入血必凈注射液2 ml/100 ml、4 ml/100 ml、8 ml/100 ml，其他處理與H/R組相同。

1.5監(jiān)測(cè)心功能的指標(biāo)

從左心耳向左心室插入球囊，球囊內(nèi)注射適量生理壓水，維持左心室舒張末期壓力(LVEDP)(4～10)mmHg，通過Powerlab八通道生理記錄儀連續(xù)記錄各組左室發(fā)展壓(left ventricular development pressure，LVDP)、左心室發(fā)展壓最大上升速率(maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure，± dp/dtmax)、左室內(nèi)壓(left ventricular pressure,LVP)的變化。

1.6ELISA方法檢測(cè)心肌組織中CK-MB的濃度

各組分別取心肌組織100 mg，在超聲勻漿機(jī)中充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，4℃,3 000 r/min，離心15 min，取上清，用BCA試劑盒對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量，用大鼠CK-MB ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠心肌中CK-MB的濃度。

1.7HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)

各組灌注完畢后，立即取下心臟，放入冷生理鹽水中漂洗，從心尖部同一部位取材，用4%的多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)的改變。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1各組大鼠心功能參數(shù)的比較

平衡灌注20 min末各組間LVDP、±dp/dtmax、LVP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與sham組相比，復(fù)氧期間H/R組、XBJL組、XBJM組、XBJH組的LVDP、±dp/dtmax、LVP值明顯降低(P<0.05)，且隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，各組以上指標(biāo)呈持續(xù)下降趨勢(shì)；XBJL組、XBJM組、XBJH組復(fù)氧0.5 h、1 h、2 h的LVDP、±dp/dtmax、LVP值均高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)H/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以XBJM組最為顯著(P<0.05，表1)。

2.2各組大鼠心肌組織CK-MB的表達(dá)

H/R組、XBJL組、XBJM組和XBJH組復(fù)氧0.5 h、1 h、2 h心肌CK-MB的濃度均明顯高于sham組(P<0.05)；隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，各組心肌中CK-MB的表達(dá)持續(xù)上升，心肌損傷逐漸加重；XBJL組、XBJM組、XBJH組在復(fù)氧0.5 h、1 h、2 h時(shí)CK-MB的表達(dá)與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)H/R組相比，均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以XBJM組最為顯著(P<0.05,表2)。

Tab.1　Comparison of parameters of cardiac function among groups ±s,n=10)

H/R:Hypoxia /reoxygenation group;XBJL:Low dose XBJ;XBJM:Middle dose XBJ;XBJH:High dose XBJ;XBJ:Traditional Chinese Medicine complex

*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs I/R group;ΔP<0.05 vs XBJLgroup;▲P<0.05 vs XBJMgroup

GroupCK-MB(ng/ml)Sham13.7±3.4H/R0.5hafterH/R75.7±8.6*1hafterH/R137.3±9.0*2hafterH/R158.4±8.0*XBJL0.5hafterH/R69.1±14.5*1hafterH/R112.9±6.9*#2hafterH/R138.7±2.4*#XBJM0.5hafterH/R56.4±6.8*#1hafterH/R97.1±10.4*#Δ2hafterH/R119.0±1.0*#ΔXBJH0.5hafterH/R67.3±11.3*1hafterH/R107.2±11.1*#2hafterH/R131.6±2.8*#▲

H/R:Hypoxia/reoxygenation group;XBJL:Low dose XBJ;XBJM:Middle dose XBJ;XBJH:High dose XBJ;CK-MB:Creatine kinase-MB

*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs I/R group;ΔP<0.05 vs XBJLgroup;▲P<0.05 vs XBJMgroup

2.3各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的變化

sham組心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，細(xì)胞核居中，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A，圖1見彩圖頁Ⅳ)；與sham組相比，H/R組心肌結(jié)構(gòu)損傷較重，復(fù)氧0.5 h時(shí)，心肌細(xì)胞部分出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，復(fù)氧1 h時(shí)心肌纖維腫脹，變性，部分出現(xiàn)壞死，復(fù)氧2 h組心肌纖維出現(xiàn)大范圍斷裂、溶解(圖1B)；血必凈處理后，與復(fù)氧同時(shí)間點(diǎn)H/R組相比，心肌細(xì)胞接近正常，排列緊密，血管擴(kuò)張現(xiàn)象顯著緩解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，心肌組織損傷得到了明顯改善，以XBJM組最為明顯(圖1C、D、E)。

3　討論

隨著冠心病，心肌梗死發(fā)病率的節(jié)節(jié)攀高，溶栓治療、PCI和搭橋手術(shù)在心臟外科中的運(yùn)用也日益廣泛，這意味著術(shù)后心肌缺血/再灌注損傷會(huì)成為困繞臨床醫(yī)師的重要問題。由于作用靶點(diǎn)廣泛，中藥在預(yù)防和治療圍術(shù)期心肌缺血/再灌注損傷方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，也獲得了越來越廣泛的應(yīng)用。 血必凈方源于血府逐瘀湯，具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪的功能，能夠有效地改善微循環(huán)，減輕缺血缺氧所引起的心肌損害，恢復(fù)和營(yíng)養(yǎng)受損的心肌細(xì)胞，有早期的組織器官保護(hù)功能[5]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血必凈注射液能夠有效的對(duì)抗內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)源性炎性介質(zhì)釋放，減少炎性滲出，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，在應(yīng)激狀態(tài)下具有對(duì)臟器功能的保護(hù)作用[6]。其組分丹參已被證實(shí)能夠抑制心肌缺血/再灌注過程中心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，保護(hù)再灌注心肌[7]。 紅花提取物具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[8]，丹參和紅花提取物配伍在治療心肌缺血性疾病方面也收獲了良好的效果[9]。川穹嗪、當(dāng)歸配伍使用能有效減少炎癥滲出和血小板聚集，增加冠狀動(dòng)脈血流量[10]。

LVDP、±dp/dtmax、LVP是反映心功能的常用指標(biāo)。LVDP 反映等容收縮期左室內(nèi)壓變化，體現(xiàn)心肌順應(yīng)性。+dp/dtmax主要反映室壁張力變化速率，是評(píng)價(jià)心肌收縮性能的重要指標(biāo)。-dp/dtmax能夠良好的體現(xiàn)心肌舒張功能。LVP與左室功能和心輸出量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sham組相比，復(fù)氧期間各組心功能的指標(biāo)均發(fā)生了明顯的變化，LVDP、±dp/dtmax、LVP隨著復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)都出現(xiàn)了顯著下降；與H/R相比較，XBJ能明顯的對(duì)抗缺氧/復(fù)氧帶來的心功能損害，減緩心功能相關(guān)指標(biāo)的下降，以XBJM組效果最明顯。作為心肌損傷敏感而特異性的指標(biāo)，復(fù)氧期間心肌CK-MB表達(dá)的變化能夠有效地反映各組缺氧-復(fù)氧損傷的程度，與心功能指標(biāo)觀察結(jié)果相一致，XBJ組CK-MB的表達(dá)較H/R組明顯減輕，也證實(shí)了血必凈注射液對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌的保護(hù)作用，光鏡下對(duì)各組大鼠心肌損傷程度的直觀反映對(duì)這一結(jié)果提供了有力的依據(jù)。

綜上所述，血必凈注射液能夠有效地對(duì)抗大鼠心肌缺氧-復(fù)氧過程中心肌功能的下降，降低復(fù)氧期間心肌CK-MB的表達(dá)，減輕復(fù)氧期間心肌結(jié)構(gòu)的損傷，對(duì)缺氧-復(fù)氧心肌有較好的保護(hù)作用，提示血必凈注射液對(duì)臨床上體外循環(huán)下心肌缺氧/復(fù)氧損傷的治療有較大的推廣意義。

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Effects of xuebijing injection on cardiac function and structure in rats with myocardial hypoxia/reoxygenation injury

HE Jin-bo1,2+,YANG Xu3+,LUO Zi-yin1,YUAN Pei-gen1,SONG Dong1,XIANG Bing-qian1,CHEN Xi-wen4△,WANG Wan-tie1△

(1.Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute,Whenzhou Medical University,Whenzhou 325035；2.Department of Anesthesia,TaiHe Hospital of Hubei Medical College,Shiyan 442000;3.The First Clinical College,Whenzhou 325035；4.Experiment Animal Center,Whenzhou 325035,China)

Objective:To investigate the protective effects of xuebijing(XBJ,Traditional Chinese Medicine Complex)injection on cardiac function in rats with myocardial hypoxia /reoxygenation(H/R)injury.Methods:The isolated langendorff perfused rat heart model was established．One hundred and thirty SD rats were randomly divided into sham group,hypoxia /reoxygenation group,low dose XBJ(XBJL)group,middle dose XBJ(XBJM)group and high dose XBJ(XBJH)group.All groups except sham group were divided into three subgroups according to reoxygenation time(0.5 h,1 h,2 h )(n=10).In sham group,left ventricular development pressure(LVDP),maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure(±dp/dtmax),left ventricular pressure(LVP),and heart rates(HR)were recorded after 20 minutes balance perfusion.The creatine kinase-MB(CK-MB)in myocardium was detected by ELISA.In other groups,after 20 minutes balance perfusion,we perfused ThomasⅡto stop the hearts from beating for 30 minutes,then reperfused the K-H until hearts recover beating.The microstructure of myocardium was observed under light microscopy.LVDP,±dp/dtmax,LVP and HR were continuously recorded in other four groups and the concentrations of CK-MB in myocardium were measured by ELISA at different time points after reoxygenation.Microstructure of myocardium in each group were observed under light microscopy.Results:LVDP,±dp/dtmax,LVP and HR of other groups were significantly lower than those of sham group(P<0.05).The levels of CK-MB were higher than that of sham group(P<0.05).LVDP,±dp/dtmax,LVP and HR of XBJL,XBJM and XBJH groups were higher than those of I/R group at corresponding time points after reoxygenation(P<0.05).The levels of CK-MB were lower than that of I/R group(P<0.05)and the cardiac function was improved.The middle dose of XBJ had the best protective effect.Conclusion:Xuebijing injection can effectively improve cardiac function and structure in rats with myocardial hypoxia /reoxygenation injury,and middle dose of XBJ is the best.

myocardium;hypoxia/reoxygenation;xuebijing(Traditional Chinese Medicine complex)injection;cardiac function;cardiac structure；rats

浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013ZZ011)；全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目(08MA059)

2015-01-20

2015-10-16

△Tel：0577-86689817；E-mail：wwt@wmu.edu.cn.

+:為共同第一作者

R364

A

1000-6834(2016)02-173-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.021