固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定番茄醬中4種蘇丹紅染料

陳波

(寧波市北侖區(qū)疾病預(yù)防控制中心 檢驗(yàn)科，浙江 寧波 315800)

固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定番茄醬中4種蘇丹紅染料

陳波Δ

(寧波市北侖區(qū)疾病預(yù)防控制中心 檢驗(yàn)科，浙江 寧波 315800)

目的建立固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定番茄醬中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。方法樣品用乙腈∶三氯甲烷(v/v)=3:1提取，經(jīng)ProElut SDH固相萃取柱凈化，以乙腈和0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相，經(jīng)梯度洗脫分離，在500nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ在0.1～20 μg/mL 濃度范圍內(nèi)的加標(biāo)回收率在83.4%～94.6%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%～5.4%，在0.1～20.0 mg/L范圍呈現(xiàn)良好的線性，其回歸系數(shù)大于0.999，檢出限(LOD)分別為蘇丹紅Ⅰ 4 μg/kg、蘇丹紅Ⅱ 8 μg/kg、蘇丹紅Ⅲ 4 μg/kg、蘇丹紅Ⅳ 5 μg/kg。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、靈敏、重現(xiàn)性好，能滿足番茄醬中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ殘留的檢測(cè)需要。

高效液相色譜；固相萃??；番茄醬；蘇丹紅染料

蘇丹紅是一種化學(xué)染色劑，它的化學(xué)成份中含有一種叫萘的化合物，該物質(zhì)具有偶氮結(jié)構(gòu)，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4種類型。一般不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，由于這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定了它具有致癌性，對(duì)人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用。蘇丹紅屬于化工染色劑，主要是用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。 近年來(lái)蘇丹紅染料被部分違法商家添加到食品表面著色以改善感官度[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)1995年確定，蘇丹紅屬第三類致癌物質(zhì)。如果長(zhǎng)期大劑量攝入會(huì)增加人體致癌的危險(xiǎn)性。歐盟國(guó)家已在1995年禁止其作為食用色素，我國(guó)在《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中也禁止將蘇丹紅作為食品添加劑使用[2]。

番茄醬是西餐中的一種重要調(diào)味品，是增色、添酸、助鮮、郁香的調(diào)味佳品。國(guó)內(nèi)對(duì)辣椒醬中蘇丹紅染料的檢測(cè)有較多報(bào)道，但番茄醬較少。蘇丹紅的分析主要采用高效液相色譜法[3-4]、氣質(zhì)聯(lián)用法[5]、液質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法[6]、薄層色譜法等，這些方法有的前處理過(guò)程復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)費(fèi)用高、儀器設(shè)備貴，有的靈敏度低、有的檢測(cè)組分單一。固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)蘇丹紅染料的方法具有簡(jiǎn)單、靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，能夠滿足批量樣品檢測(cè)的工作要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：安捷倫1260型高效液相色譜儀，包括紫外檢測(cè)器(G1314F)、四元泵(帶真空脫氣機(jī))(G1311C)、柱溫箱(G1316A)，自動(dòng)進(jìn)樣器(G1329B)和Agilent色譜工作站；德國(guó)Sigma 3K-15型離心機(jī) ；瑞士buchi R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；優(yōu)普純水儀；電子天平(Precisa公司)；氮吹儀(天津奧特塞恩斯MTN-2800D)

1.1.2 試劑：蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對(duì)照品 (含量>99.0 %，Chem Service公司)；乙腈(美國(guó)天地公司，色譜純)、正己烷、三氯甲烷(天津四友，色譜純)；磷酸(AR)；SPE柱凈化：ProElut SDH 500 mg/6 mL(迪馬科技)，聚四氟乙烯濾膜(0.45 μm)。

蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1.0 mg/mL)：分別準(zhǔn)確稱取0.0100 g蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，分別用少量乙腈溶解后，并用乙腈定容至刻度。配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使用前逐級(jí)稀釋。

番茄醬樣品。來(lái)自于市場(chǎng)上購(gòu)買的若干份各種品牌的番茄醬。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)，0.2%磷酸(B)，梯度洗脫程序：其中A：80%；10.00 min，85%；15.00 min，100%；20.00 min，100%；21.00 min，80%，后運(yùn)行時(shí)間3.00 min。流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為500 nm。

1.2.2 樣品的提?。悍Q取10 g(精確到0.01 g)番茄醬于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈∶三氯甲烷(v/v)=3:1，勻漿，超聲5 min，10 000 r/min離心5 min，上清液移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，殘?jiān)?0 mL乙腈:三氯甲烷(v/v)=3:1重復(fù)提取1次，合并上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，加5 mL正己烷溶解，過(guò)ProElut SDH 蘇丹紅檢測(cè)專用固相萃取柱：用5 mL正己烷活化；加入待凈化液，棄去流出液；依次加入5 mL正己烷，5 mL 1%乙酸乙酯正己烷，棄去流出液；加入10 mL 30%乙酸乙酯正己烷，收集流出液；將洗脫液在40 ℃下減壓蒸餾近干，用乙腈溶液定容至1 mL，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后供HPLC分析。

1.2.3 提取溶劑的選擇：蘇丹紅為油溶性的物質(zhì)，食品中蘇丹紅染料檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道中提取溶劑通常有乙腈、丙酮和正己烷等。本研究分別選用了乙腈、正己烷、三氯甲烷、乙腈-三氯甲烷(v/v=3:1)4種提取溶劑對(duì)番茄醬中的蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，乙腈-三氯甲烷(v/v=3:1)的提取效率最高。

1.2.4 凈化方法的選擇：國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道蘇丹紅染料前處理有直接過(guò)濾膜上機(jī)，凝膠滲透色譜(GPC)[7]，中性氧化鋁固相萃取小柱[8]等。直接過(guò)濾膜上機(jī)，前處理方法簡(jiǎn)單，但由于番茄醬中基質(zhì)復(fù)雜，提取后仍存在大量干擾物質(zhì)，影響色譜柱壽命。凝膠滲透色譜(GPC)凈化，凈化效果好，樣品潔凈無(wú)雜峰干擾，但GPC價(jià)格昂貴又需要專人維護(hù)，不易普及。中性氧化鋁固相萃取柱回收率平行結(jié)果偏差大。迪馬ProElut SDH固相萃取柱(6mL)，可保持高保留性能和重現(xiàn)性，各組分的吸附、洗脫、回收均較為理想。

1.2.5 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限：取4種蘇丹紅染料標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，峰面積取平均值。得到標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X與峰面積Y之間的工作曲線。

1.2.6 精密度與加標(biāo)回收率：在番茄醬中添加高、中、低3個(gè)濃度，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率和精密度(RSD)。

1.2.7 樣品檢測(cè)：對(duì)番茄醬樣品進(jìn)行檢測(cè)得到加標(biāo)色譜圖，與蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖比較。

2 結(jié)果

2.1 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限 4種蘇丹紅染料的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X與峰面積Y之間的工作曲線，相關(guān)系數(shù)都在0.999以上。按本方法測(cè)定結(jié)果，以3倍信噪比(S/N)確定分析物的檢出限，10倍信噪比(S/N)為定量限?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)以及定量的限詳見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

2.2 精密度與加標(biāo)回收率 平均加標(biāo)回收率和精密度(RSD)，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，4種蘇丹紅染料添加回收率在83.4～94.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%～5.4%。說(shuō)明該方法具有較好的精密度和回收率，可以滿足痕量分析要求。

表2 番茄醬中蘇丹紅的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Tab.2 The recovery and precision of tonyred in ketchup(n=6)

2.3 樣品檢測(cè)結(jié)果 對(duì)番茄醬樣品進(jìn)行檢測(cè)，未檢出陽(yáng)性樣品。圖1給出其中一份蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖1和該樣品的加標(biāo)色譜圖2。

圖1 蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 The standard chromatogram of tonyred

圖2 番茄醬中蘇丹紅加標(biāo)色譜圖Fig.2 The chromatogram of sample-adding tonyred in ketchup

3 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化提取溶劑、樣品凈化等前處理建立了高效液相色譜，同時(shí)測(cè)定番茄醬中4種蘇丹紅染料的殘留量。本文建立了固相萃取-反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定番茄醬中蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ，其靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度都可達(dá)到要求，可作為常規(guī)分析的檢測(cè)方法。

[1] 李勇競(jìng).高效液相色譜法快速測(cè)定辣椒醬中的蘇丹紅[J].安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(5)：354-356.

[2] 曹起靈，李銳，方忠意，等.超高效液相色譜法測(cè)定飼料中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的含量[J].飼料工業(yè)，2008，29(12)：61-62.

[3] GB/T 19681—2005.食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法 高效液相色譜法[S].

[4] 周建科, 劉瑞英, 李曉陽(yáng). 山楂飴中蘇丹紅的高效液相色譜法測(cè)定[J] .現(xiàn)代食品科技,2009, 25(2):208-210.

[5] 林佶，萬(wàn)玉萍，沈其萍，等．GC/MS定性定量分析食品中的蘇丹紅Ⅰ號(hào)[J]．職業(yè)與健康，2006，22(22):45-46.

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[7] 宋歡，連庚寅，杜麗君，等.凝膠滲透色譜-液相色譜法測(cè)定辣椒及其制品中的對(duì)位紅和蘇丹紅[J].食品科學(xué)，2006，27(12)：611-613.

[8] 王明月，桂衛(wèi)星，袁宏球，等.HPLC法測(cè)定咸蛋、皮蛋黃中的四種蘇丹紅染料[J].食品科學(xué)，2009,30(2)：193-195.

(編校：王儼儼)

SimultaneousdeterminationoffourkindsoftonyredinketchupbySPE-HPLC

CHEN BoΔ
(Department of Laboratory, Beilun Ningbo District Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315800,China)

ObjectiveTo establish simultaneous determination of tonyred Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ in ketchup by solid phase extraction-high performance liquid chromatography (SPE-HPLC).MethodsSamples were extracted by solvent of acetonitrile:trichloromethane (v/v) =3:1, and purified by ProElut SDH. The acetonitrile and 0.2% phosphoric acid solution as the mobile phase with gradient elution separation, the detection wavelength was 500nm, quantified by external standard method.ResultsTonyred I, II, III, IV recoveries in 0.1-20 g/mL concentrations ranged at the rate of 83.4%-94.6%, the relative standard deviation (RSD) ranged from 2.9% to 5.4%, showed a good linear range of 0.1-20.0 in mg/L, the regression coefficient was greater than 0.999, the limit of detection (LOD) respectively as tonyred I 4 μg/kg, tonyred II 8 μg/kg, 4 μg/kg tonyred tonyred III, IV 5 μg/kg.ConclusionThe method is simple, sensitive, reproducible, can meet the tonyred I, II, III, IV requires detection of residues.

high performance liquid chromatography; solid phase extraction; ketchup; tonyred dye

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.045

陳波，通信作者，女，本科，研究方向：檢驗(yàn)，E-mail：chenbozj1979@163.com。

TQ617.1；R155.5+1

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