復方黃芪養(yǎng)心合劑對缺血性心律失常大鼠心肌細胞縫隙連接蛋白Cx43磷酸化和去磷酸化的影響

祝丹，陳啟蘭，祝光禮，赫小龍

(浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院/杭州市中醫(yī)院 心血管病科，浙江 杭州 310007)

復方黃芪養(yǎng)心合劑對缺血性心律失常大鼠心肌細胞縫隙連接蛋白Cx43磷酸化和去磷酸化的影響

祝丹，陳啟蘭Δ，祝光禮，赫小龍

(浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院/杭州市中醫(yī)院 心血管病科，浙江 杭州 310007)

目的觀察預防性應用復方黃芪養(yǎng)心合劑(compound huangqi yangxin mixture，CAMNH)對缺血性心律失常大鼠心肌細胞縫隙連接蛋白(connexin，Cx)Cx43磷酸化(P-Cx43)和去磷酸化(NP-Cx43)的影響及是否存在量效關系。方法將60只雄性SD大鼠隨機分成西藥組(A組)、復方黃芪養(yǎng)心合劑小劑量組(B組)、復方黃芪養(yǎng)心合劑中劑量組(C組)、復方黃芪養(yǎng)心合劑大劑量組(D組)、模型組(E組)、假手術組(F組)。用復方黃芪養(yǎng)心合劑大(28 g/kg·d)、中(14 g/kg·d)、小(7 g/kg·d)劑量灌胃、西藥組用琥珀酸美托洛爾(9.5 mg/kg·d)灌胃、模型組和假手術組用生理鹽水(7 g/kg·d),灌胃2 w。2 w后結扎冠狀動脈左前降支建立大鼠急性缺血性心律失常模型，觀察缺血30 min之內心律失常情況。30 min后處死大鼠，取心臟標本，采用免疫印跡法(Western blot法)分析比較P-Cx43、NP-Cx43的變化。結果Western blot法研究發(fā)現西藥組、復方黃芪養(yǎng)心合劑小、中、大劑量組NP-Cx43濃度增加小于模型組和假手術組，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；西藥組、復方黃芪養(yǎng)心合劑小、中、大劑量組P-Cx43濃度增加大于模型組和假手術組，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且NP-Cx43、P-Cx43在復方黃芪養(yǎng)心合劑大劑量組與西藥組表達結果相似。結論復方黃芪養(yǎng)心合劑具有抗缺血性心律失常作用，且其抗心律失?？赡芘c其減少縫隙蛋白Cx43的去磷酸化、增加磷酸化表達有關，同時復方黃芪養(yǎng)心合劑的劑量與其減少縫隙連接蛋白Cx43的去磷酸化，增加磷酸化的表達存在一定相關性。

大鼠；Cx43；復方黃芪養(yǎng)心合劑；缺血性心律失常；美托洛爾

缺血性心臟病主要是指由于心臟的血液灌注減少，引起血液對心臟的供氧減少，導致心肌及其細胞的能量代謝發(fā)生異常，從而心臟不能維持其正常工作的一種病理狀態(tài)[1]。心肌缺血產生的最直接后果是心功能下降，而對于有基礎性心臟病如冠心病的患者則會引起心絞痛、心律失常。無論何種類型的心肌缺血，往往會引發(fā)心律失常，其中80%及以上為室性心律失常[2]。室性心律失常中室速、室顫引起死亡的風險極高。據不完全統(tǒng)計，急性心?；颊咧杏?0%以上死于致命性的室性心律失常。心肌缺血是一種與年齡相關的多因素綜合作用的進展性疾病，因此明確缺血性心律失常的發(fā)生機制，尋找防治方法是當前急需解決難題之一。復方黃芪養(yǎng)心合劑(CAMNH)為本院院內制劑(浙藥制字Z20100032)，在臨床治療中觀察到其具有一定的抗心律失常作用?，F為CAMNH更好的運用于臨床，進一步探求其抗心律失常的作用機制，對其與心律失常相關機制Cx43作研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016]，體重180～200 g，清潔級，無人畜共患疾病。

1.1.2 藥品與試劑：①中藥：復方黃芪養(yǎng)心合劑(黃芪20 g、黨參20 g、太子參20 g、苦參20 g、甘松20 g、炙甘草10 g、生山楂15 g，由杭州市中醫(yī)院中藥房提供)；②西藥：琥珀酸美托洛爾(阿斯利康制藥有限公司，生產批號：1312028，47.5 mg/7片·盒)，戊巴比妥鈉(達文生物科技有限公司,批號:WS20080118，25 g/瓶)；③氯化鈉溶液(杭州市中醫(yī)院，500 mL/瓶)

1.1.3 DH-150動物呼吸機(浙江大學醫(yī)學儀器廠，DH150),Medlab-U/4CS生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司，Medlab-U/4CS),低溫冰箱(日本SANYA公司，MDF-U5411)。手術材料：眼科剪、手術剪、血管鉗、持針器、組織鑷、凍存管、刀片、生化管等。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組給藥方法：將60只SD雄性大鼠按隨機數字表法均分為西藥組(A組)、復方黃芪養(yǎng)心合劑小劑量組(B組)、復方黃芪養(yǎng)心合劑中劑量組(C組)、復方黃芪養(yǎng)心合劑大劑量組(D組)、模型組(E組)、假手術組(F組)，每組10只。給藥劑量：A組給予琥珀酸美托洛爾9.5 mg(kg·d)灌胃， B組給予復方黃芪養(yǎng)心合劑7 g(kg·d)灌胃，C組給予復方黃芪養(yǎng)心合劑14 g(kg·d)灌胃，D組給予復方黃芪養(yǎng)心合劑28 g(kg·d)灌胃，E組給予氯化鈉溶液7 g(kg·d)灌胃，F組給予氯化鈉溶液7 g(kg·d)。灌胃干預時間為2 w。

1.2.2 SD大鼠缺血性心律失常模型的制作：造模方法：冠狀動脈左前降支高位結扎法[3]，具體操作方法如下：大鼠稱重，麻醉，固定，消毒，分離頸部筋膜及肌肉，暴露氣管，將動物呼吸機插管插入氣管內，固定，動物呼吸機選擇潮氣量3 mL/100 g，呼吸頻率60次/分，呼吸比2:1，見大鼠胸部隨呼吸機起伏，證明氣管插管成功。接入大鼠Ⅱ導聯(lián)心電圖，通過Medlab-E觀察大鼠心電圖，連續(xù)記錄。消毒胸部皮膚，逐層頓性分離淺深筋膜及肌肉，暴露第3～5肋骨并剪斷，用鑷子輕輕撕破心包，充分暴露心臟血管。用5-0的線在左心耳下的左冠狀動脈前降支根部下2～3 cm處結扎。結扎成功的標志為心電圖導聯(lián)上ST段抬高大于0.2 mv以上。結扎時間為30 min，之后，取下心臟標本。A、B、C、D、E組造模方法均同上，F組基本方法同上，但只穿線，不結扎。

1.2.3 Western blot測定大鼠心肌細胞膜P-Cx43、NP-Cx43蛋白的表達：①心肌組織蛋白提?。喝∽笮氖倚募〗M織1000 mg+1000 μL RIPA裂解液，放入組織玻璃勻漿器勻漿離心。取上清液加入EP管保存；②BCA法測蛋白濃度：操作方法見試劑盒說明書；③制膠：10%分離膠(20 mL)，5%濃縮膠(6 mL)④加樣及電泳：將預先準備好的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中。用不同電壓跑膠，待溴酚藍到達分離膠底部，電泳結束；⑤轉膜：用甲醇激活PVDF膜后，在轉膜液中組裝“三明治”(膠、PVDF膜、濾紙3層、襯墊)后，用150 mA恒流電轉膜1.5 h；⑥一抗孵育：將膜加入15～20 mL一抗稀釋液，水平搖床上3檔孵育過夜；⑦二抗孵育：二抗15～20 mL，水平搖床上3檔孵育1.5 h；⑧顯影：將ECL發(fā)光試劑按1:1配置，將混合液滴加如PVDF膜上，在膜上覆蓋保鮮膜，在暗室中，將膜及X膠片壓于暗匣中曝光。再將X膠片顯影，定影，晾干；⑨凝膠成像及定量測算：將晾干后的膠片在專用系統(tǒng)中拍照及測算。

2 結果

2.1 造模前，大鼠Ⅱ導聯(lián)心電圖示心率大多大于400次/分，P波、QRS波、T波顯示清晰。在冠狀動脈左前降支結扎后，可見Ⅱ導聯(lián)心電圖中R波振幅較前明顯抬高，而ST段抬高多大于0.2 mv或者以上，結扎時間30 min。觀察到心律失常(室上速、室速、室顫)開始時間、發(fā)生陣數藥物組均低于假手術組。

2.2 Western blot結果

2.2.1 蛋白定量(BCA法測定蛋白濃度)：R2=0.9954，代表蛋白濃度測試準確，蛋白濃度含量數據可靠。

2.2.2 Cx43(包括P-Cx43、NP-Cx43)蛋白條帶可在40-43kD附件出現一至多個特異性條帶，這可能和目的蛋白的質量和特異性有關。根據預染Marker提示P-Cx43、NP-Cx43的電泳條帶與理論值相符，一般為43 kD。選擇GAPDH(分子量為36 kD)作為內參。見圖1。

圖1 各組P-Cx43、NP-Cx43電泳結果Fig.1 P-Cx43,P-Cx43 electrophoresis bands in each group

P-Cx43：與F組比較，E組P-Cx43表達明顯減少(P<0.05)，A、B、C、D組P-Cx43表達也減少(P<0.05)，各組P-Cx43表達減少的程度比E組少(P

表1 心肌細胞P-CX43在各組的磷酸化水平Tab.1 P-CX43 phosphorylation in cardiomyocytes in each group (±s)

*P<0.05,與E組、F組比較，compared with group E and group F

NP-Cx43：與F組比較，E組NP-Cx43表達明顯增加(P<0.05)，A、B、C、D組NP-Cx43表達也增加(P<0.05)，各組NP-Cx43表達增加的程度比E組少(P<0.05)，D組NP-Cx43表達增加的程度與A組接近(P<0.05)，比B、C組NP-Cx43表達增加少(P<0.05)，且B組NP-Cx43表達增加比C組少(P<0.05)。見表2。

表2 心肌細胞NP-CX43在各組的去磷酸化水平Tab.2 The levels of NP-CX43 dephosphorylation in myocytes in each group (±s)

*P<0.05,與E組、F組比較，compared with group E and group F

3 討論

MSSRT是一種β受體阻斷劑，是目前臨床上最常用的抗心律失常藥物之一[4]?，F代藥理研究表明，它能阻滯交感神經系統(tǒng)與RAS系統(tǒng)，從而降低心律，減少心肌氧耗[5]。缺血性心律失常的發(fā)生正是由于心肌缺血時，引起心肌能量代謝發(fā)生變化，心肌氧耗增加有關。

中醫(yī)中并無心律失常的說法，因心律失常多表現為“心動悸、脈結代”，故心律失常在中醫(yī)中歸于“心悸”范疇。其病位在心，與其他臟腑之病均有一定相關性。多屬本虛標實，虛實夾雜之證。

復方黃芪養(yǎng)心合劑作為本院院內制劑多年，在前期臨床觀察中，我們發(fā)現該方能明顯改善患者臨床癥狀，減慢心率，且無明顯的不良反應；而在進行該方抗缺血再灌注損傷的實驗研究[6]中我們發(fā)現，復方黃芪養(yǎng)心合劑組在缺血30 min時其心律失常發(fā)生率明顯低于其他組，它能降低患者循環(huán)容量水平，同時有改善慢性心衰血流動力學指標及保護心臟的作用。復方黃芪養(yǎng)心合劑其藥物組成：黃芪20 g、黨參20 g、太子參20 g、苦參20 g、甘松20 g、炙甘草10 g、生山楂15 g。方中黃芪、黨參、太子參共同起到補益心氣；苦參清心經之火；山楂活血祛瘀；甘松理氣；炙甘草調和諸藥。全方配伍共奏益氣活血，祛瘀清心之功效。

縫隙連接(gap junction GJ)是由連接相鄰兩個細胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結構。GJ主要功能：①電偶聯(lián)作用。②細胞間離子、 營養(yǎng)物質和液體的迅速交換。③在胚胎的形成、生長和發(fā)育過程中調控細胞間信號的傳遞。④調控細胞的生長和分化。⑤提高細胞對激素的應答。哺乳動物心臟中，心肌細胞間GJ通道主要由3種GJ連接蛋白構成，其分別是Cx40、Cx43、Cx45。而在心室肌中則以Cx43為主[7-12]。

在心肌缺血發(fā)生時，心肌中的Cx43大量降解，它是最易降解的結構蛋白之一。伴隨著Cx43大量降解，引起其分布模式的改變，從而導致心肌細胞間失電耦聯(lián)，減慢傳導速度，發(fā)生傳導異性。而這一系列改變的最終結果是傳導阻滯和折返性傳導，這往往誘發(fā)心律失常[13]。因此，我們可以說Cx43的降解和分布模式改變是心肌急性缺血后心肌在分子水平上發(fā)生的最初重構，也是心肌細胞間失電耦聯(lián)和心律失常的解剖學基礎。

大多數的連接蛋白歸類于磷蛋白，但是每個連接蛋白所處的磷酸化水平是不同的。蛋白轉錄過程中磷酸化是一種最為普遍的修飾。磷酸化調控著細胞信號的轉導過程，主要通過蛋白激酶 (protein kinases，PKS)和蛋白磷酸化酶(protein phosphatases ，PPS)的作用，來控制細胞的內過程。Cx43的主要功能部分為羧基端，而羧基端的部分絲氨酸和蘇氨酸殘基可以發(fā)生磷酸化，其發(fā)生磷酸化后可以影響Cx43在細胞膜中作用，如組裝、降解及傳導?？梢哉f磷酸化是其發(fā)揮正常的生物學功能的重要步驟。

Hung等[14]對犬發(fā)生急性心肌缺血后的Cx43進行了研究，發(fā)現發(fā)生急性心肌缺血時，閏盤處Cx43幾乎全部消失，而在細胞側對側處，仍有少許Cx43存在。閨純英等[15]認為犬急性缺血后閏盤處Cx43明顯減少，但分布模式并沒有發(fā)生明顯的改變，這可能與研究方法有一定的關系。章詩偉等[16]認為，由于急性心肌缺血所導致的心源性猝死者中，其左側心室的心肌細胞閏盤處的Cx43發(fā)生去磷酸化的比例大大增加。這些結果均告訴我們一個事實，就是一旦發(fā)生急性心肌缺血時，心肌細胞中閏盤處Cx43的含量、分布均可能已經發(fā)生了改變。由此我們可以推測心肌閏盤處可能是發(fā)生急性缺血時最先出現細胞間失耦聯(lián)的地方，也很可能是心律失常的起源部位。

Cx43的磷酸化主要發(fā)生在轉運到細胞膜之前，發(fā)揮作用的主要是絲氨酸的部分殘基；少部分的磷酸化也可以發(fā)生在其到達細胞膜之后。由于磷酸化的程度不同，Cx43在SDS-PAGE電泳凝膠上就可以多個條區(qū)帶，其分子量主要分布在40～47kDa[17-18]。

實驗結果及分析：據Western blot法結果，大鼠心肌缺血區(qū)磷酸化P-Cx43表達減少，去磷酸化NP-Cx43表達增加，心律失常發(fā)生率增加。但預防性運用復方黃芪養(yǎng)心合劑后Cx43的磷酸化較E、F組增加，去磷酸化較E、F組減少，同時復方黃芪養(yǎng)心合劑藥物劑量與其Cx43表達磷酸化及去磷酸化有一定關系，劑量越大去磷酸化表達越少。從而證實了復方黃芪養(yǎng)心合劑抗心律失常作用與藥物劑量有關，劑量大抗心律失常作用強。

綜上所述，復方黃芪養(yǎng)心合劑能保護因缺血造成的心律失常，其抗心律失常作用可能與其調節(jié)Cx43結構穩(wěn)定性有關，復方黃芪養(yǎng)心合劑能維持缺血區(qū)Cx43磷酸化，減少去磷酸化，且與使用劑量有關。

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(編校：苗加會)

EffectsofcompoundHuangqiYangxinmixtureonphosphorylationanddephosphorylationofconnexinCx43inischemicarrhythmiarats

ZHU Dan, CHEN Qi-lanΔ, ZHU Guang-li, HAO Xiao-long
(Cardiovascular Disease Department,Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University/Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310007, China)

ObjectiveTo study the impact of prevention use of compound astragalus membranaceus yangxin mixture(CAMNH)on normal SD male rat as well as the impact on phosphorylation and dephosphorglation of myocardial cells gap junction protein (Connexin, Cx) Cx43，and whether it has dosage relation with phosphorylation (P-Cx43) and dephosphorylation (NP-Cx43) expression of gap junction protein Cx43.MethodsRandomly allocate 60 male SD rats into western medicine group (Group A)，low dose of CAMNH group (Group B)，medial-dose CAMNH group (Group C)，high dose CAMNH group (Group D)，model group (Group E)，and sham operation group (Group F).Conduct intragastric administration to rat with high large dose(28 g/kg·d), medial dose(14 g/kg·d) and low dose(7 g/kg·d) of CAMNH；the western medicine group(9.5 mg/kg·d) conduct intragastric administration with metoprolol, model group and sham operation group(7 g/kg·d) conduct intragastric administration with Saline, all for two weeks’ intervention.Ordinary condition of rats to be observed during the time.Conduct Left anterior descending coronary artery after two weeks and build up model of rats’acute ischemic arrhythmias, and observe the arrhythmia and ordinary condition of the rats in 30 mins Ischemia.Kill the rats after 30 mins, take heart sample, analyze after test of Cx43 by westrn blot.ResultsWestern blot found out that the level increase of P-Cx43 of western medicine group, low dose, medial dose and large dose of CAMNH were less than model group and sham operation group, and there was statistically significant difference between the groups(P<0.05).In addition, the high dose CAMNH group achieved similar expression result of NP-Cx43, P-Cx43 as western medicine group, and there was statistically significant difference between the groups.ConclusionThe prevention use of CAMNH can resist ischemic arrhythmia.CAMNH’s antiarrhythmic effect is related with its decrease of the dephosphorylation of gap junction as well as increase of phosphorylation, and there is dose-effect in between.

rats; Cx43; CAMNH; ischemic arrhythmia; metoprolol

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.008

浙江省中西醫(yī)結合學會(2012LY007)

祝丹，女，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥對心血管疾病的防治，E-mail：382436681@qq.com；陳啟蘭，通信作者，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥對心血管疾病的防治，E-mail：cql13588750941@qq.com。

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