硫化氫對噻環(huán)乙胺麻醉及手術(shù)后老年大鼠的認(rèn)知能力影響

馬海鹍，郭　蔚，姜　勝，胡學(xué)遠(yuǎn)，張　帥，范宏剛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所，黑龍江 哈爾濱 150069）

硫化氫對噻環(huán)乙胺麻醉及手術(shù)后老年大鼠的認(rèn)知能力影響

馬海鹍1，郭蔚2，姜勝1，胡學(xué)遠(yuǎn)1，張帥1，范宏剛1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所，黑龍江 哈爾濱 150069）

多年來認(rèn)為麻醉藥的效應(yīng)隨其藥理作用消失而消失，一旦藥物消除，靶器官將恢復(fù)到以前的狀態(tài)。但越來越多的證據(jù)表明，使用麻醉藥后可出現(xiàn)長期甚至永久的神經(jīng)元和神經(jīng)系統(tǒng)的改變[1]。進入到老年的動物都是在全身麻醉下，特別是在吸入麻醉下進行手術(shù)，盡管目前不能提供確鑿的臨床資料證明全麻與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系，但許多臨床前試驗表明，老齡動物吸入揮發(fā)性麻醉劑后會引起數(shù)天乃至數(shù)周的認(rèn)知功能障礙[2]。近年來麻醉及術(shù)后認(rèn)知障礙逐漸成為臨床麻醉的研究熱點。硫化氫（H2S）作為一種新發(fā)現(xiàn)的氣體信號分子，具有明顯的抗氧化性，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有重要的調(diào)節(jié)和保護作用。本試驗通過觀察麻醉、手術(shù)對老年大鼠認(rèn)知功能的影響，并探索預(yù)先給予外源性H2S對麻醉及手術(shù)后老年大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。

1　材料與方法

1.1試驗動物120只24月齡雄性Wistar大鼠，購自長春市伊斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2試驗藥品噻環(huán)乙胺（購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，純度99.5%）；NaHS粉劑，美國Sig?ma-Aldrich公司，貨號161527，純度99.5%）。

1.3試驗儀器設(shè)備Morris水迷宮及其動物行為視頻分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）。

1.4方法

1.4.1試驗分組與麻醉120只老年大鼠于水迷宮訓(xùn)練5 d后隨機分成5組，分別為：對照組（C組，n=24）、麻醉組（M組，n=24）、手術(shù)組（S組，n= 24）、麻醉+NaHS干預(yù)組（N組，n=24；）和手術(shù)+ NaHS干預(yù)組（SN組，n=24；），各組又分別分成3個亞組：1 d組，3 d組，7 d組，每個亞組各8只老年大鼠。對照組：對老年大鼠腹腔注射0.1 mL/kg體重的生理鹽水。麻醉組：對老年大鼠腹腔注射0.1 mL/kg體重（60 mg/kg體重）的噻環(huán)乙胺。麻醉+手術(shù)組：麻醉誘導(dǎo)與維持同麻醉組。在其維持期間，手術(shù)組參照楊志勇[3]手術(shù)應(yīng)激模型對老年大鼠進行腹腔探查術(shù)，具體步驟：手術(shù)組大鼠在噻環(huán)乙胺麻醉后進行腹腔探查術(shù)。手術(shù)部位備皮、消毒，放置創(chuàng)巾；在腹中線部位沿劍狀突下做3 cm的切口；用止血鉗鈍性分離皮膚和腹膜，逐層打開腹腔；用組織鉗牽開腹腔（注意大鼠肌肉較嫩需墊上紗布），依次探查各臟器，注意探查順序：胃，肝臟，脾臟，小腸，大腸；縫合關(guān)閉傷口，肌肉層連續(xù)縫合，皮膚結(jié)節(jié)縫合；傷口處進行消毒，動物維持麻醉2 h。試驗過程中使用加熱墊以確保老年大鼠的體溫維持正常水平，術(shù)中水分的流失以溫生理鹽水補給，所有手術(shù)步驟均無菌操作。術(shù)后注意老年大鼠傷口消毒，待大鼠自然蘇醒后放回籠子各自飼養(yǎng)。麻醉+NaHS干預(yù)組：麻醉方法同麻醉組，但是試驗的第3天開始腹腔給予外源性硫氫化鈉供體（NaHS），劑量為3 mg/kg體重，連續(xù)7 d給藥包括麻醉前3 d，當(dāng)天及麻醉后3 d。手術(shù)+NaHS干預(yù)組：大鼠的處理方法同麻醉+手術(shù)組，第3天開始腹腔給予外源性硫氫化鈉供體（劑量3 mg/kg體重），連續(xù)7 d給藥包括手術(shù)前3 d，當(dāng)天及手術(shù)后3 d。其他各組分別腹腔注射等量的生理鹽水，時間與給NaHS的時間一致。試驗期間對老年大鼠的狀態(tài)及生命體征進行實時監(jiān)測。

1.4.2Morris水迷宮測試試驗Morris水迷宮認(rèn)知功能測試，主要包括兩方面：定位航行和空間探索。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用Microsoft Excel 2003對試驗數(shù)據(jù)進行整理，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± SD）表示。采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1麻醉及手術(shù)中老年大鼠體征表現(xiàn)在噻環(huán)乙胺麻醉和手術(shù)過程中，大鼠可視黏膜和外露皮膚顏色紅潤，體溫下降平緩，呼吸平穩(wěn)，血氧飽和度維持在93%～95%之間，血壓維持在正常范圍內(nèi)。各組大鼠均未發(fā)生明顯缺氧、低血壓及呼吸抑制現(xiàn)象。

2.2Morris水迷宮測試?yán)夏甏笫笳J(rèn)知功能結(jié)果

（1）老年大鼠定位航行訓(xùn)練結(jié)果：從試驗結(jié)果中可看出，隨著訓(xùn)練次數(shù)不斷增多，大鼠由第1天大都沿池壁游行到第5天可以很快的找到平臺，與第1天相比，各組大鼠在第3、4、5天逃避潛伏期明顯縮短，差異極顯著（P<0.01）。試驗數(shù)據(jù)顯示，大鼠對平臺已形成了記憶，可以進行后續(xù)的試驗（表1）。

表1　試驗前5 d各組平均逃避潛伏期時間?。╪=8，S，±S）

表1　試驗前5 d各組平均逃避潛伏期時間?。╪=8，S，±S）

注：與第1天相比，*：P<0.01，#：P<0.05

第1天　第2天　第3天　第4天　第5天C　52.63±18.31　46.18±12.14　34.51±16.97　32.73±7.15*　24.26±2.35*M1　55.94±14.30　47.21±14.82　37.55±9.49*　35.50±5.70*　24.41±2.86*M3　57.14±15.91　47.02±15.42　33.13±13.13　30.52±17.74*　22.02±1.02*M7　52.59±11.27　44.16±13.01　35.47±6.71*　32.13±9.12*　23.18±3.36*S1　49.09±10.77　43.18±12.72　34.43±13.12*　29.63±4.98*　24.45±1.72*S3　57.23±22.78　47.07±21.88　37.02±7.88*　34.02±5.36*　21.23±3.37*S7　52.15±12.13　47.01±11.67　34.60±6.99*　32.16±7.02*　25.93±1.08*MN1　50.62±12.54　45.76±18.19　32.13±5.43*　30.90±12.55*　25.43±4.29*MN3　51.53±13.41　46.56±13.42　34.70±9.76*　31.82±2.76*　22.55±1.18*MN7　53.14±12.84　46.10±12.54　35.87±13.08*　31.14±6.11*　24.49±6.32*SN1　53.24±13.37　47.32±15.90　29.16±5.84*　28.24±18.72*　25.74±0.75*SN3　50.29±11.42　45.71±10.41　30.02±5.86*　30.02±3.25*　24.84±2.05*SN7　53.43±12.63　47.42±17.82　34.36±7.40*　31.64±8.38*　24.17±3.18*

（2）Morris水迷宮試驗測試結(jié)果：試驗結(jié)果顯示，與C相比，在經(jīng)過麻醉、手術(shù)后，M組第1天、第3天老年大鼠逃避潛伏期均明顯增加，差異極顯著（P< 0.01），穿越平臺次數(shù)明顯減少，于第1天差異極顯著（P<0.01），第3天差異顯著（P<0.05）；S組第1天、第3天老年大鼠逃避潛伏期均明顯增加，穿越平臺的次數(shù)明顯減少，差異均極顯著（P<0.01）；到第7天的時候逐漸恢復(fù)（P>0.05），趨于正常水平。S組與M組相比，S組第1天逃避潛伏期明顯長于M組，差異極顯著（P<0.01），穿越平臺次數(shù)相對減少，但差異不顯著（P>0.05）；第3天與M組相比，逃避潛伏期有所延長，穿越平臺的次數(shù)相對減少，但差異均不顯著（P>0.05）。外源性硫氫化鈉（NaHS）干預(yù)后，MN組與M組相比、SN組與S組相比，各組的第1天、第3天組老年大鼠的潛伏期明顯縮短，穿越平臺的次數(shù)也明顯增加，差異均極顯著（P<0.01）。與C組相比，MN組、SN組各亞組的逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)均無顯著性差異（P>0.05）（表2、3）。

表2　試驗后各組大鼠的平均逃避潛伏期 （n=8，S，±S）

表2　試驗后各組大鼠的平均逃避潛伏期 （n=8，S，±S）

注：與C組相比，a：P<0.01，A：P<0.05；S組與M組相比，b：P< 0.01，B：P<0.05；MN組與M組相比，c：P<0.01，C：P<0.05；SN組與S組相比，d：P<0.01，D：P<0.05

1 d　3 d　7 d C　24.12±1.86　24.12±1.86　24.12±1.86 M　36.12±1.42a　30.74±0.92a　22.12±1.25 S　47.78±1.43ab　33.51±0.89a　24.15±1.06 MN　25.26±3.28c　23.21±0.84c　23.38±0.91 SN　24.23±2.37d　24.69±0.75d　24.22±0.87

表3　試驗后各組大鼠空間探索結(jié)果（n=8，次，±S）

表3　試驗后各組大鼠空間探索結(jié)果（n=8，次，±S）

1 d　3 d　7 d C　4.37±0.51　4.37±0.51　4.37±0.51 M　1.13±0.65a　2.03±0.51A　4.04±0.57 S　0.86±0.32a　1.52±0.35a　3.76±0.77 MN　4.07±0.44c　4.48±0.67c　3.57±0.78 SN　4.69±0.86d　4.35±0.84d　4.43±0.82

3　討論

Morris水迷宮試驗是測試認(rèn)知功能的經(jīng)典試驗之一，是公認(rèn)的評價嚙齒類動物認(rèn)知功能的重要試驗手段。主要有水池，平臺和攝像系統(tǒng)三部分組成，該試驗對環(huán)境的要求較高，需在安靜穩(wěn)定的環(huán)境中進行。水池，是一個直徑1.6 m，高0.5 m類似輪胎的圓柱型，分為I象限、II象限、III象限、IV象限4個象限。平臺，為一個直徑為12 cm，類似碗口大的透明圓盤，動物定位航行時平臺固定于某一象限中心，若進行空間探索則需撤去平臺。攝像系統(tǒng)，攝像系統(tǒng)在水池正上方，與電腦的系統(tǒng)相連，用以記錄試驗動物的軌跡及各試驗數(shù)據(jù)。另外，分別有不同顏色不同形狀的小木板作為參照物，懸掛于水池的吊簾上，以利于大鼠對平臺形成記憶。Morris水迷宮試驗主要包含定位航行和空間探索兩部分。定位航行時逃避潛伏期反應(yīng)了大鼠的學(xué)習(xí)能力，即逃避潛伏期越短，找到平臺的時間越短，大鼠越聰明，學(xué)習(xí)能力越強?？臻g探索時穿越平臺次數(shù)反應(yīng)了大鼠的記憶能力，穿越平臺區(qū)次數(shù)越多，說明大鼠記憶能力越好。

本試驗研究結(jié)果顯示，老年大鼠在第1天訓(xùn)練時，由于對周圍環(huán)境改變的恐慌，多數(shù)沿著池壁轉(zhuǎn)圈游行，以至于找不到平臺，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，大鼠逐漸對平臺形成記憶，最終都能找到平臺。從試驗結(jié)果中可看出，隨著訓(xùn)練次數(shù)不斷增多，大鼠由第1天沿池壁游行到第5天可以很快的找到平臺，逃避潛伏期逐漸縮短，說明大鼠已經(jīng)對平臺形成記憶，可以進行后續(xù)試驗。在大鼠經(jīng)過麻醉、手術(shù)后的1 d、3 d，老年大鼠逃避潛伏期均明顯增加，穿越平臺的次數(shù)也均明顯減少，到第7天的時候逐漸恢復(fù)，趨于正常水平。說明在麻醉、手術(shù)后的1、3 d老年大鼠發(fā)生了認(rèn)知障礙；并且S組的潛伏期比起M組明顯增加，說明手術(shù)較麻醉對機體認(rèn)知障礙影響大。丁力[4]等通過研究術(shù)后認(rèn)知障礙，發(fā)現(xiàn)術(shù)后老年大鼠發(fā)生了短暫的認(rèn)知功能障礙，在1、3 d時潛伏期明顯延長，而跨越原平臺次數(shù)明顯減少，第7天時恢復(fù)正常水平，與本試驗結(jié)果相符。在NaHS干預(yù)后可見，M組與MN組相比、S組與SN組相比，麻醉、手術(shù)的第1、3天老年大鼠的潛伏期明顯縮短，空間探索次數(shù)也明顯增加，說明大鼠對于平臺的記憶明顯增加，應(yīng)用外源性硫氫化鈉能夠緩解改善麻醉、手術(shù)引起的認(rèn)知功能障礙。秦偉[5]在大鼠跳臺試驗檢測時發(fā)現(xiàn)應(yīng)用NaHS能明顯減輕大鼠學(xué)習(xí)記憶的減退及神經(jīng)元的損傷；Jiang[6]發(fā)現(xiàn)腹腔注射NaHS能夠很好保護創(chuàng)傷性腦損傷，與本試驗結(jié)果相符。綜上，可知麻醉、手術(shù)第1天和第3天均會引起老年大鼠認(rèn)知功能的減退，而外源性硫氫化鈉能夠改善認(rèn)知的改變。

4　結(jié)論

應(yīng)用NaHS 3 mg/kg腹腔注射能夠?qū)Ξ惙崖樽砑笆中g(shù)引起的認(rèn)知功能障礙起到保護作用。

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S859.791文獻標(biāo)志碼：B

0529-6005（2016）07-0097-03

2015-04-29

國家自然科學(xué)基金項目（31001092）；黑龍江省博士后科研啟動金（LBH-Q14018）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“學(xué)術(shù)骨干”項目（15XG18）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科團隊建設(shè)項目基金資助（獸醫(yī)外科學(xué)團隊2014td05）

馬海鹍（1979-），男，實驗師，碩士，研究方向為動物麻醉與鎮(zhèn)痛，E-mail：12589452@qq.com

范宏剛，E-mail：fanhonggang2002@163.com