UNG酶在獸用生物制品支原體PCR檢測(cè)中防止假陽性的應(yīng)用

郭建華，李向碧，岳秀陽，曹　政

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460；2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 榮昌 402460）

UNG酶在獸用生物制品支原體PCR檢測(cè)中防止假陽性的應(yīng)用

郭建華1，李向碧2，岳秀陽2，曹政2

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460；2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 榮昌 402460）

為了研究尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）在減少獸用生物制品支原體PCR檢測(cè)中的假陽性情況，本研究通過在PCR試劑中加入U(xiǎn)NG酶，在PCR反應(yīng)前25℃作用10 min，再50℃作用2 min，結(jié)果顯示，該法可以有效防止PCR產(chǎn)物的污染，減少假陽性的產(chǎn)生。

UNG酶；獸用生物制品；PCR；假陽性

支原體是無細(xì)胞壁、必須細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞微生物，經(jīng)常見于生物制品的污染[1]?，F(xiàn)行的中國獸藥典中，對(duì)支原體的檢查規(guī)定用細(xì)胞培養(yǎng)法，在顯微鏡下看到支原體菌落作為判斷的依據(jù)，但檢查的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)29 d，所以常見于成品、血清的檢驗(yàn)，對(duì)半成品、原輔材料則用培養(yǎng)法檢驗(yàn)不能滿足需要，所以很多廠家采用更加快捷的PCR方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

PCR方法非常敏感，但在陰性對(duì)照甚至空白對(duì)照中會(huì)出現(xiàn)假陽性的情況，使實(shí)驗(yàn)者無法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）可以降解含有脫氧尿嘧啶核苷酸（dU）的雙鏈DNA或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵。如果在PCR反應(yīng)體系中以dUTP取代dTTP，使PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈，在PCR開始前增加50℃的保溫步驟，UNG酶即可將反應(yīng)體系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴(kuò)增，從而保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性，準(zhǔn)確性。同時(shí)UNG酶被滅活，不會(huì)再降解新擴(kuò)增的產(chǎn)物U-DNA。因此UNG酶廣泛用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，但在獸用生物制品中，還未見報(bào)道[2-3]。

本研究以豬瘟細(xì)胞苗產(chǎn)品、生產(chǎn)用牛睪丸細(xì)胞作為檢驗(yàn)對(duì)象，研究了UNG酶在獸用生物制品支原體PCR檢測(cè)中消除假陽性的作用。

1　材料與方法

1.1材料細(xì)胞源豬瘟活疫苗，重慶澳龍生物制品有限公司2014年生產(chǎn)，血清是內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司生產(chǎn)。

UNG酶、dUTP、Taq DNA聚合酶（5 units/μL）（附10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3）、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP均為10 mmol/L）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2 000、支原體核酸提取試劑盒等，購自上寶生物工程（大連）有限公司。

豬鼻支原體，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2方法

1.2.1引物的來源與合成擴(kuò)增用引物序列來自參考文獻(xiàn)[4-5]，正向引物序列為：5′-ACACCAT?GGGAGCTGGTAAT-3′，反向引物序列為：5′-CTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′，引物由Invitrogen（上海）合成。

1.2.2樣品的處理與DNA提取樣品的處理按照2010版《中國獸藥典》第3部進(jìn)行[6]：隨機(jī)取5瓶疫苗制品，分別用生理鹽水將凍干品復(fù)原到10頭份每mL，將5瓶稀釋液充分混勻制成混懸液，用來提取DNA。

1.2.3PCR反應(yīng)取1 μL制備的基因組DNA為模板（約50 ng），加入下面的PCR反應(yīng)體系中：50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris（pH值8.3），1.5 mmol/ L MgCl2，0.001%（wt/vol）gelatin，引物各為 0.6 μmol/L，dNTP各為200 μmol/L，Taq DNA酶1.5 U，UNG酶1U、dUTP600 μmol/L，共20 μL。反應(yīng)條件：25℃UNG酶處理2 min，95℃2 min使UNG酶失活，95℃預(yù)變性，5 min；95℃變性，1 min，57℃退火溫度下退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后在72℃下10 min延伸。擴(kuò)增完后，保存-20℃保存?zhèn)溆谩ｊ栃詫?duì)照組加豬鼻支原體DNA為模板，陰性對(duì)照組不加模板，以生理鹽水替代，不加UNG酶的試驗(yàn)組反應(yīng)體系中不加入U(xiǎn)NG酶和dUTP，25℃10 min和95℃2 min反應(yīng)步驟，其余不變。

1.2.4電泳檢測(cè)取PCR產(chǎn)物5 μL，在1.0%（w/ v）瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電場(chǎng)強(qiáng)度5 V/cm，時(shí)間50 min。

2　結(jié)果

2.1不加UNG酶的試驗(yàn)組PCR結(jié)果如圖1所示，陰性對(duì)照、血清樣品、豬瘟疫苗均出現(xiàn)與陽性對(duì)照相同的條帶（300 bp）。

圖1　不加UNG酶組PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2UNG酶添加組電泳結(jié)果如圖2所示，陰性對(duì)照、血清樣品、豬瘟疫苗均無特異條帶。

圖2　UNG酶添加組PCR產(chǎn)物電泳圖

3　討論

本試驗(yàn)中，在不加入U(xiǎn)NG酶時(shí)，陽性對(duì)照、樣品、陰性對(duì)照都有特異性條帶，甚至有時(shí)候換掉所有的試劑，仍然會(huì)出現(xiàn)同樣的結(jié)果。加了UNG酶后，樣品、陰性對(duì)照的特異性條帶消失了。為了驗(yàn)證PCR結(jié)果的可靠性，在本研究中，所有檢驗(yàn)樣本血清、豬瘟疫苗成品、陽性對(duì)照均按照中國獸藥典的方法進(jìn)行了培養(yǎng)法檢驗(yàn)，結(jié)果與加了UNG酶的結(jié)果一致。2014年本公司豬瘟疫苗成品中也未檢出支原體，對(duì)各批次成品、半成品的PCR檢驗(yàn)結(jié)果表明，加UNG酶后也不影響檢驗(yàn)的敏感性與特異性。

本研究的UNG酶可消除PCR產(chǎn)物污染。其造成PCR假陽性原因還有很多，要徹底根除PCR的假陽性。還需要嚴(yán)格操作和區(qū)分操作，如DNA提取區(qū)域、加PCR試劑區(qū)域、加模板區(qū)域、電泳區(qū)域，用的微量移液器也不能混用，另外套式PCR、Touchdown PCR等方法也能提高試驗(yàn)的特異性和重復(fù)性[7]，企業(yè)可以采用多種技術(shù)，指定操作規(guī)程，保證檢驗(yàn)的可靠性。

當(dāng)然，對(duì)生物制品的成品是否被支原體污染的檢驗(yàn)以及下最終的結(jié)論，還需要按照中國獸藥典的培養(yǎng)法來進(jìn)行。需要指出的是，對(duì)于被檢樣品被滅活的支原體，PCR仍然可以檢測(cè)出來，培養(yǎng)法卻檢測(cè)不出來。筆者建議用多種方法互相驗(yàn)證，確保產(chǎn)品的質(zhì)量，PCR檢驗(yàn)更用于牛睪丸、生產(chǎn)用細(xì)胞原輔材料以及中間品的快速檢驗(yàn)，培養(yǎng)法更多用于成品的檢驗(yàn)。

[1]Zhi Y，Mayhew A，Seng N，et al.Validation of a PCR method for the detection of mycoplasmas according to European Pharmaco?poeia section 2.6.7[J].Biologicals，2010，38：232-237.

[2]郭兆彪，張敏麗，汪曉輝，等.用尿嘧啶糖基化酶預(yù)防PCR污染的研究[J].中國獸醫(yī)科技，1999，29（3）：12-14.

[3]王省良，周東耀，王麗之，等.尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR產(chǎn)物污染及其對(duì)DNA雜交的影響[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，20（4）：319-321.

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[6]中國獸藥典委員會(huì).中國獸藥典（3部）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：附錄49.

[7]Joyce W M，熊祺琰，韋艷娜，等.套式PCR檢測(cè)中國江蘇省豬場(chǎng)豬鼻支原體和豬肺炎支原體的感染[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2014，30（8）：800-805.

Application of Uracil-N-glycosylaseto Avoid FalsePositivein theDetection of Mycoplasma Contaminatein Veterinary Biological Products

GUO Jian-hua1，LI Xiang-bi2，YUE Xiu-yang2，CAO Zheng2
（1.Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460，China；2.Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Chongqing 402460，China）

To investigate the method of avoidance of false positive in the detection of mycoplasma contaminate in veterinary bi?ological productions，Uracil-N-glycosylase was added to PCR reaction mix.And 25℃for 10 minutes and 50℃for 2 minutes were processed before PCR reaction.The results showed that uracil-N-glycosylase prevented the contamination of PCR products and re?duced the false positive efficiently.Uracil-N-glycosylase can avoid false positive in detection of mycoplasma contamination in vet?erinary biological production.

Uracil-N-glycosylase；Biological products；PCR；False positive

CAO Zheng

TQ464.8

A

0529-6005（2016）07-0083-02

2015-03-25

西南大學(xué)科研基金資助（08BSr04）

郭建華（1977-），男，副教授，博士，從事微生物資源開發(fā)與分子生物學(xué)研究工作，E-mail：guo0619@swu.edu.cn

曹政，E-mail：maodenghu@163.com