鑒別豬偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立

趙　麗，盧婷婷，李存法，陳忠杰，連瑞麗

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450011）

鑒別豬偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立

趙麗，盧婷婷，李存法，陳忠杰，連瑞麗

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450011）

依據(jù)基因庫(kù)中的豬偽狂犬病病毒（PRV）基因序列，分別設(shè)計(jì)了gE和gH兩對(duì)引物，以PRV閩A株、Bartha （gE-）株和Norden（Tk-）株為模板，篩選最佳反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)豬偽狂犬病病毒野毒株與疫苗毒株的鑒別PCR方法。該方法能從PRV閩A株、Norden（Tk-）株中擴(kuò)增出一條355 bp的條帶，但Bartha（gE-）株沒(méi)有擴(kuò)增出該目的條帶。對(duì)正常細(xì)胞、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，沒(méi)有出現(xiàn)交叉反應(yīng)。在對(duì)單項(xiàng)PCR反應(yīng)條件（引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度等）優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了鑒別豬偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒的雙重PCR檢測(cè)方法，并分別用雙重PCR和單項(xiàng)PCR檢測(cè)15份臨床病料，兩者符合率為97.5%，表明該雙重PCR檢測(cè)方法有較高的敏感度，可以用于臨床病料的檢測(cè)。

雙重PCR；偽狂犬病病毒；野毒和疫苗毒；鑒別診斷

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是多種家畜和野生動(dòng)物均可感染的一種皰疹病毒，常引起母豬出現(xiàn)繁殖障礙及初生仔豬大批死亡，成年豬則長(zhǎng)期帶毒排毒，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年養(yǎng)殖場(chǎng)豬偽狂犬病又有上升趨勢(shì)，控制和消滅偽狂犬病所面臨的主要困難是確定偽狂犬病病毒的潛伏感染、野毒感染或疫苗感染，豬在初次感染康復(fù)后往往長(zhǎng)期帶毒，當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)外因素刺激時(shí)，病毒被激活并持續(xù)排毒[1-4]，引起疫病的擴(kuò)散。疫苗免疫接種和疾病的早期鑒別診斷是有效防制和根除偽狂犬病的根本措施。目前常用的方法就是PCR擴(kuò)增，快速、特異，因此，有必要建立一種快速、早期并能同時(shí)確定是疫苗株感染還是野毒株感染的雙重PCR檢測(cè)方法[5-7]。

gH基因是偽狂犬病病毒中較保守和病毒復(fù)制所必需的基因；gE基因是偽狂犬病病毒的毒力基因也是常用的基因缺失疫苗的缺失基因。以gH、gE基因序列作為靶序列建立的PCR技術(shù)，能夠區(qū)分基因缺失疫苗接種與野毒感染[6]。因此本研究根據(jù)豬偽狂犬病病毒gH、gE基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，建立了鑒別豬偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒的雙重PCR方法。

1　材料與方法

1.1毒株與菌種PRV閩A（Fa）株、Norden（Tk-）株和Bartha（gE-）株、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細(xì)小病毒（PPV），由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；PRVg基因E缺失疫苗，購(gòu)自武漢科前生物制品有限公司。工程菌JM109感受態(tài)細(xì)胞為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；病料采自河南周邊豬場(chǎng)。

1.2質(zhì)粒工具酶及其他化學(xué)試劑EX TaqDNA聚合酶為北京康為生物工程有限公司產(chǎn)品；異硫氰酸胍（GuSCN）、重蒸飽和酚、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、2.5 mmol/L dNTP；2 000 bp DNA lad?der、200 bp DNA ladder、DNA凝膠回收試劑盒、溴化已錠（EB）、溴酚蘭等均為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖（Agarose）：Promega公司產(chǎn)品。

1.3主要儀器CO2培養(yǎng)箱、PCR儀、紫外微量分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)Thermo Forma公司；DYY-III-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀、電泳槽：北京六一儀器廠；超速冷凍離心機(jī)：SIGMA公司；紫外凝膠成像系統(tǒng)：Alpha Innotech公司。

1.4方法

1.4.1引物的設(shè)計(jì)與合成利用DNAStar（Ver?sion5.0）軟件進(jìn)行同源性分析，應(yīng)用Primer Pre?mier5.0軟件設(shè)計(jì)出擴(kuò)增gH基因355 bp和gE基因139 bp的幾對(duì)特異引物

gH：上游引物（P1）：5′-ACGGAAGTTATA?AGGATGA-3′；

下游引物（P2）：5′-TGTCTCCGAAGAAATAA?GA-3′；

gE：上游引物（P3）：5′-ACGGAAGTTATA?AGGATGA-3′；

下游引物（P4）：5′-TGTCTCCGAAGAAATAA?GA-3′。

兩對(duì)引物均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.4.2PRV病毒培養(yǎng)及模板DNA的制備用PK15細(xì)胞培養(yǎng)偽狂犬病病毒株，在細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，置-20℃保存?zhèn)溆?。病毒DNA及臨床樣品模板DNA制備參照[8]。

1.4.3偽狂犬病病毒gH、gE基因單一PCR檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化

1.4.3.1偽狂犬病病毒gH、gE基因PCR檢測(cè)方法的建立按如下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

反應(yīng)條件94℃變性3 min后，進(jìn)人循環(huán)94℃30 s，56℃（gH）和54℃（gE）30 s，72℃30 s，25個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4.3.2gH、gE基因單一PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)gH、gE基因單一PCR反應(yīng)參數(shù)包括引物、Taq酶、dNTPs、Mg2+濃度及退火溫度、時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，建立兩種基因的單聯(lián)PCR最佳反應(yīng)體系。

1.4.4單一PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)分別提取PRV Fa株、Bartha（gE-）株和Norden（Tk-）株、PRV gE基因缺失疫苗和PPV、PCV等病毒DNA，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并設(shè)立陰性對(duì)照，以檢測(cè)該單一PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.4.5單一PCR檢測(cè)方法的敏感性測(cè)定提取PRV Fa毒株DNA，測(cè)定其含量后，將其核酸依次作10倍的梯度稀釋?zhuān)捎眉簝?yōu)化好的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)其敏感性。

1.4.6gH、gE基因雙重PCR檢測(cè)方法的建立在50 μL體系中加入以下成份：

瞬時(shí)離心后于PCR儀上94℃預(yù)變性5 min后，94℃30 s；56℃30 s；72℃1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。同時(shí)設(shè)立無(wú)模板的陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）進(jìn)行電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.4.6.1雙重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化（1）雙重PCR的引物濃度的優(yōu)化：gH、gE基因分別以50 pmol/μL的引物濃度0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、1 μL進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，以選取兩種病毒的最佳引物濃度；（2）雙重PCR的退火溫度的優(yōu)化：gH、gE基因分別以52℃、54℃、56℃、58℃的退火溫度進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，以確定最佳的退火溫度；（3）雙重PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)：分別提取PRV Fa株、Bartha（gE-）株和Norden（Tk-）株的DNA，加入己優(yōu)化好的雙重PCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增，并以PPV、PCV及正常PK15細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以檢測(cè)該雙重PCR檢測(cè)方法的特異性；（4）雙重PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)：參照[8]，超速離心純化PRV Fa株病毒及gH、gE基因的DNA，10倍的梯度稀釋并測(cè)定其病毒滴度，采用己優(yōu)化好的雙重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)其敏感性。

1.4.6.2對(duì)病料進(jìn)行復(fù)合PCR檢測(cè)對(duì)采自河南不同地區(qū)的豬偽狂犬病疑似病料進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1單一PCR優(yōu)化檢測(cè)方法的擴(kuò)增結(jié)果提取PRV Fa的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株DNA，進(jìn)行單一的PCR優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)。其電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增出一條約355 bp和139 bp目的DNA片段，與預(yù)期大小相當(dāng)（圖1、圖2），PCR產(chǎn)物純化回收后測(cè)序表明，所擴(kuò)增序與參照的PRV核酸序列同源性為100%，證明PCR產(chǎn)物為預(yù)期擴(kuò)增的目的DNA片段。

2.2單一PCR檢測(cè)方法的特異性分析用gH、gE基因特異性的引物分別對(duì)PRV Fa株、Bartha株、Norden株進(jìn)行擴(kuò)增，并將豬常見(jiàn)的繁殖障礙性疾病病原PPV、PCV和正常PK15細(xì)胞作為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3、圖4。

圖1　PRVgH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2　PRVgE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3　PRVgH PCR特異性測(cè)定

圖4　PRVgE PCR特異性測(cè)定

PRV的所有毒株均可以擴(kuò)增出355 bp的片段，PRV Fa株和Norden株可以擴(kuò)增出139 bp的片段，而陰性對(duì)照樣品均未能擴(kuò)增出任何條帶。

2.3單一PCR檢測(cè)方法的敏感性測(cè)定結(jié)果將提取的PRV Fa株的DNA按照病毒滴度作梯度稀釋?zhuān)詢(xún)?yōu)化好的單一PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果如圖5。

圖5　PCR檢測(cè)PRVgH模板DNA的敏感性

圖6　PCR檢測(cè)PRVgE模板DNA的敏感性

gH基因的單一PCR方法最低可檢測(cè)到大約為10 TCID50/100 μL的病毒DNA；gE基因的單一PCR方法最低可檢測(cè)到大約為9.5 TCID50/100 μL的病毒DNA。

2.4雙重PCR檢測(cè)方法的擴(kuò)增結(jié)果提取PRV Fa株、Bartha（gE-）株的DNA后，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其結(jié)果如圖7。

圖7　雙重PCR反應(yīng)擴(kuò)增的結(jié)果

從圖7可看出，雙重PCR可擴(kuò)增出PRV gH基因355 bp和gE基因139 bp的條帶，證明該雙重PCR可同時(shí)擴(kuò)增PRV gH基因和gE基因從而鑒別野毒與疫苗毒感染。

2.5雙重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

2.5.1引物濃度的優(yōu)化將PRV gH、gE基因分別以50 pmol/μL，30 pmol/μL，20 pmol/μL，10 pmol/ μL的引物濃度進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，gH基因的最佳引物濃度為20 pmol/μL，gE基因的最佳引物濃度為20 pmol/μL。

2.5.2雙重PCR退火溫度的優(yōu)化將PRV gH、gE基因分別以52℃、54℃、56℃、58℃的退火溫度進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，在退火溫度為56℃時(shí)擴(kuò)增結(jié)果均清晰無(wú)雜帶。

2.6雙重PCR方法特異性試驗(yàn)結(jié)果分別應(yīng)用gH、gE基因的特異性引物，以?xún)?yōu)化好的雙重PCR體系，對(duì)PRV Fa、Bartha株、Norden株、gE基因缺失疫苗株以及對(duì)照樣品進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增結(jié)果如圖8。

圖8　雙重PCR方法特異性結(jié)果

由圖8可以看出，PRV Fa株、Norden株均出現(xiàn)355 bp和139 bp特異性條帶，而B(niǎo)artha株和gE基因缺失疫苗株只出現(xiàn)355 bp條帶，對(duì)照樣品則呈陰性，說(shuō)明了該雙重PCR反應(yīng)良好的特異性。

2.7雙重PCR方法敏感性測(cè)定結(jié)果將提取PRV gH、gE基因的DNA按照其病毒滴度進(jìn)行系列稀釋?zhuān)眉簝?yōu)化好的雙重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，其結(jié)果如圖9。該二聯(lián)PCR最低能檢測(cè)到10-4稀釋PRV即gH 100 TCID50/100 μL，gE 95 TCID50/100 μL的核酸模板。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)檢測(cè)PRV的樣品3次，結(jié)果均一致。

2.9雙重PCR病料檢測(cè)結(jié)果對(duì)15份來(lái)自河南周邊地區(qū)PRV疑似病料檢測(cè)，其中有5份雙重PCR檢測(cè)gH基因?yàn)殛?yáng)性；有3份雙重PCR檢測(cè)gH、gE基因同時(shí)為陽(yáng)性；其余病料復(fù)合PCR檢測(cè)全為陰性，在同樣條件處理下的健康豬材料為陰性，結(jié)果與單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)97.5%。

圖9　雙重PCR方法敏感性測(cè)定結(jié)果

3　結(jié)論與討論

3.1PCR技術(shù)具有快速和靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但常規(guī)的PCR技術(shù)一次檢測(cè)不能區(qū)分出疫苗毒還是野毒感染。本研究根據(jù)偽狂犬病病毒PRV基因缺失疫苗缺失了gE基因和病毒必需基因gH的特點(diǎn)，按照PRV gE和gH的序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，建立了特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好，能區(qū)分gE基因缺失疫苗毒和野毒的PCR鑒別診斷方法。該方法同時(shí)能用于潛伏感染病毒的檢測(cè)，可區(qū)分開(kāi)野毒潛伏感染與疫苗毒潛伏感染。復(fù)合PCR反應(yīng)是一種特殊的PCR形式，當(dāng)其反應(yīng)體系中同時(shí)含有兩對(duì)或兩對(duì)以上引物和模板時(shí)，反應(yīng)總是有利于片段較小的一方，即短片段優(yōu)先擴(kuò)增的原理[2]。但是本試驗(yàn)gE雖然是短片段但并沒(méi)有優(yōu)先擴(kuò)增，這可能與模板量差異以及毒株差異有密切關(guān)系。gE基因G+C%含量高達(dá)74.4%，開(kāi)始時(shí)用一般的10×Buffer擴(kuò)增不出特異性條帶，后來(lái)?yè)Q成2×GC BufferII后得到很好擴(kuò)增。本試驗(yàn)所擴(kuò)增的PRV gH、gE片段為355 bp和139 bp，兩者相差不大，在選擇反應(yīng)條件時(shí)，盡量選擇有利于gE基因的擴(kuò)增條件，以達(dá)到最佳的復(fù)合PCR擴(kuò)增效果。

3.2本試驗(yàn)在單項(xiàng)PCR條件的基礎(chǔ)上作出了復(fù)合PCR反應(yīng)條件的選擇。在引物濃度的選擇上，考慮到gE基因難擴(kuò)增，所以選擇兩者單項(xiàng)PCR擴(kuò)增均較好的引物濃度。在溫度循環(huán)參數(shù)中，由于兩種PCR反應(yīng)的變性和延伸條件相同，故沒(méi)作改變。復(fù)性溫度gH基因在54℃、56℃擴(kuò)增效果較好，而gE基因在54℃、56℃、58℃均能得到很好擴(kuò)增，故復(fù)合PCR的復(fù)性溫度選擇在56℃。從PRV雙重PCR的敏感性測(cè)定結(jié)果表明，在雙重PCR反應(yīng)中，只要引物設(shè)計(jì)合理，反應(yīng)條件選擇得當(dāng)，雙重PCR擴(kuò)增和常規(guī)PCR技術(shù)一樣，都具有極高的敏感性，能檢出痕量目的DNA片段。

3.3對(duì)15份臨床病例檢測(cè)結(jié)果表明，5份gH基因檢測(cè)陽(yáng)性為使用了偽狂犬病病毒gE基因缺失疫苗，3份gH、gE基因同時(shí)為陽(yáng)性為偽狂犬病病毒野毒感染，由此可見(jiàn)，應(yīng)用PRV的雙重PCR技術(shù)可以直接對(duì)臨床樣品進(jìn)行擴(kuò)增，可區(qū)分野毒和疫苗毒，大大提高了PRV的診斷速度，這對(duì)PRV的早期診斷及區(qū)分疫苗毒和野毒臨床的快速鑒別診斷具有很高的實(shí)用價(jià)值。

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S852.65

A

0529-6005（2016）07-0012-04

2015-11-16

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（152102110092）

趙麗（1973-），女，副教授，博士生，研究方向?yàn)榉肿硬《緦W(xué)與免疫學(xué)，E-mail：zhaolisq@163.com