黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白及NO含量的影響*

蘇　韞，劉永琦，顏春魯，薛　娜，伍志偉，聶　蕾，王　琰甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州73000；甘肅省婦幼保健院

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黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠
腦組織Bcl-2、Bax蛋白及NO含量的影響*

蘇韞1，劉永琦1，顏春魯1，薛娜1，伍志偉1，聶蕾1，王琰2
1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730020；2甘肅省婦幼保健院

目的：探討黃芪多糖對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織Bcl-2、Bax蛋白及NO含量的影響。方法：將SPF級(jí)Wistar大鼠72只分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及黃芪多糖高、中、低劑量組，采用改良的線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型，各藥物組分別給予相應(yīng)藥物15天后采用免疫組化法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白含量的表達(dá)，采用硝酸鹽還原酶法檢測(cè)NO蛋白含量的表達(dá)。結(jié)果：1）Bcl-2、Bax的含量模型組較假手術(shù)組表達(dá)明顯增加；與模型組比較，Bcl-2表達(dá)黃芪多糖高、中劑量組增加（P＜0.05）；Bax含量黃芪多糖高劑量組表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組Bc l-2/Bax比值明顯降低，陽(yáng)性對(duì)照組與黃芪多糖各劑量組比較比值升高。2）與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中NO的水平明顯升高（P＜0.05），與模型組比較，黃芪多糖高劑量組中NO含量明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：黃芪多糖可增加凋亡抑制基因Bc l-2蛋白和降低凋亡促進(jìn)基因Bax蛋白的表達(dá)，通過(guò)增加Bcl-2/Bax比例，降低NO含量，減少細(xì)胞凋亡的凋亡程度。

腦缺血再灌注；Bcl-2；Bax；NO；黃芪多糖

腦缺血再灌注后發(fā)生細(xì)胞凋亡是一個(gè)由多個(gè)基因嚴(yán)格控制的程序性死亡過(guò)程，其中Bcl-2基因和Bax基因是一對(duì)抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)凋亡的重要基因，目前普遍認(rèn)為，Bcl-2家族中抑制細(xì)胞凋亡的因子與促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子之間的比例決定著細(xì)胞的生死［1-2］。本研究通過(guò)探討黃芪多糖對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織Bcl-2、Bax表達(dá)、Bcl-2/Bax比值及NO含量的影響，推測(cè)黃芪多糖可能的藥理作用機(jī)制，為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Wistar大鼠72只，體質(zhì)量（300±30）g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號(hào)：SYXK（甘）2011-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（甘）2011-0001-0001343。

1.2主要試劑濃縮型兔抗大鼠Bcl-2抗體：BA0412（武漢博士德生物工程有限公司）；濃縮型兔抗大鼠Bax抗體：BA0315（武漢博士德生物工程有限公司）；SABC（兔IgG）免疫組化試劑盒（SA1022，武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：201203）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：201203）。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物選用甘肅道地藥材黃芪，黃芪多糖由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心藥物制劑實(shí)驗(yàn)室提取、分離、鑒定；尼莫地平（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：110810）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：110912）。

1.4主要儀器C X31型生物顯微鏡（日本Olympus optical Co.LTD）；山東易創(chuàng)MiE圖像處理系統(tǒng)（山東易創(chuàng)電子有限公司）；成都泰盟BI-2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1動(dòng)物分組將Wistar大鼠72只隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及黃芪多糖高、中、低劑量組，每組12只。

1.5.2給藥劑量及方法黃芪多糖給藥劑量：高劑量120mg/kg；中劑量60mg/kg；低劑量30mg/kg；配藥濃度：高劑量組1.2%，中劑量組0.6%，低劑量組0.3%。臨用前分別用助溶劑0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成相應(yīng)濃度的溶液。尼莫地平給藥劑量為5mg/kg，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制。模型組和假手術(shù)組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，各組造模后分別連續(xù)給藥15天。

1.5.3動(dòng)物模型制備及取材采用Logna EZ等［3］報(bào)道的線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞局灶性腦缺血再灌注模型。自頸總動(dòng)脈分叉處向頸內(nèi)動(dòng)脈插入栓線約（18.5±0.5）mm，阻斷大腦中動(dòng)脈血流，造成局灶性腦缺血。術(shù)后將栓線尾部置于皮下，于2小時(shí)后小心抽出栓線實(shí)現(xiàn)缺血再灌注。假手術(shù)組頸內(nèi)動(dòng)脈也插入栓線，但深度僅為6mm，不阻塞大腦中動(dòng)脈。麻醉清醒后參照Longa EZ［3］方法進(jìn)行5分制評(píng)分，達(dá)1～3分入組。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉鹽，每天40000U，連續(xù)注射3天，以預(yù)防感染。造模后24小時(shí)對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，參考Longa及Bederson［4］評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度的5級(jí)4分法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分為1～3分者提示模型成功；10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取右腦并用4%多聚甲醛溶液4℃固定，制備蠟塊后免疫組化法檢測(cè)Bax及Bcl-2蛋白，將制備病理標(biāo)本剩余右腦組織制備組織勻漿檢測(cè)N O的含量。

1.5.4圖像分析Bcl-2、Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為棕黃色，主要位于胞漿、包膜上；隨即選取缺血側(cè)皮層5個(gè)視野；每組觀察6張切片，合計(jì)30個(gè)視野；陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以（χ±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Bcl-2、Bax表達(dá)的影響假手術(shù)組Bcl-2僅有少量細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，模型組較假手術(shù)組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)增加，黃芪多糖高、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；假手術(shù)組Bax僅有極少量的陽(yáng)性表達(dá)，模型組較假手術(shù)組Bax表達(dá)增加（P＜0.05）。與模型組比較，黃芪多糖高劑量組表達(dá)減少（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較模型組Bcl-2/Bax比值降低，陽(yáng)性對(duì)照組與黃芪多糖各劑量組比較其比值升高，見(jiàn)表1、圖1—10。

表1　黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Bcl-2、Bax表達(dá)的影響（s）個(gè)/HP

表1　黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Bcl-2、Bax表達(dá)的影響（s）個(gè)/HP

注：與假手術(shù)組比較，*表示P＜0.05；與模型組比較，#表示P＜0.05。

組別平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/個(gè)Bcl-2/Bax Bcl-2 Bax假手術(shù)組4.55±0.79 4.09±1.22 1.11模型組11.46±1.05*16.59±1.91*0.69陽(yáng)性對(duì)照組17.63±1.20#11.78±0.91#1.50黃芪多糖高劑量組15.45±1.66#12.39±0.75#1.25黃芪多糖中劑量組15.83±1.72#15.50±0.55 1.02黃芪多糖低劑量組13.34±1.36 15.27±1.04 0.87

圖1　假手術(shù)組Bcl-2蛋白×40

圖2　模型組Bcl-2蛋白×40

圖3　陽(yáng)性對(duì)照組Bcl-2蛋白×40

圖4　黃芪多糖高劑量組Bcl-2蛋白×40

圖5　黃芪多糖中劑量組Bcl-2蛋白×40

圖6　黃芪多糖低劑量組Bcl-2蛋白×40

圖7　假手術(shù)組Bax蛋白×40

圖8　模型組Bax蛋白×40

圖9　陽(yáng)性對(duì)照組Bax蛋白×40

圖10　黃芪多糖高劑量組Bax蛋白×40

2.2黃芪多糖對(duì)大鼠腦組織NO含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中N O的水平升高（P＜0.05），與模型組比較，黃芪多糖高劑量組中N O含量降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2　黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織勻漿NO含量的影響（s）

表2　黃芪多糖對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織勻漿NO含量的影響（s）

注：與假手術(shù)組比較，*表示P＜0.05；與模型組比較，#表示P＜0.05。

組別劑量/［mg·（kg·d）-1］NO含量/（μmol·gpro-1）假手術(shù)組等體積羧甲基纖維素鈉2.59±0.33模型組等體積羧甲基纖維素鈉4.67±0.54*陽(yáng)性對(duì)照組5 3.24±0.49黃芪多糖高劑量組120 2.12±0.37#黃芪多糖中劑量組60 4.28±0.48黃芪多糖低劑量組30 4.11±0.45

3　討論

B cl-2和B a x基因是一對(duì)研究較為明確的在功能上相互對(duì)立的凋亡調(diào)控基因，兩者之間的比例決定細(xì)胞受到刺激后是否發(fā)生凋亡，如果Bcl-2占優(yōu)勢(shì)則細(xì)胞存活，Bax占優(yōu)勢(shì)則細(xì)胞發(fā)生凋亡［4-5］。本研究顯示，假手術(shù)組Bcl-2和Bax僅有微弱的表達(dá)；與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)增加；黃芪多糖可促進(jìn)腦缺血損傷大鼠腦組織Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)比率，來(lái)抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。

NO可影響凋亡基因的表達(dá)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)bcl-2和上調(diào)bax，激活caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并降低細(xì)胞線粒體跨膜電位，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡［6］。本研究表明模型組大鼠腦組織中NO的水平升高，與bcl-2和bax的表達(dá)趨勢(shì)一致，而黃芪多糖高劑量組大鼠腦組織中NO含量降低，說(shuō)明黃芪多糖可以降低大鼠腦組織中N O含量，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，可能為黃芪多糖減輕大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)凋亡的機(jī)制之一。

［1］馬宏鐘，薛榮亮.Bcl-2相關(guān)蛋白與細(xì)胞凋亡和腦缺血再灌注損傷［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊(cè)，2001，22（6）:362-364.

［2］Dorota S，Jul ita CB，Matylda M，et al. Bc l-2 and Bax protein are increased in neocor tical but not in thalamic apoptosis fol lowing devascularizing lesion of the cerebral cor tex in the rat:an immunohis to chemical study［J］.Brain Research，2004，1006（1）:133-149.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Car lson S，et al. Reversible middle cerebral artery occ lusion without craniectomy in rats［J］. St roke，1989，20（1）:84-91.

［4］武亞輝，衛(wèi)建平，李光來(lái)，等.烏司他丁對(duì)大鼠腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)Bcl-2 Fas Caspase-3表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥物與臨床，2012，12（2）：173-175.

［5］鄧娟，周華東，張莉莉，等.Bcl-2對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)元DNA的自我保護(hù)作用［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2002，6（15）:2216-2217.

［6］Fehsel K，Kroncke KD，Meyer KL，et al. Nitr ic oxide induces apoptosis inmouse thymocytes［J］.J Immunol，1995，155（6）: 2858-2862.

In fluence of Astragalus Polysaccharideson the Contents of Bcl-2，Bax Protein and NO in the Brain Tissueof the Rats with Cerebral Ischem ia Reperfusion

SU Yun1，LIU Yongqi1，YAN Chunlu1，XUE Na1，WU Zhiwei1，NIE Lei1，WANG Yan2
1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730020，China；2 Gansu Provincial Maternity and Child-care Hospital

Objective:To explore the influence of astragalus polysaccharides on the contents of Bcl-2，Bax protein and NO in the brain tissue of the rats after cerebral ischemia reperfusion.Methods:Seventy-two SPF rats were random ized into sham operation group，themodelgroup，positive controlgroup，high，moderate and low doses groups of astragalus polysaccharides，the ratmodelwas prepared by reformedm iddle cerebral artery occlusion，the expressionsof Bax protein and Bcl-2 proteinwere detected with immunohistochemicalmethod after differentmedication groupsw ere adm inistered w ith the corresponding herbs respectively，the expressions of NO protein was detected by nitrate reductasemethod.Results:1）The contentsof Bcl-2 and Bax in themodel groups increased notably compared w ith sham operation group；compared w ith themodel group，the expressions of Bcl-2 increased in high andmoderate dosesgroups of astragalus polysaccharides（P＜0.05）；the contentsof Bax protein decreased signifi-cantly in high dosegroup ofastragaluspolysaccharides（P＜0.05）.Comparedwith sham operation group，the ratio of Bcl-2/Bax lowered notably in themodelgroup，it rosewhen positive controlgroup was comparedwith differentdosesgroupsof astragaluspolysaccharides.2）Comparedw ith sham operation group，the levelof NO raised remarkably in themodelgroup（P＜0.05），comparedw ith themodel group，the contentsof NO decreased evidently in the high dose group of astragalus polysaccharides（P＜0.05）.Conclusion:Astragalus polysaccharides could improve the expressions of Bcl-2 and Bax protein；it could reduce the degrees of cellular apoptosis by increasing the ratio of Bcl-2/Bax，and decreasing the contentsof NO.

cerebral ischem ia reperfusion；Bcl-2；Bax；NO；astragalus polysaccharides

R286

A

1004-6852（2016）03-0010-04

2015-01-05

甘肅省教育廳第二批科研項(xiàng)目（編號(hào)1006B-08）；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)校內(nèi)中青年基金（編號(hào)BH2010-076）。

蘇韞（1977—），女，碩士學(xué)位，副教授。研究方向：中醫(yī)藥免疫學(xué)研究。