60min/d游泳運動對大鼠腦衰老和海馬GAP-43表達的影響

蔡婧 袁瓊嘉

60min/d游泳運動對大鼠腦衰老和海馬GAP-43表達的影響

蔡婧 袁瓊嘉

目的：探討60min/d游泳運動對D-半乳糖致大鼠腦衰老和海馬GAP-43表達的影響。方法：將42只SD大鼠隨機分為：0.9%Nacl對照組（Na），衰老組（D），運動干預組（Ds），n=14。測定大腦皮質GSH-Px、SOD活性和MDA含量，Western blotting檢測海馬GAP-43蛋白表達。結果：D組較Na組行動遲緩，精神不振且嗜睡，皮毛無光澤、卷曲枯黃且伴有嚴重脫落等衰老體癥明顯；D組與Na組相比GSH-PX、SOD活性非常顯著性降低（P＜0.01），MDA含量非常顯著升高（P＜0.01）；Ds組GSHPX活性顯著性高于D組（P＜0.05），SOD活性非常顯著性高于D組（P＜0.01），MDA含量非常顯著性低于D組（P＜0.01）；Ds組和Na組GSH-PX、SOD活性和MDA含量均無顯著性差異（P＞0.05）。D組海馬GAP-43蛋白表達量非常顯著性低于Na組（P＜0.01）；Ds組海馬GAP-43蛋白表達量非常顯著性高于D組（P＜0.01）；Ds組海馬GAP-43蛋白表達量顯著性低于較Na組（P＜0.05）。結論：（1）注射D-半乳糖（100mg/kg/d）6周，可以建立大鼠腦衰老模型。（2）在大鼠衰老過程中進行60min/d游泳運動干預可以延緩腦衰老，減緩海馬GAP-43蛋白表達量的下調。

有氧運動；衰老；海馬；GAP-43；大鼠

10.16730/j.cnki.61-1019/g8.2016.08.092

學習記憶能力會隨著腦的衰老而逐漸減退［1］。自由基學說是目前公認的衰老學說之一［2］。有氧運動能提高機體清除自由基的能力，延緩衰老［3］。海馬與空間學習和記憶密切相關［4］。GAP-43不僅對神經纖維的生長、發(fā)育和軸突的再生以及突觸功能的維持等方面起著重要的作用，而且還參與調節(jié)神經遞質的釋放［5］。本實驗運用D-半乳糖致大鼠腦衰老［6］。在大鼠腦衰老過程中經行60min/d游泳運動干預，觀察60min/d游泳運動對大鼠腦衰老和海馬GAP-43表達的影響，從分子水平探討60min/d游泳運動對腦衰老的影響機制。

1.材料與方法

1.1造模和取材

42只4月齡SPF級雄性SD大鼠，體重400±20g，購于成都達碩生物科技有限公司，生產許可證CSXK（川）2008-24。

自由飲食，光照，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為：0.9%Nacl對照組（Na），衰老組（D），運動干預組（Ds）（見表1）。

表1　分組造模

Na組每日9：00注射0.9%Nacl（2ml/kg/d），共6周；D組和Ds組每日注射5%D-半乳糖，注射時間和計量同Na組；Ds組每日注射5%D-半乳糖的同時，19：00進行60mim/d的游泳運動訓練（水深80cm，水溫34±2℃），每周訓練6天。6周后，斷頭取腦，剝離海馬和大腦皮質用凍存管分裝入液氮罐保存。

1.2自由基指標檢測

考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒檢測大腦皮質蛋白總量；微量還原型谷胱甘肽測定試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）WST -1法測定試劑盒檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物岐化酶（SOD）活性；丙二醛（MDA）測定試劑盒檢測丙二醛（MDA）含量。具體實驗操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3western blot檢測

海馬組織按1mg：20 μl裂解液比例勻漿提取樣品基因總蛋白；總蛋白濃度用碧云天BCA蛋白濃度測試試劑盒測定；蛋白變性；蛋白樣品SDS-PAGE凝膠電泳至分離，轉印PVDF膜，8%脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗（ab9018），濃度：1：1000，4℃孵育過夜；二抗（山羊抗小鼠lgG/辣根酶標記），濃度：1：2000，37℃孵育2h；暗室顯影、定影。Quantity One分析軟件，條帶軌跡定量分析法（TraceTracking）分析條帶灰度值，與βactin掃描值相比，以其比值作為目的蛋白的表達量［7］

1.4統(tǒng)計學分析

SPSS17.0分析得出結果以均值±標準差表示，單因素方差分析組間比較，P＜0.05表示具有顯著性意義，P＜0.01表示具有非常顯著性意義。

2.結果

2.1大鼠狀態(tài)觀察

表3　各組大鼠大腦皮質GSH-Px、SOD活性和MDA含量（X±S，n=6）

D組大鼠行動遲緩，精神不振且嗜睡，皮毛無光澤、卷曲枯黃且伴有嚴重脫落。Na組與D組相比，精神狀態(tài)良好且行動敏捷、毛發(fā)富有光澤。

2.2自由基檢測結果

2.3海馬GAP-43 western-blotting檢測結果

圖1　各組GAP-43基因蛋白表達量

3.討論

3.1大鼠腦衰老模型驗證

GSH-PX、SOD等協(xié)同可以將大部分O-2反應掉，是體內清楚自由基的主要酶類［8］。但是隨著年齡的遞增，不斷的衰老，GSH-PX、SOD的合成會逐步減少；活性也會降低，導致過氧化物在體內大量的堆積，使體內脂質過氧化產物MDA水平升高［9］。本實驗采用動物腹腔注射D-半乳糖致衰老［1 0］，發(fā)現(xiàn)D組大鼠行動遲緩，精神不振且嗜睡，皮毛無光澤、卷曲枯黃且伴有嚴重脫落等衰老體癥。Na組大鼠精神狀態(tài)良好且行動敏捷、毛發(fā)富有光澤。一般狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，D組表現(xiàn)出明顯的衰老癥狀。通過自由基檢測，D組大鼠大腦皮質GSHPX和SOD活性顯著性低于Na組（P＜0.01）；MDA含量顯著性高于N組（P＜0.01）。研究結果證明本次連續(xù)6周腹腔注射D-半乳糖造腦衰老模型成功。

3.2有氧運動對大鼠腦GSH-PX、SOD活性和MDA含量的影響

運動訓練一方面能夠有效地提高機體清除自由基的能力，另一方面又會致機體生成自由基［1 1］。本次實驗運用60min/d無負重游泳運動的手段干預D-半乳糖致衰老過程，檢測大鼠腦GSH-PX、SOD活性和 MDA含量。結果顯示：Ds組與D組相比較GSH-PX活性顯著性提高（P＜0.05）；SOD活性非常顯著性提高（P＜0.01），而Ds組MDA含量非常顯著性的低于D組（P＜0.01）。Ds組在衰老的過程進行了60min/ d游泳運動干預有效地增強了大腦GSH-PX、SOD的活性，同時脂質過氧化產物MDA的含量也被降低了。與6周跑臺訓練可以提高大腦皮層和海馬的GSH-PX、SOD的活性，降低MDA、LPO的含量［1 2］。以及適度的有氧運動可以提高大腦的抗氧化能力，抑制脂質過氧化反應［1 3、1 4、1 5］，等結論一致。

3.3有氧運動對大鼠海馬GAP-43表達的影響

GAP-43是神經系統(tǒng)發(fā)育和軸突再生的關鍵［16］，學習記憶的神經基礎是突觸可塑性，其典型的表現(xiàn)是LTP的形成，GAP-43在此過程中起著重要的作用。本研究結果顯示：D組與Na組相比較海馬GAP-43蛋白表達水平非常顯著性降低（P＜0.01），說明大腦衰老后，海馬GAP-43蛋白的表達水平顯著下降。Ds組與D組相比海馬GAP-43蛋白表達水平非常顯著性上調（P＜0.01），Ds組與Na相比海馬GAP-43蛋白表達水平顯著性下降（P＜0.05）。提示衰老過程中經行60min/d游泳運動即有氧運動干預可以有效地控制海馬GAP -43蛋白表達水平的下降，是降低大鼠衰老過程中學習記憶能力衰退的機制之一。

4.結論

4.1注射D-半乳糖（100mg/kg/d）6周，可以成功建立大鼠腦衰老模型。

4.2大鼠衰老過程中進行60min/d游泳運動干預可以延緩腦衰老，減緩海馬GAP-43基因mRNA和蛋白表達量的下調?？赡苁茄泳彺笫笏ダ线^程中學習記憶能力衰退的機制之一。

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國家自然科學基金（項目編號：31371202）；四川省科技廳科技支撐計劃項目（項目編號：2012SZ0067）；國家體育總局、四川省運動醫(yī)學重點實驗室＂四川省高?？蒲袆?chuàng)新團隊專項基金研究成果＂。

蔡 婧（1985-），女，江西大余人，碩士研究生，研究方向：運動與健康促進，運動人體科學，私立華聯(lián)學院；袁瓊嘉（1956-），女，重慶市人，研究方向：體育運動與健康促進、運動人體科學，教授，成都體育學院運動醫(yī)學系。（通訊作者）