煙草根系分泌物酚酸類物質(zhì)的鑒定及其對(duì)根際微生物的影響

劉艷霞, 李 想, 蔡劉體, 張 恒, 石俊雄

(貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550000)

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煙草根系分泌物酚酸類物質(zhì)的鑒定及其對(duì)根際微生物的影響

劉艷霞, 李 想, 蔡劉體, 張 恒, 石俊雄*

(貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550000)

【目的】煙草連作已導(dǎo)致土傳病害發(fā)生、煙株生長(zhǎng)受抑制、產(chǎn)量下降和品質(zhì)惡化等問(wèn)題。煙株對(duì)自身及土壤微生物產(chǎn)生的化感作用，是煙草產(chǎn)生連作障礙的一個(gè)重要原因，其中化感物質(zhì)中的根系分泌物是煙株與土壤微生物間相互作用的重要物質(zhì)，探索煙草根系分泌物對(duì)根際微生物生長(zhǎng)的影響是生物防控?zé)煵萸嗫莶〉睦碚撘罁?jù)?！痉椒ā勘疚睦贸咝б合嗌V串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)，分離、鑒定煙草根系分泌物中主要酚酸類物質(zhì)的種類和含量; 通過(guò)添加外源酚酸類物質(zhì)，研究在液體培養(yǎng)基中煙草根系分泌物中的主要酚酸類物質(zhì)對(duì)病原菌及拮抗菌的影響，并在土壤中添加鑒定出的主要酚酸類物質(zhì); 通過(guò)土壤培育試驗(yàn)，研究其對(duì)土壤微生物多樣性和數(shù)量變化，特別是對(duì)煙草青枯病菌及其拮抗菌生長(zhǎng)的影響?！窘Y(jié)果】1)煙草根系分泌物粗提物對(duì)病原菌(茄科勞爾氏菌)生長(zhǎng)的促進(jìn)率為16.8%，對(duì)拮抗菌(短短芽孢桿菌)的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到29.4%; 2)UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)根系分泌物中主要酚酸類物質(zhì)為苯甲酸和3-苯丙酸，含量分別為0.25μg/g干根重和1.15μg/g干根重; 3)液體培養(yǎng)外源添加低濃度的苯甲酸(≤ 2μg/L)和3-苯丙酸(≤ 3μg/L)促進(jìn)病原菌和拮抗菌的生長(zhǎng); 4μg/L的苯甲酸對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制作用不顯著，對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到90.2%，6μg/L的 3-苯丙酸對(duì)病原菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，對(duì)拮抗菌的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到81.1%，外源高濃度苯甲酸(≥4μg/L)和3-苯丙酸(≥ 7μg/L)抑制病原菌與拮抗菌的成長(zhǎng); 4)土壤中添加3μg/kg土的苯甲酸時(shí)，土壤中病原菌的數(shù)量增加12.3%，而拮抗菌的數(shù)量減少21.0%，土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量分別降低37.5%，41.9%和55.6%; 3-苯丙酸濃度達(dá)到8μg/kg土?xí)r，拮抗菌生長(zhǎng)量減少14.5%，對(duì)病原菌沒(méi)有顯著影響，土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量分別降低69.9%，57.2%和80.7%; 5)土壤添加4μg/kg的苯甲酸和7μg/kg的3-苯丙酸后，土壤微生物Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、McIntosh指數(shù)顯著下降，分別僅為對(duì)照的57.7%、94.1%、88.1%和97.6% 73.3%、80.0%。【結(jié)論】煙草根系分泌物粗提物促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)抑制拮抗菌生長(zhǎng)，根系分泌物中酚酸類物質(zhì)主要為苯甲酸和3-苯丙酸，液體培養(yǎng)中4μg/L的苯甲酸或6μg/L的 3-苯丙酸濃度是對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制不明顯但顯著抑制拮抗菌生長(zhǎng)的分界點(diǎn)，土壤外源添加3μg/kg的苯甲酸或8μg/kg的3-苯丙酸時(shí)，是土壤增加病原菌減少拮抗菌數(shù)量的分界點(diǎn)，同時(shí)土壤微生物功能多樣性顯著下降，病原菌對(duì)根系分泌物中苯甲酸和3-苯丙酸的利用優(yōu)于拮抗菌，這也是煙草長(zhǎng)期連作引起青枯病暴發(fā)流行的機(jī)理之一。

煙草根系分泌物; 病原菌; 拮抗菌; 根際微生物; 土壤微生物群落功能多樣性

soilmicrobialfunctionaldiversity

煙草作物的氣候性較強(qiáng)，對(duì)地理環(huán)境和栽培條件要求較高，因此煙草種植有明顯的地域性特點(diǎn)，在貴州省甚至全國(guó)煙葉生產(chǎn)中，連作現(xiàn)象非常普遍。單一作物連作導(dǎo)致根系分泌物在土壤中不斷積累，從而對(duì)作物和土壤微生物產(chǎn)生化感作用[1]。酚酸類物質(zhì)是根系分泌物中非常重要的化感物質(zhì)，對(duì)植物的自毒作用也是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要因素[2]。前期研究通過(guò)GC、HPLC、GC/MS等分離鑒定手段己經(jīng)得到了多種酚類化感物質(zhì)，如氫氰酸、苯甲酸、肉桂酸和皂角昔等物質(zhì)都對(duì)土壤微生物生長(zhǎng)起抑制作用或促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)繁殖[3]，從而誘導(dǎo)土傳性病害的發(fā)生。本研究表明，長(zhǎng)期連作一種作物會(huì)導(dǎo)致根際形成單一的土壤環(huán)境，根系分泌物作為土壤中的碳、氮物質(zhì)，為病原菌生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也抑制了一些根際有益微生物的生長(zhǎng)，從而在土壤中形成一種不平衡的微生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致土傳病害的暴發(fā)流行[4-5]。近年來(lái)，對(duì)于根系分泌物的研究主要側(cè)重在小麥[6]、水稻[7]、西瓜[8]和黃瓜[9]等作物上，而對(duì)煙草根系分泌物相關(guān)研究較少。且現(xiàn)有研究主要集中在煙草根系粗提物的極性分離，以及不同極性的根系粗提物對(duì)煙苗生長(zhǎng)、土壤酶活性等的影響[10]。

本研究通過(guò)鑒定、分析煙草根系分泌物中主要酚酸類物質(zhì)種類和含量，研究根系分泌物對(duì)煙草青枯病菌、拮抗菌生長(zhǎng)及根際微生物多樣性的影響，旨在探索根系分泌物與煙草連作后造成的煙草青枯病害暴發(fā)的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1煙草青枯病菌茄科勞爾氏菌及其拮抗菌的分離、篩選與鑒定

圖1　共培養(yǎng)法觀測(cè)Ralstonia solanacearum(左)、拮抗菌Brevibacillus brevis(右)的菌落形態(tài)Fig.1　The colony morphology of R. solanacearum (left) and the antagonist (right) tested by co-cultureing R. solanacearum.

在培育45d后，先用自來(lái)水沖洗煙苗根系5次，再用去離子水沖洗5次。煙草根系浸泡在6L超純水中于恒溫恒濕人工氣候室中培育36h，期間用電磁泵向水中補(bǔ)充氧氣以維持煙株正常生長(zhǎng)。根系分泌物收集液經(jīng)0.45μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后立即凍干濃縮并保存于-20℃條件下。根系分泌物凍干粉末溶解于滅菌去離子水中，分別配成0.01g/mL用于生物測(cè)定及1g/mL用于成分分析?？偺己涂偟坑蒃lementar元素分析儀測(cè)定(VarioELcube，德國(guó))，經(jīng)測(cè)定，根系分泌物母液粗提物中總碳含量為38.94%，總氮含量為4.62%。

1.3煙草根系分泌物對(duì)病原菌與拮抗菌生長(zhǎng)的影響

茄科勞爾氏菌在改良的Kelman’sTTC瓊脂培養(yǎng)基(10g葡萄糖、5g蛋白胨、3g牛肉浸粉和0.5g酵母粉，定容至1L水中，pH調(diào)節(jié)至7.0)上培養(yǎng)[19]，篩選到的拮抗菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)[20]。每種微生物各設(shè)置兩個(gè)處理，共4個(gè)處理: 1)茄科勞爾氏菌在改良后的Kelman’sTTC培養(yǎng)基上培養(yǎng)(CKR); 2)茄科勞爾氏菌在1 ∶1 (v∶v) 改良后的Kelman’sTTC培養(yǎng)基和0.01g/mL，rootDW根系分泌物溶液中培養(yǎng)(RR); 3)拮抗菌短短芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)(CKB); 4)拮抗菌短短芽孢桿菌在1 ∶1 (v∶v) 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和0.01g/mL，rootDW根系分泌物溶液中培養(yǎng)(RB)。所有處理于30℃、170r/m培養(yǎng)48h。茄科勞爾氏菌與拮抗菌的生長(zhǎng)速率通過(guò)分光光度計(jì)對(duì)OD600進(jìn)行測(cè)定。

根系分泌物對(duì)微生物生長(zhǎng)速率的影響=[(ROD600-CKOD600)/CKOD600]×100%式中: ROD600表示在1 ∶1 (v∶v)培養(yǎng)基和0.01g/mL，rootDW根系分泌物溶液中培養(yǎng)后微生物OD600值; CKOD600表示微生物直接在培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的OD600值。

1.4UPLC-Q-TOF/MS分析酚酸標(biāo)準(zhǔn)品和根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)

五倍子酸、原兒茶酸、2,5-二羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲醛從AlfaAesar公司購(gòu)買 (WardHill,MA,USA)，香草酸、對(duì)香豆酸、紫丁香酸、阿魏酸、苯甲酸、3-苯丙酸和肉桂酸購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(Steinem,Germany)。通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品和根系分泌物中主要物質(zhì)的出峰時(shí)間和峰面積鑒定根系分泌物中主要酚酸類物質(zhì)及其含量[21]，并通過(guò)分析質(zhì)譜圖，確定各組分的分子組成。前期用半制備高效液相色譜儀(Aglient1200, 德國(guó))分離根系分泌物中主要酚酸類物質(zhì)，分離度較好(圖2)。兩個(gè)主要色譜峰出現(xiàn)在保留時(shí)間60min和60.5min，與標(biāo)準(zhǔn)品峰圖比對(duì)后，初步確定這兩個(gè)峰分別為苯甲酸和3-苯丙酸(圖2)。

圖2　酚酸標(biāo)準(zhǔn)品(左)和煙草根系分泌物(右)液相色譜圖Fig.2.　HPLC chromatograms of standard phenolic acids (left) and tobacco root exudates (right)

[注(Note): 1—五倍子酸Gallicacid; 2—原兒茶酸Protocatechuicacid; 3—2,5-二羥基苯甲酸2, 5-dihydroxybenzoicacid; 4—4-羥基苯甲酸4-hydroxybenzoicacid; 5—4-羥基苯甲醛4-hydroxybenzaldehyde; 6—香草酸Vanillicacid; 7—對(duì)香豆酸P-coumaricacid; 8—紫丁香酸Syringicacid; 9—阿魏酸Ferulicacid; 10—苯甲酸Benzoicacid; 11—3-苯丙酸3-phenylpropanoicacid; 12—肉桂酸Cinnamicacid.]

1.5外源添加酚酸類物質(zhì)對(duì)病原菌和拮抗菌生長(zhǎng)的影響

將UPLC-Q-TOF/MS中分離、鑒定的主要酚酸類物質(zhì)以外源添加的方式研究其對(duì)煙草青枯病菌和拮抗菌生長(zhǎng)的影響。15μg苯甲酸溶解于60℃滅菌后的去離子水中，作為母液1。0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和10.0μg/L濃度的苯甲酸溶液分別由母液1稀釋獲得; 0.3mg3-苯丙酸溶于10mL滅菌后去離子水中，作為母液2。0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0μg/L濃度的3-苯丙酸分別由母液2稀釋獲得。研究不同濃度的苯甲酸溶液和3-苯丙酸溶液對(duì)青枯病病原菌和拮抗菌生長(zhǎng)的影響方法同上。每處理重復(fù)5次。

1.6添加外源酚酸類物質(zhì)對(duì)土壤病原菌和拮抗菌數(shù)量的影響

從青枯病發(fā)病嚴(yán)重的大田采集土壤并接種拮抗菌，在貴州省煙草科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行土壤培育實(shí)驗(yàn)。將分離、鑒定的根系分泌物中主要酚酸類物質(zhì)以外源添加的方式施加于土壤中，苯甲酸濃度調(diào)整至3、4和5μg/kg土，3-苯丙酸濃度調(diào)整至6、7和8μg/kg土，向土壤中接種滅菌去離子水為對(duì)照，每處理5次重復(fù)。將土壤置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃和60% 相對(duì)濕度下培養(yǎng)3d。用熒光定量PCR法測(cè)定土壤中病原菌和拮抗菌的數(shù)量[14]。

1.7添加外源酚酸類物質(zhì)對(duì)土壤根際微生物的影響

根際土壤微生物功能多樣性用BiologEcoPlate系統(tǒng) (BiologInc.HaywardCal.USA)通過(guò)比較31種碳源利用情況測(cè)定[22]。土壤懸液在4℃、3000×g轉(zhuǎn)速下離心5min，然后用0.85%的NaCl溶液稀釋100倍。土壤稀釋液接種于EcoPlates，在Biolog恒溫(25℃)培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)72h。EcoPlates上每孔顏色變化度為OD值與對(duì)照OD值之差[23]。微生物活性用微孔板平均顏色變化度(AWCD)值表示，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)表征土壤微生物功能多樣性。

ShannonIndex=-∑PilnPi

式中，Pi=Ai/Atotal;ni=Ai;N=Atotal;A代表590nm處吸光度。

1.8數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2003進(jìn)行處理，顯著性分析采用SPSSBaseVer.13.0統(tǒng)計(jì)軟件 (SPSS,IL,Chicago,USA)，LSD、Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(P≤0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1煙草根系分泌物粗提物對(duì)病原菌與拮抗菌生長(zhǎng)的影響

根系分泌物溶液能夠顯著促進(jìn)病原菌(茄科勞爾氏菌)的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)拮抗菌(短短芽孢桿菌)生長(zhǎng)具有抑制作用。從表1可以看出，與對(duì)照相比，添加根系分泌物母液粗提物后促進(jìn)了病原菌生長(zhǎng)，增幅達(dá)到16.8%，對(duì)拮抗菌的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到29.4%。2.2根系分泌物中主要酚酸類物質(zhì)鑒定與含量測(cè)定

目前根據(jù)酚酸的峰面積，只鑒定出兩種含量較高的酚酸類物質(zhì)，其他峰有待于進(jìn)一步鑒定。在酚酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖中，苯甲酸和3-苯丙酸的出峰時(shí)間分別為10.11min和12.92min，通過(guò)對(duì)比根系分泌物和酚酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖的出峰時(shí)間，在根系分泌物UPLC色譜圖中10.10min和12.92min處分別為苯甲酸和3-苯丙酸(圖3)。從表2可以看出，在負(fù)離子模式下，從根系分泌物中分離鑒定出的兩種主要物質(zhì)m/z分別為121.0289和149.0599，與理論值分別相差1.0和4.0ppm，驗(yàn)證兩種物質(zhì)分別為苯甲酸和3-苯丙酸。經(jīng)過(guò)UPLC峰面積對(duì)比，苯甲酸在煙草根系分泌物中的含量為0.25μg/g干根重，3-苯丙酸在煙草根系分泌物中的含量為1.15μg/g干根重。

表1　煙草根系分泌物對(duì)病原菌和拮抗菌生長(zhǎng)的影響

圖3　酚酸標(biāo)準(zhǔn)品(上)和煙草根系分泌物(下)UPLC色譜圖Fig.3　UPLC of standard phenolic acids (upper) and substances in tobacco root exudates (lower)

峰號(hào)PeakNo.負(fù)離子模式Negativeionmode檢測(cè)值(m/z)Obs.mass化學(xué)式Chemicalformula理論值(m/z)Theor.massΔm(ppm)鑒定化合物Tentativeassignment1149.0599C9H10O2149.06034.03-phenylpropanoicacid2121.0289C7H6O2121.02901.0Benzoicacid

2.3添加外源苯甲酸和3-苯丙酸對(duì)液體培養(yǎng)病原菌和拮抗菌的影響

當(dāng)外源添加苯甲酸濃度≤3μg/L時(shí)，苯甲酸能促進(jìn)病原菌(茄科勞爾氏菌)的生長(zhǎng)，分別比對(duì)照處理增加了5.9%(1μg/L)、5.2%(2μg/L)和2.6%(3μg/L); 外源添加4μg/L濃度苯甲酸時(shí)，病原菌濃度與對(duì)照處理之間無(wú)顯著差異; 超過(guò)5μg/L濃度苯甲酸時(shí)，病原菌生長(zhǎng)受到明顯抑制(表3); 當(dāng)外源添加苯甲酸小于等于2μg/L時(shí)促進(jìn)拮抗菌(短短芽孢桿菌)的生長(zhǎng)，促進(jìn)率隨苯甲酸溶液濃度的增加而減小; 當(dāng)苯甲酸濃度超過(guò)2μg/L后拮抗菌的生長(zhǎng)受到抑制，對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到16.6%(3μg/L)和90.2%(4μg/L)，超過(guò)5μg/L后拮抗菌幾乎無(wú)法生長(zhǎng)。5μg/L濃度的苯甲酸溶液對(duì)茄科勞爾氏菌和短短芽孢桿菌的抑制作用分別達(dá)到99.7%和99.9%。病原菌和拮抗菌在10μg/L的苯甲酸溶液中完全不能生長(zhǎng)。

當(dāng)外源添加3-苯丙酸濃度小于等于6μg/L時(shí)，病原菌的生長(zhǎng)得到促進(jìn)，分別比對(duì)照處理增加10.6%(1μg/L)、10.1%(2μg/L)、8.4%(3μg/L)、6.7%(4μg/L)、5.2%(5μg/L)和1.3%(6μg/L)，超過(guò)8μg/L濃度時(shí)，病原菌的生長(zhǎng)受到顯著影響，幾乎不生長(zhǎng)(表3)。當(dāng)外源添加3-苯丙酸濃度小于等于3μg/L時(shí)，促進(jìn)拮抗菌的生長(zhǎng)，分別比對(duì)照處理增加4.2%(1μg/L)、1.3%(2μg/L)和1.2%(3μg/L)，超過(guò)4μg/L時(shí)拮抗菌生長(zhǎng)受到抑制，分別比對(duì)照處理減少31.1%(4μg/L)和37.7%(5μg/L); 7μg/L濃度的3-苯丙酸對(duì)拮抗菌的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，拮抗菌幾乎都不能存活。

2.4添加外源酚酸類物質(zhì)對(duì)土壤病原菌和拮抗菌數(shù)量的影響

表3　不同濃度苯甲酸和3-苯丙酸對(duì)病原菌和拮抗菌生長(zhǎng)的影響(OD600)

注(Note):NA—未得到的數(shù)據(jù)Meansnotavailable. 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平Valuesfollowedbydifferentlettersinacolumnaresignificantamongtreatmentsatthe5%level.

圖4　添加外源苯甲酸對(duì)土壤病原菌和拮抗菌數(shù)量的影響Fig.4.　The effect of exogenous benzoic acid on the population of R. solanacearum and B. brevis

[注(Note): 柱上不同小寫字母表示病原菌處理間差異達(dá)5%顯著水平，不同大寫字母表示拮抗菌處理間差異達(dá)5% 顯著水平Differentsmalllettersabovethebarsmeansignificantatthe5%levelsamongtreatmentsofpathogen,andcapitallettersmeansignificantatthe5%levelsamongtreatmentsofantagonist.]

2.5添加外源苯甲酸和3-苯丙酸對(duì)土壤根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量和微生物群落功能多樣性的影響

4μg/kg的苯甲酸和8μg/kg的3-苯丙酸顯著降低土壤微生物數(shù)量(表4、表5)。當(dāng)苯甲酸的濃度為4μg/kg、5μg/kg時(shí)，土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量分別降低85.2、92.6%、60.7, 76.9%和86.2、92.2%。隨著3-苯丙酸濃度的增加，盡管土壤微生物數(shù)量稍有下降趨勢(shì)，但處理間無(wú)顯著差異。當(dāng)3-苯丙酸濃度達(dá)到8μg/kg時(shí)，與對(duì)照相比，土壤微生物數(shù)量顯著下降。4μg/kg的苯甲酸或7μg/kg的3-苯丙酸是土壤微生物多樣性和均勻度顯著下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，添加4μg/kg的苯甲酸土壤Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)分別僅為對(duì)照的57.6%、88.1%和73.3%，添加7μg/kg的3-苯丙酸土壤Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)分別僅為對(duì)照的94.1%、97.6%和80.1%。

圖5　添加外源3-苯丙酸對(duì)土壤病原菌和拮抗菌數(shù)量的影響Fig.5.　The effect of exogenous 3-phenylpropanoic acid on the population of R. solanacearum and B. brevis

[注(Note): 柱上不同小寫字母表示病原菌處理間差異達(dá)5%顯著水平，不同大寫字母表示拮抗菌處理間差異達(dá)5%顯著水平Differentsmalllettersabovethebarsmeansignificantatthe5%levelamongtreatmentsofpathogen,andcapitallettersmeansignificantatthe5%levelamongtreatmentsofantagonist.]

表4　添加外源苯甲酸后土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量和微生物群落功能多樣性

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平Valuesfollowedbydifferentlettersinacolumnaresignificantamongtreatmentsatthe5%level.

表5　添加外源3-苯丙酸后土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量和微生物群落功能多樣性

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平Valuesfollowedbydifferentlettersinacolumnaresignificantamongtreatmentsatthe5%level.

3　討論

近年來(lái)研究表明，化感物質(zhì)不但引起作物自毒作用，同樣會(huì)導(dǎo)致病害的暴發(fā)流行[24]。目前，研究煙草根系分泌物的種類和含量，以及主要酚酸類物質(zhì)對(duì)根際微生物特別是對(duì)土傳病害病原菌和拮抗菌生長(zhǎng)影響方面的系統(tǒng)研究還較少，并主要集中在根系粗提物的極性分離，以及不同極性的根系粗提物對(duì)煙苗生長(zhǎng)、土壤酶活性等的影響方面[8]。植物賴以生存的土壤中聚集著大量微生物，其中既有有益微生物，也有病原微生物。根系分泌物中豐富的糖類、氨基酸類、有機(jī)酸及酚酸等物質(zhì)，為植物根際土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供了充足的營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也影響著土壤微生物的種類、數(shù)量及其在植物根際的分布。研究發(fā)現(xiàn)，不同土壤微生物在根際的定殖受根系分泌物的影響而表現(xiàn)出明顯的根際效應(yīng)[25-26]。而且，根系分泌物還對(duì)根際微生物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生影響。韓雪等[5]研究不同黃瓜品種的根系分泌物對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)及病原菌生物量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗枯萎病黃瓜品種的根系分泌物對(duì)上述指標(biāo)均有明顯的抑制作用，而感病品種則相反。韓麗梅等[27]研究大豆連作土壤中有機(jī)物對(duì)大豆根腐病菌的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤中酚酸組分對(duì)尖孢鐮刀菌等三種病菌的生長(zhǎng)多表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用; 同時(shí)，根系分泌物中的有機(jī)酸與酚酸類物質(zhì)使連作土壤理化特性改變，引發(fā)根際土壤pH值降低，也對(duì)根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的變化產(chǎn)生較大影響，因此長(zhǎng)期連作導(dǎo)致土傳病害的暴發(fā)流行[28]。根系分泌物中的酚類與酚酸類物質(zhì)在作物自毒現(xiàn)象和連作障礙中扮演非常重要的角色，多種酚酸類物質(zhì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育都起到抑制的作用[29-31]。本試驗(yàn)以煙草根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)為主要研究對(duì)象，在煙草根系分泌物中分離、篩選鑒定到兩種主要酚酸類物質(zhì)(苯甲酸和3-苯丙酸)，補(bǔ)充了煙草根系分泌物已有的關(guān)于其他酚酸類物質(zhì)的研究?jī)?nèi)容。

不同濃度的酚酸對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖起著不同的作用。馬瑞霞等研究[32]指出，當(dāng)反式-阿魏酸的濃度分別達(dá)到5.149, 2.575和0.257mmol/L時(shí)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的生長(zhǎng)和反硝化作用受到顯著影響; 而當(dāng)苯甲酸的濃度為4.09 和8.189mmol/L時(shí)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)得到顯著促進(jìn)。高欣欣等[33]分離并鑒定烤煙根系分泌物中存在苯甲酸、肉桂酸、反丁烯二酸和琥珀酸等，并分析測(cè)定了這些酚酸類物質(zhì)對(duì)煙草種子和出芽的化感作用，研究表明，苯甲酸能夠顯著抑制煙苗的生長(zhǎng)、種子萌發(fā)及煙葉品質(zhì)，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。本試驗(yàn)探索了不同種類、不同濃度的酚酸類物質(zhì)對(duì)病原菌和兩株拮抗菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，低濃度的苯甲酸和3-苯丙酸能夠促進(jìn)病原菌和拮抗菌的生長(zhǎng)，而高濃度則同時(shí)抑制這兩種微生物的生長(zhǎng)。另外，苯甲酸對(duì)病原菌的抑制濃度大于拮抗菌，這可能是由于不同微生物對(duì)酚酸類物質(zhì)濃度的響應(yīng)不同造成的; 譚秀梅等[34]的研究也得到類似的結(jié)果，即隨著外源物質(zhì)濃度的升高，土壤微生物數(shù)量具有先增加后降低的趨勢(shì)。Qu等[35]研究表明，2,4-二叔丁基苯酚和香草酸的加入對(duì)微生物量同樣存在低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用。郝文雅等[36]發(fā)現(xiàn)西瓜根系分泌物能夠增加尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)孢子萌發(fā)的數(shù)量，并增強(qiáng)其繁殖能力。本試驗(yàn)中計(jì)算得到根系分泌物中的苯甲酸含量為0.25μg/g干根重，而在田間實(shí)際生產(chǎn)中，正常的煙株旺長(zhǎng)期的根干重約為12g左右[37]，即每株煙旺長(zhǎng)期的苯甲酸分泌量約為3μg/kg根際土。試驗(yàn)結(jié)果中3μg/kg的苯甲酸對(duì)土壤中的病原菌生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但對(duì)拮抗菌的生長(zhǎng)卻起到抑制作用，表明田間實(shí)際生產(chǎn)中，煙株正常分泌的苯甲酸對(duì)病原菌具有正向趨向作用，而對(duì)拮抗菌卻具有排斥作用。3-苯丙酸在煙草根系分泌物中的含量為1.15μg/g干根重，每株煙旺長(zhǎng)期的3-苯丙酸分泌量為13.8μg/kg，超出試驗(yàn)中設(shè)置的最大量8μg/kg的3-苯丙酸，可能會(huì)同時(shí)抑制土壤中的病原菌和拮抗菌的生長(zhǎng)。根系分泌物中含有多種物質(zhì)，可能會(huì)對(duì)濃度較高的某一種物質(zhì)具有緩沖性，而單一添加3-苯丙酸時(shí)，這種緩沖作用消失，有可能造成比理論分界點(diǎn)偏低的現(xiàn)象。

在本研究中，4μg/kg的苯甲酸或8μg/kg的3-苯丙酸可以顯著減少土壤微生物包括細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量。根際微生物的活性與根系分泌物的種類和數(shù)量密切相關(guān)，根系分泌物對(duì)根際土壤中的微生物種類及數(shù)量有著特異性和非特異性的影響，在多數(shù)情況下，根系分泌物對(duì)根際微生物的影響是非特異性的，它對(duì)微生物物趨向有著誘導(dǎo)的作用。革蘭氏陰性無(wú)芽孢細(xì)菌會(huì)受到根系分泌物的誘導(dǎo)向根際聚集[38]。Sushma[39]的研究表明，根際促生菌熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)會(huì)受到番茄根系分泌物中主要成分檸檬酸和蘋果酸的誘導(dǎo)定殖，即趨化現(xiàn)象。本試驗(yàn)中的茄科勞爾氏菌屬于革蘭氏無(wú)芽孢細(xì)菌，而拮抗菌Brevibacillus brevis為革蘭氏陽(yáng)性菌，因此，煙草根系分泌物對(duì)病原菌的誘導(dǎo)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)拮抗菌的誘導(dǎo)性，使得病原菌比拮抗菌更易定殖在煙株根際。

根系分泌物對(duì)根際土壤的微生物多樣性和豐富度作用顯著[40]，根系分泌物調(diào)節(jié)并決定著根系與土壤微生物間的生物、化學(xué)、物理等相關(guān)關(guān)系，在根系-微生物互作過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[41-42]?；凶饔猛ㄟ^(guò)改變根際土壤中微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)間接影響微生態(tài)平衡[43-44]，調(diào)控病原菌的生長(zhǎng)與致病性。特定的根系分泌物決定著土壤中主要的微生物群落種類，在連作條件下，土壤微生物群落多樣性降低，有益微生物減少甚至滅亡，病原微生物增加[9]?？挛妮x[45]認(rèn)為在煙草連作障礙土壤中存在化感自毒物質(zhì)，隨著這些自毒物質(zhì)逐漸積累，可以顯著降低土壤微生物群落多樣性，增加病原微生物數(shù)量，破壞土壤微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，降低根系的代謝活動(dòng)及營(yíng)養(yǎng)元素的有效性，最終導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量下降。本試驗(yàn)中當(dāng)苯甲酸的濃度為4μg/kg、5μg/kg時(shí)，土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量分別降低了85.2%、92.6%，60.7%和76.9%、 86.2%、92.2%。在一定濃度下，隨著3-苯丙酸濃度的增加，盡管土壤微生物濃度稍有下降趨勢(shì)，但處理間無(wú)顯著差異。當(dāng)3-苯丙酸濃度達(dá)到8μg/kg時(shí)，與對(duì)照相比，土壤微生物數(shù)量顯著下降。土壤的微生物活性分別由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)表征，反映土壤微生物功能多樣性。4μg/kg的苯甲酸或7μg/kg的3-苯丙酸是土壤微生物多樣性和均勻度顯著下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。當(dāng)土壤中接種低濃度的苯甲酸和3-苯丙酸時(shí)，土壤微生物對(duì)BiologECO板中的底物利用率較高。與液體培養(yǎng)基不同的是，土壤能夠緩沖酚酸類物質(zhì)對(duì)微生物的抑制作用。因此，土壤接種苯甲酸和3-苯丙酸后對(duì)土壤微生物生長(zhǎng)的抑制濃度略大于液體培養(yǎng)基。

4　結(jié)論

通過(guò)UPLC-Q-TOF/MS，在煙草根系分泌物中分離、篩選到兩種主要酚酸類物質(zhì)為苯甲酸和3-苯丙酸; 液體培養(yǎng)條件下，對(duì)茄科勞爾氏菌具有促進(jìn)作用的酚酸濃度分別為3μg/L苯甲酸和6μg/L3-苯丙酸，顯著高于對(duì)拮抗菌短短芽孢桿菌有促進(jìn)作用的酚酸濃度; 土壤外源添加3μg/kg的苯甲酸或8μg/kg的3-苯丙酸時(shí)，土壤病原菌數(shù)量增加而拮抗菌數(shù)量減少，同時(shí)土壤微生物功能多樣性降低; 與拮抗菌相比，煙草青枯病病原菌可以更好地利用煙草根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)，從而比拮抗菌更易定殖于煙株根際，這可能是連作障礙造成土傳病害暴發(fā)流行的機(jī)理之一。

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LIUYan-xia,LIXiang,CAILiu-ti,ZHANGHeng,SHIJun-xiong﹡

(Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550000, China)

【Objectives】Tobaccocontinuousmono-croppinghascausedveryseriousproblems,includingsoil-bornediseaseoutbreak,tobaccogrowthsuppression,yieldreductionandqualitydecline.Allelopathycomesfromtobaccoandsoilmicroorganismsmaybeoneofthemostimportantreasonsleadingtomono-croppingobstacle.Tobaccorootexudates(TRE)playakeyroleintheplant-microorganisminteractionsintherhizosphere.Itisofgreatimportancetoexploreeffectoftobaccorootexudatesonrhizospheremicroorganisms. 【Methods】Inthisstudy,themainphenolicacidswerescreenedandidentifiedbytheUPLC-Q-TOF/MSmethod,andtheircontentsintobaccorootexudateswereevaluated.EffectofidentifiedphenolicacidsfromTREinliqiudmediumonpathogenanditsantagonistwasinvestigatedbyapplyingexogenousphenolicacids.Besides,thesoilwasaddedwiththeidentifiedphenolicacidsandculturedfor3d.Afterthat,therhizospheremicrobialdiversitiesandcounts,especiallythepopulationofpathogenRalstonia solanacearumanditsantagonistBrevibacillus brevisinthesoilweremeasured. 【Results】 1)Thetobaccorootexudatespromotethegrowthofpathogenby16.8%andsuppressthegrowthofantagonistby29.4%. 2)TwophenolicacidsarescreenedandidentifiedbyUPLC-Q-TOF/MSwiththeconcentrationsof0.25μg/gand1.15μg/gdryroot,respectively. 3)Whentheexogenousphenolicacidswereaddedtotheculturemedia,lowconcentrationsofbenzoicacid(≤2μg/L)and3-phenylpropanoicacid(≤3μg/L)promotethegrowthofthepathogenandantagonist,andthe4μg/LbenzoicaciddoesnotsignificantlyaffectR. solanacearum,whereasthepopulationofantagonistisdecreasedby90.2%.The6μg/L3-phenylpropanoicacidpromotesthegrowthofthepathogenwhileinhibitsthegrowthofantagonistby81.1%.Highconcentrationsofbenzoicacid(≥ 4μg/L)and3-phenylpropanoicacid(≥ 7μg/L)significantlysuppressthepathogenandantagonist. 4)Whenthesoilisappliedwiththe3μg/kgbenzoicacid,thepathogencountwasincreasedby12.3%whiletheantagonistpopulationisdecreasedby21.0%.Besides,thepopulationsofsoilbacteria,actinomycetesandfungiaredeclinedby37.5%，41.9%and55.6%,respectively.The8μg/kg3-phenylpropanoicacidsignificantlysuppressestheantagonistgrowthby14.5%,anddoesnotsignificantlyaffectthepathogen.Soilbacteria,actinomycetesandfungiaredecreasedby69.9%, 57.2%and80.7%,respectivelyunderthisconcentrationof3-phenylpropanoicacid. 5)Afterthe4μg/kgbenzoicacidor7μg/kg3-phenylpropanoicacidapplicationtothesoil,theShannonindex,SimpsonindexandMcIntoshindexaresignificantlydeclinedto57.7%, 88.1%, 73.3%and94.1%, 97.6%, 80.0%ofCK. 【Conclusions】Thetobaccorootexudatespromotethepathogengrowthwhereassuppresstheantagonistgrowth.Themainphenolicacidsintobaccorootexudatesarebenzoicacidand3-phenylpropanoicacid.The4μg/Lexogenousbenzoicacidor6μg/Lexogenous3-phenylpropanoicacidaretheboundaryconcentrations,whichdonotsignificantlysuppressthegrowthofpathogenbutinhibitstheantagonist.Whenbenzoicacidand3-phenylpropanoicacidareappliedtothesoil,thegrowthofpathogenispromoted,whiletheantagonistpopulationandtherhizo-microbialfunctionaldiversityaresignificantlyreducedunderthe3μg/kgbenzoicacidor8μg/kg3-phenylpropanoicacid.Pathogencouldsurviveundertheconditionoftobaccorootexudates,ratherthanantagonist.Thismaybeanexplanationoftobaccobacterialwiltoutbreakresultedfrommono-croppingobstacle.Keywords:tobaccorootexudates;pathogen;antagonist;rhizospheremicroorganism;

2014-10-28接受日期: 2014-12-30網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-07-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(41461068); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103004); 中國(guó)煙草總公司重點(diǎn)項(xiàng)目(110201002019); 貴州省煙草總公司重點(diǎn)項(xiàng)目(201410); 貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2013]2197號(hào)和2198號(hào))資助。

劉艷霞(1982—)，女，河北張家口人，博士，副研究員，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)、土壤微生物區(qū)系分析等研究。

E-mail:liuyanxia306@163.com。*通信作者E-mail:sjx2196@163.com

S572.01;S154.37

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1008-505X(2016)02-0418-11