金針菇下腳料多糖脫色工藝及其抑菌活性

陳義勇，黃友如，劉晶晶，鄭麗雪，冀宏，邱麗青，曹亞軍（.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟5500；.張家港市常興菌業(yè)有限公司，江蘇張家港563）

金針菇下腳料多糖脫色工藝及其抑菌活性

陳義勇1，黃友如1，劉晶晶1，鄭麗雪1，冀宏1，邱麗青1，曹亞軍2
（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.張家港市常興菌業(yè)有限公司，江蘇張家港215623）

以金針菇下腳料為原料，采用水浴浸提法提取金針菇多糖，以蛋白脫除率、多糖保留率和脫色率為指標(biāo)，探討金針菇下腳料多糖聚酰胺柱層析脫色工藝，并對金針菇下腳料多糖的抑菌活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：聚酰胺層析法為金針菇下腳料多糖最佳的脫蛋白方法，其脫色的最佳工藝條件為：聚酰胺用量為50 g，聚酰胺柱用1.5倍柱體積的去離子水以1.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，在此工藝條件下，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到94.2%。金針菇下腳料多糖對黑曲霉和釀酒酵母沒有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為2.25、5、2.25 mg/mL，且抑菌活性與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

金針菇下腳料多糖；聚酰胺層析；脫色；抑菌

金針菇（Flammulina velutipes）又名樸菇、冬菇，隸屬真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口磨科，金錢菌屬，目前已發(fā)展成為世界第三大食用菌[1]。研究表明金針菇多糖具有增強(qiáng)免疫力[2-3]、改善記憶[4]、護(hù)肝[5-6]、抗腫瘤[7-8]等功效。金針菇加工過程中會產(chǎn)生菌柄、菌蓋、畸形菇等下腳料，大多未經(jīng)處理而直接丟棄，既污染環(huán)境又造成極大的浪費(fèi)[9]，目前關(guān)于金針菇下腳料多糖（Polysaccharides from Flammulina velutipes scraps，F(xiàn)VSP）的提取大多采用水浴法和微波輔助提取法[10]，在多糖提取過程中，提取物中會含有較多的蛋白質(zhì)和色素，對金針菇下腳料多糖脫色和脫蛋白是其精制過程中非常重要的一步，是研究其理化性質(zhì)、生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。

為了獲得純度較高的金針菇下腳料多糖，以金針菇下腳料為原料，探討金針菇下腳料多糖的聚酰胺層析脫色工藝，另外關(guān)于金針菇下腳料多糖的抑菌活性研究還鮮見報道，所以在金針菇下腳料多糖脫色的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其抑菌活性，旨在為開發(fā)金針菇下腳料多糖天然防腐劑提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金針菇下腳料：張家港市常興菌業(yè)有限公司提供；聚酰胺：中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；DPPH：上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；水楊酸、濃硫酸、95%乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、鹽酸、Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH8.2）、鄰苯三酚、正丁醇、三氯甲烷、葡萄糖、苯酚等均為分析純；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：常熟理工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；細(xì)菌培養(yǎng)基、霉菌馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）、酵母培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基），參照文獻(xiàn)配制[11]。

1.2主要儀器

RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器公司；DJ-04粉碎機(jī)：上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司；TU-1091型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；LD4-ZA型離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SHB-B循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)公司；LGJ-10冷凍干燥儀：南京百思威科技有限公司；UV2102 PCS紫外掃描儀：上海精密儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1金針菇下腳料的預(yù)處理

金針菇下腳料在50℃條件下真空干燥后粉碎，過80目篩，得到預(yù)處理的金針菇下腳料粉。

1.3.2金針菇下腳料多糖的提取

稱取金針菇下腳料粉10 g，放入燒杯中，然后加入300 mL水，在80℃條件下提取3 h，然后冷卻，將提取液離心（4 000 r/min）15 min，棄去沉淀，將上清液減壓濃縮，按體積比1∶4加入95%乙醇，4℃條件下過夜，棄去上層液體，將沉淀冷凍干燥得到金針菇下腳料多糖。

1.3.3蛋白質(zhì)含量測定

福林-酚法[12]。

1.3.4多糖含量測定

苯酚-硫酸法[13]。

1.3.5金針菇下腳料多糖中蛋白的脫除

1.3.5.1Sevage法

稱取20 mg金針菇下腳料多糖，加入蒸餾水配制成10%的多糖溶液，按照金針菇下腳料多糖溶液的1/ 4體積加入Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），在25℃下混合振蕩40 min，然后離心（1 000 r/min，15 min）去沉淀，將上清液再按上述比例加入Sevage試劑，重復(fù)操作6次，測定上清液中的蛋白質(zhì)含量和多糖含量，根據(jù)公式（1）和（2）計(jì)算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.5.2三氯乙酸法

稱取20 mg金針菇下腳料多糖，加入蒸餾水配制成10%的多糖溶液，然后向多糖溶液加入三氯醋酸（3%），直至溶液不再繼續(xù)渾濁為止，4℃條件下放置過夜，然后離心（1 000 r/min，15 min），棄去沉淀，測定上清液中的蛋白質(zhì)和多糖含量，根據(jù)公式（1）和（2）計(jì)算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.5.3聚酰胺層析法

稱取50 g聚酰胺，倒入一定量的去離子水中加熱15 min，然后裝層析柱（4 cm×58 cm），最后用去離子水洗脫平衡，然后稱取20mg金針菇下腳料多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，將多糖溶液上柱，用去離子水洗脫，測定洗脫液中的蛋白質(zhì)含量和多糖含量，根據(jù)公式（1）和（2）計(jì)算多糖保留率和蛋白質(zhì)的脫除率。

1.3.6金針菇下腳料多糖聚酰胺層析脫色條件的優(yōu)化1.3.6.1去離子水用量對脫色效果的影響

稱取40 mg金針菇下腳料多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，然后添加到40 g的聚酰胺柱（40 mm×580 mm）中進(jìn)行吸附，用0.5、1、1.5、2、2.5倍柱體積的去離子水以1.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，359 nm處測定多糖原液和洗脫液吸光值計(jì)算脫色率，根據(jù)下面公式（3）計(jì)算脫色率[14]，苯酚-硫酸法檢測多糖，根據(jù)公式（1）計(jì)算多糖保留率，探討去離子水用量對脫色效果的影響。

1.3.6.2聚酰胺用量對脫色效果的影響

稱取40 mg金針菇下腳料多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，然后分別將10、30、50、70、90 g的聚酰胺倒入一定量的去離子水中加熱10 min，分別裝層析柱（4 cm×58 cm），去離子水洗脫平衡。分別將多糖溶液加入聚酰胺層析柱中進(jìn)行吸附，1倍柱體積的去離子水以1.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，分別計(jì)算脫色率和多糖保留率，探討去聚酰胺水用量對脫色效果的影響。

1.3.6.3洗脫速度對脫色效果的影響

不清楚。云夢說，她剛剛大學(xué)畢業(yè)，想在這里找一份工作……可是工作哪有這么好找？何況她眼高手低。所以我想，少則一兩個月，多則一年半載吧！

稱取40 mg金針菇下腳料多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，然后添加到40 g的聚酰胺柱（40 mm×580 mm）中進(jìn)行吸附，以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，分別計(jì)算脫色率和多糖保留率，探討洗脫速度對脫色效果的影響。

1.3.7紫外光譜檢測

稱取40 mg金針菇下腳料多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，在聚酰胺層析脫色最佳條件下，將金針菇下腳料多糖溶液上聚酰胺色譜柱，蒸餾水進(jìn)行洗脫，紫外光譜對洗脫液進(jìn)行掃描（波長范圍：190 nm～800 nm），來探討聚酰胺層析對金針菇下腳料多糖中蛋白質(zhì)的去除效果，根據(jù)公式（2）計(jì)算蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.8金針菇下腳料多糖的抑菌活性

1.3.8.1菌種活化與菌懸液制備[15]

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種到細(xì)菌培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h；將黑曲霉和釀酒酵母分別接種到PDA培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)48 h，長出菌落后，分別挑取活化后的菌種放入9 mL無菌生理鹽水中，振蕩搖勻制備菌懸液，濃度約為106CFU/mL～108CFU/mL備用。

1.3.8.2抑菌試驗(yàn)

用無菌水配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的金針菇下腳料多糖溶液。分別稀釋成40、20、10、5、2.25 mg/mL系列質(zhì)量濃度溶液。取供試菌懸液0.1 mL（濃度約為106CFU/mL）置于倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放入牛津杯，向牛津杯中加入不同質(zhì)量濃度的多糖溶液200μL，每個質(zhì)量濃度做3次重復(fù)，同時用無菌水做對照。細(xì)菌于37℃培養(yǎng)48 h，真菌于28℃培養(yǎng)72 h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑，出現(xiàn)抑菌圈所對應(yīng)的金針菇下腳料多糖濃度即為最小抑菌圈濃度。

2　結(jié)果與討論

采用三氯乙酸法、Sevage法和聚酰胺吸附柱層析法對金針菇下腳料多糖中的蛋白脫除效果見圖1。

從圖1可以看出，三氯乙酸法蛋白脫除率和多糖保留率都較低，易引起多糖的降解。Sevage法脫除蛋白次數(shù)較多（6次），導(dǎo)致多糖損失較多，聚酰胺吸附柱層析法具有較好的脫除蛋白的效果，蛋白脫除率達(dá)91.9%，且對多糖影響較小，多糖保留率較高，達(dá)到86.9%，所以選擇聚酰胺吸附柱層析法作為金針菇下腳料多糖脫蛋白的方法。

圖1　金針菇下腳料多糖不同脫蛋白方法的比較Fig.1　Comparision ofdeproteinization of FVSP by different methods

2.2金針菇下腳料多糖的脫色

2.2.1去離子水用量對脫色效果的影響

去離子水用量對脫色效果的影響結(jié)果見圖2。

圖2　洗脫體積對金針菇下腳料多糖脫色效果的影響Fig.2　Effect of elution volume on decolorization of PVSP

從圖2可知，隨著洗脫體積的增加，金針菇下腳料多糖脫色率逐步下降，但是多糖保留率逐漸增加，當(dāng)洗脫體積達(dá)到1.5倍柱體積時，其脫色率達(dá)到48.6%，多糖保留率為88.3%，洗脫體積大于1.5倍柱體積時，多糖保留率變化不大，因此選用1.5倍柱體積的去離子水進(jìn)行洗脫。

2.2.2聚酰胺用量對脫色效果的影響

聚酰胺用量對金針菇下腳料多糖脫色效果的影響結(jié)果見圖3。

圖3　聚酰胺用量對金針菇下腳料多糖脫色效果的影響Fig.3　Effectof polyamide dosage on decolorization of FVSP

從圖3可以看出，隨著聚酰胺用量的增加，脫色率逐步增大，多糖的保留率逐漸下降，當(dāng)聚酰胺用量超過50 g，多糖脫色率變化不大，但多糖的保留率有較大的下降，為了盡可能多地保留多糖，節(jié)約處理費(fèi)用，確定聚酰胺用量為50 g。

2.2.3洗脫速度對脫色效果的影響

洗脫速度對脫色效果的影響結(jié)果見圖4。

圖4　洗脫速度對金針菇下腳料多糖脫色效果的影響Fig.4　Effect of flow rate on decolorization of FVSP

從圖4可知，洗脫速度對脫色率沒有明顯的影響，但是隨洗脫速度的增大，多糖的保留率逐漸減小，當(dāng)洗脫速度小于1.5 mL/min時，多糖的保留率變化不大。由于洗脫速度越小，耗時越長，所以選擇的洗脫速度為1.5 mL/min。

通過金針菇下腳料多糖脫色試驗(yàn)，最終確定聚酰胺對金針菇下腳料多糖脫色的最佳工藝條件為：聚酰胺用量為50 g，聚酰胺柱用1.5倍柱體積的去離子水以1.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。

2.3紫外光譜

金針菇下腳料多糖脫蛋白前后的紫外光譜圖見圖5。

圖5　金針菇下腳料多糖的紫外光譜圖Fig.5　UV spectrum of FVSP

從圖5可以看出，金針菇下腳料粗多糖在280 nm處有一個較為明顯的吸收峰。在最佳聚酰胺柱層析脫色條件下，經(jīng)過聚酰胺色譜柱處理之后，這個峰消失，經(jīng)福林-酚法[12]測定后，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到94.2%。

2.4金針菇下腳料多糖的抑菌活性

金針菇下腳料多糖的抑菌效果見表1。

從表1可以看出，金針菇下腳料多糖對黑曲霉和釀酒酵母沒有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用，且抑菌活性與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，其中對金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，對大腸桿菌的抑制作用最弱。金針菇下腳料多糖對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為2.25 mg/mL，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為5 mg/mL。

表1　金針菇下腳料多糖對各菌種的抑菌效果Table 1　Antimicrobialresults of FVSP againstdifferent microorganisms

3　結(jié)論

1）確定聚酰胺吸附柱層析法作為金針菇下腳料多糖脫蛋白的最佳方法。

2）確定聚酰胺柱層析對金針菇下腳料多糖脫色的最佳工藝條件為：聚酰胺用量為50 g，聚酰胺柱用1.5倍柱體積的去離子水以1.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，在此條件下，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到94.2%。

3）金針菇下腳料多糖對黑曲霉和釀酒酵母沒有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用，且抑菌活性與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，其中對金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，對大腸桿菌的抑制作用最弱。金針菇下腳料多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為2.25、5、2.25 mg/mL。

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Decolorization Technology of Polysaccharides from Flammulina velutipes Scraps and Its Antibacterial Activity

CHEN Yi-yong1，HUANG You-ru1，LIU Jing-jing1，ZHENG Li-xue1，JIHong1，QIU Li-qing1，CAO Ya-jun2
（1.SchoolofBiology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Zhangjiagang Changxing Edible Fungi Co.，Ltd.，Zhangjiagang 215623，Jiangsu，China）

Flammulina velutipes scraps was used as raw materials.Polysaccharides from Flammulina velutipes scraps（FVSP）were extracted with water.Deprotein rate，polysaccharide retention rate and decoloration rate were used as the index.Decolorization technology of FVSP by polyamide chromatography was investigated.Antibacterial activity of FVSP was also explored.The results showed that polyamide chromatography was the best deproteinization method on FVSP.The optimum decolorization technology was as follows：the content of polyamide was 50 g，and the polyamide column was eluted with 1.5 column volumes of deionized water at flow rate of1.5 mL/min.Under this technology，the deprotein rate was 94.2%.FVSP had no antimicrobialactivity of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae and had antibacterialactivities against Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Bacillus subtilis with minimum inhibitory concentration of2.25，5，2.25 mg/mL，respectively．The antibacterialactivity was positively correlated with polysaccharides concentration.

polysaccharides from Flammulina velutipes scraps；polyamide chromatography；decolorization；antibacterial

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.019

2014年度國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2014GA690011）；張家港市2013年度科技支撐計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目（ZKN1304）

陳義勇（1974—），男（漢），副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，主要從事食品科學(xué)與天然活性成分方面的研究。

2015-04-22