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    miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表達及其臨床意義

    2016-08-23 10:23:46劉志惠
    食管疾病 2016年4期
    關(guān)鍵詞:卵巢癌試劑盒引物

    劉志惠,劉 平

    miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表達及其臨床意義

    劉志惠,劉 平

    目的 探討miR-146a和miR-146b在卵巢癌癌組織及配對的癌旁組織中的表達,及其與臨床病理特征的相關(guān)性。方法 收集2013年1月至2015年10月我院38例卵巢癌和配對的癌旁組織,運用RT-PCR的方法檢測38對卵巢癌癌組織及其癌旁組織miR-146a和miR-146b的表達,分析其與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性及其臨床意義。結(jié)果 熒光定量PCR顯示卵巢癌癌組織中miR-146a和miR-146b的平均表達量(6.74±2.74)和(6.34±2.14)比癌旁組織的平均表達量(7.08±1.70)和(7.26±2.59)明顯下調(diào)(均P<0.05)。miR-146a和miR-146b的表達與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在負相關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論 miR-146a和miR-146b的表達下調(diào)在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

    卵巢癌;miR-146a;miR-146b;臨床分期;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

    與癌癥相關(guān)的女性死亡病例中,卵巢癌排在第五位。大約80%的卵巢癌發(fā)現(xiàn)時已是晚期,其中大多數(shù)患者存活時間不超過5 a[1]。臨床上經(jīng)常使用的CA125、CEA等腫瘤標記物敏感性、特異性較差,對卵巢癌的早期診斷幫助不大[1]。近年來由于對miRNA認識的不斷深入,其中在卵巢腫瘤的研究領(lǐng)域miRNA與卵巢癌關(guān)系的研究,包括卵巢癌的發(fā)病機制、早期診斷、治療、化療耐藥、預(yù)后判斷等諸多方面[2]。本研究探討miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表達及其與臨床病理特征的相關(guān)性,報道如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料1.1.1 樣本和臨床病理資料的收集 收集2013年1月至2015年10月南陽市第二人民醫(yī)院婦科接受根治性卵巢切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)清掃的38例卵巢癌患者,年齡38~76歲,中位數(shù)53.2歲。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(Federation International of Gynecology and Obstetrics, FIGO)的診斷標準,38例卵巢癌病例中24例為Ⅰ期患者,14例Ⅱ期患者;15例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,23例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;透明細胞癌3例,漿液性癌32例,子宮內(nèi)膜樣癌3例。13例分化良好(GradeⅠ級,G1),18例中度分化(Grade Ⅱ級,G2),7例低分化(Grade Ⅲ級,G3)。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療;所有病例均有病理組織學(xué)診斷支持;所有標本都于手術(shù)取材后第一時間儲存在-80 ℃條件下。

    1.1.2 試劑與儀器 miRNeasy提取試劑盒(Qiagen,美國),miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(諾維贊生物公司,南京),Biotek Epoch微量核酸定量儀購自美國Biotek公司,7500熒光定量PCR儀購自ABI 公司。

    1.1.3 RT-PCR檢測基因 miRNA-146a和miRNA-146b的引物序列通過PCR引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計has-miR-146a、has-miR-146b和U6的引物序列,具體序列如下:has-miR-146a-5p:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′,has-miR-146b-5p:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3′,U6:5′-GCTTCGGC AGCACATATACTAAA-3′,并由Life Technologies公司合成。引物干粉離心后用DEPC水配制成20 μmol·L-1,置于-20 ℃冰箱備用。

    1.2 方法

    1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 使用miRNeasy提取試劑盒對癌組織及癌旁組織中的microRNA進行提取。運用分光光度法對RNA 進行定量。按照Genecopoeia公司的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對miRNA進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由1 μg的總RNA,與10 μL 2×RT mix,2 μL mix,1 μL oligod NTPs,1 μL Random hexamers,總體系20 μL。 25 ℃ 5 min,50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。

    1.2.2 RT-PCR檢測miRNA-146a和miRNA-146b

    使用Taqman miRNA探針對miR-146a-5p and miR-146b-5p進行檢測,具體操作步驟按照操作說明進行,以2-ΔΔCt表示基因的相對表達水平。實時PCR體系為 20 μL,包含2 μL反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,引物2 μL,反向引物2 μL,2×mix 10 μL,去RNA酶的純水4 μL。1個循環(huán)包括95 ℃30 s、95 ℃5 s和60 ℃30 s,總共40個循環(huán)。所有樣本均設(shè)3個復(fù)孔。

    2 結(jié)果

    2.1 miRNA-146a和miRNA-146b的表達 卵巢癌組織中miRNA-146a和miRNA-146b的平均表達量為(6.74±2.74)和(6.34±2.14),低于卵巢癌癌旁組織中miRNA-146a和miRNA-146b的平均表達量(7.08±1.70)和(7.26±2.59),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.189,P=0.036;t=2.535,P=0.016),見圖1。

    A:miR-146a表達量 B:miR-146b表達量圖1 miR-146a和miR-146b實時熒光定量PCR結(jié)果

    2.2 二者臨床病理特征的相關(guān)性 腫瘤組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移miRNA-146a和miRNA-146b表達水平越低。miRNA-146a與臨床分期亦呈負相關(guān)(P=0.039),即臨床分期越差,miRNA-146表達水平越低,見表1。

    表1 miR-146a和miR-146b的表達與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性

    3 討論

    miRNA通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達控制腫瘤細胞的生長發(fā)育、凋亡、增殖、血管形成、侵襲遷移等生物學(xué)過程,從而調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中miRNA亦扮演著重要的角色。Iorio等[5]發(fā)現(xiàn),不同的卵巢癌組織學(xué)類型、脈管浸潤等病理特征決定著miRNA的表達譜。如在透明細胞癌、漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌中miR-200a和miR-200c均呈高表達,而在漿液性和子宮內(nèi)膜樣癌中miR-141和miR-200b呈高表達。因此,miRNA對于鑒別正常卵巢組織與癌變卵巢組織有幫助,甚至可以區(qū)分癌的組織學(xué)類型。

    研究發(fā)現(xiàn)在p53活性受抑制鼠的卵巢上皮中miR-34b和miR-34c表達水平明顯下調(diào)[6-7],基因測序發(fā)現(xiàn)在miRNA編碼區(qū)上游處存在p53的結(jié)合位點;隨后對人的p53陰性卵巢癌癌細胞進行分析發(fā)現(xiàn)miR-34b和miR-34c表達水平下調(diào);用多柔比星處理野生型p53陽性卵巢癌癌細胞,由此推測在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中miR-34家族具有類似抑癌基因的作用。本研究顯示卵巢癌癌組織中miR-146a和miR-146b的平均表達量(6.74±2.74)和(6.34±2.14),比癌旁組織的平均表達量(7.08±1.70)和(7.26±2.59)明顯下調(diào)(均P<0.05),提示miR-146a和miR-146b的表達下調(diào)可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

    不同的miRNA可通過不同作用機制對卵巢癌的發(fā)展產(chǎn)生促進或抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-200通過抑制腫瘤血管形成、上調(diào)鈣黏蛋白的表達等兩個方面抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[8-10]。Chen 等[11]研究發(fā)現(xiàn),在卵巢癌細胞中miR-429過表達,可逆轉(zhuǎn)間葉組織向上皮組織過渡,進而促進卵巢癌轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)miR-200c 高表達的患者,2 a生存率顯著升高,與之相反miR-141低表達的人群,2 a生存率顯著升高,提示miR-200c和miR-141可作為生物標記物判斷卵巢癌的預(yù)后[12]。本研究中腫瘤組織中miRNA-146a和miRNA-146b的表達水平與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有負相關(guān)性,即有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移miRNA-146a和miRNA-146b表達水平越低。

    此外,miRNA還參與卵巢癌的化療耐藥過程。Boren等[13]證實27個miRNA與卵巢癌化療耐藥有關(guān)。Weiner-Gorzel等[14]發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞對紫杉醇化療耐藥與miR-433表達上調(diào)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-146a可以通過促炎細胞因子干擾胰島素分泌[15],而且誘導(dǎo)miR-146a表達會導(dǎo)致β細胞程序性死亡的增加[16]。目前研究表明miR-146a/b的抑癌作用與其調(diào)控NF-κB通路的活性有關(guān),轉(zhuǎn)染miR-146a/b的MDAMB-231細胞中的表達量明顯下調(diào),其下游基因表達水平亦下降,這些基因?qū)毎那忠u轉(zhuǎn)移功能有調(diào)控作用[17]。

    總之,本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中miR-146a和miR-146b的表達比癌旁組織呈明顯下調(diào),miR-146a和miR-146b的表達與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在負相關(guān),說明miR-146a和miR-146b的表達可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

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    Expression of miR-146a and miR-146b in Ovarian Cancer and its Clinical Significance

    LIU Zhi-hui, LIU Ping

    (Second People′s Hospital of Nanyang,Nanyang 473000,China)

    ObjectiveInvestigating the expression of miR-146a and miR-146b in ovarian cancer and adjacent non-cancerous tissuesand its correlation with clinicopathologic characteristics.Methods38 cases of ovarian cancer tissues and and adjacent non-cancerous tissues were collected in our hospital from January 2013 to October 2015.RT-PCR was used to detect the expressions of miR-146a and miR-146bin 38 pairs ovarian cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues, the correlation with clinical pathologic parameters and clinical significance were analyzed also.ResultsThe average expression of miR-146a and miR-146b was significantly down-regulated in ovarian cancer tissues compared with the adjacent non-cancerous tissues(6.74±2.74) VS (7.08±1.70), (6.33±2.14) VS (7.26±2.59), respectively (allP<0.05). There were significantly negative correlation between the expression of miR-146a and miR-146b and lymph node metastasis (allP<0.05).ConclusionmiR-146a and miR-146b may play an important role in the tumorigenesis and tumor progression of ovarian cancer.

    ovarian cancer;miR-146a;miR-146b;clinical stage;lymphnode metastasis

    1672-688X(2016)04-0252-03

    10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.004

    2016-07-12

    南陽市第二人民醫(yī)院,河南南陽 473000

    劉志惠(1980-),女,回族,河南南陽人,醫(yī)師,從事婦產(chǎn)科臨床、科研工作。

    R737.31

    A

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