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    槐定堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株capan-1增殖及侵襲能力的影響

    2016-08-23 10:24:07任麗平李先佳金少舉
    食管疾病 2016年4期
    關(guān)鍵詞:小室細(xì)胞株胰腺癌

    任麗平,李先佳,金少舉

    槐定堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株capan-1增殖及侵襲能力的影響

    任麗平,李先佳,金少舉

    目的 探討槐定堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株capan-1增殖和侵襲能力的影響。方法 用MTT法檢測(cè)不同濃度的槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞增殖的影響,Transwll實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞侵襲能力的影響,ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-2和 MMP-9表達(dá)水平。結(jié)果 不同濃度的槐定堿均能明顯抑制capan-1細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.05);與空白對(duì)照組比較,槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組capan-1細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 槐定堿能通過下調(diào)MMPs的表達(dá)水平,有效地抑制capan-1細(xì)胞增殖,降低細(xì)胞侵襲能力。

    胰腺癌;capan-1;槐定堿

    胰腺癌起病隱匿、惡性程度高,具有生存率低、病死率高等特點(diǎn),發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。該病的治療除傳統(tǒng)的手術(shù)治療外,藥物治療一直是研究熱點(diǎn)?;倍▔A是從中藥苦豆子中提取的生物堿之一[1],具有抗心律失常、保護(hù)心肌、抗菌、抗病毒及鎮(zhèn)痛等作用,對(duì)絨癌、惡性葡萄胎等惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤具有較好的抑制作用[2],對(duì)癌細(xì)胞具有直接殺傷作用,且毒性較低[3],但其作用機(jī)制目前并不明確?;|(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloprotein,MMP)為一種常見的鋅離子依賴性內(nèi)肽酶,能降解細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)血管的生成,可為癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移提供必要條件[4]。其中MMP-2、MMP-9為MMP中常見的酶,與腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5]。本研究通過觀察MMP-2、MMP-9表達(dá)的變化,探討槐定堿抑制人胰腺癌細(xì)胞株capan-1增殖和侵襲力的可能作用機(jī)制?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 capan-1細(xì)胞株由漯河醫(yī)專分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳代保種?;倍▔A為寧夏鹽池縣醫(yī)藥公司提供(批號(hào):060630,純度>99%),用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度,過濾除菌4 ℃保存。胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)公司,批號(hào):140130),56 ℃滅活30 min,-20 ℃保存?zhèn)溆?;0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司,批號(hào):22250-018);二甲亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(無(wú)錫海碩生物有限公司),四甲基偶氮唑鹽MTT(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):M2128);DMEM培養(yǎng)基(Dulbeco’s modified eagle medium, DMEM)(美國(guó)Hyclone公司,批號(hào):NAE1396);MMP-2(編號(hào):MMP200) 和MMP-9(編號(hào):DMP900)ELISA 試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司);Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。TE2000型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司);ST-360酶標(biāo)儀(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) capan-1細(xì)胞株由漯河醫(yī)專分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳代保種,用含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),用 0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(eathylene diamine tetraacetic acid, EDTA)消化。

    1.3 方法

    1.3.1 MTT法測(cè)定槐定堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株capan-1細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)期capan-1細(xì)胞,細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104個(gè)·mL-1,取100 μL接種于96孔板,貼壁后24 h去上清,分別加入含10、5、2.5、1.25、0.625、0.308、0.154 g·L-1的槐定堿溶液100 μL,對(duì)照組給予等量培養(yǎng)液,空白對(duì)照組不含細(xì)胞只加等量的培養(yǎng)液;每組3個(gè)復(fù)孔;37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48以及72 h后,每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL,4 h后吸去培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 200 μL,震蕩10 min,在酶標(biāo)儀上讀取570 nm處的吸光度(A)值,檢測(cè)重復(fù)4次,計(jì)算抑制率及半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。

    1.3.2 槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞侵襲力的影響 取出-20 ℃保存的Matrigel基質(zhì)膠,4 ℃過夜,置于冰上,用無(wú)FBS培養(yǎng)基9∶1稀釋基質(zhì)膠。24孔Transwell小室每孔加入20 μL基質(zhì)膠溶液,37 ℃孵育30 min,使Matrigel聚合成膠。將各組細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105·mL-1。在Transwell小室下室內(nèi)加入500 μL含20% FBS的完全培養(yǎng)基,置入鋪過基質(zhì)膠的Transwell小室,上室內(nèi)加入200 μL細(xì)胞懸液,常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室,棄培養(yǎng)基,4%甲醛固定5 min,結(jié)晶紫染色30 min。流水沖洗小室,酒精棉簽小心擦去基質(zhì)膠和細(xì)胞,快速風(fēng)干。倒置小室,顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞,重復(fù)3次。

    1.3.3 槐定堿對(duì)MMP-2及MMP-9的影響 用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,先加稀釋液40 μL到包被反應(yīng)孔中,再加入待檢測(cè)樣品10 μL,置37 ℃孵育1 h,然后洗滌。于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體50 μL(空白孔不加)。37 ℃孵育0.5 h,洗滌。加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B,避光顯色20 min。于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸50 μL。在ELISA檢測(cè)儀上,于450 nm處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔吸光度OD值,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MMP-2及MMP-9的濃度。

    2 結(jié)果

    2.1 MTT法測(cè)定槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的槐定堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞株capan-1的增長(zhǎng)均具有不同程度的抑制增殖作用,呈時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系,見圖1。根據(jù)生長(zhǎng)抑制率采用綜合法計(jì)算24、48和72 h半數(shù)抑制量值,分別為5.93、3.82、2.834 g·L-1。

    圖1 槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞增殖的抑制作用

    2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞侵襲力的影響 用不同濃度1.25、2.5、5 g·L-1的槐定堿干預(yù)48 h后,在顯微鏡(×200)下每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞,各組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(25.27±1.53)、(19.42±1.71)和(15.44±2.28)個(gè),分別與空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(37.32±3.05)個(gè)比較槐定堿組capan-1細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),呈劑量效應(yīng)關(guān)系,見圖2。

    A:空白對(duì)照組 B、C、D:分別代表槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組圖2 槐定堿作用capan-1細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

    2.3 ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞MMP-2及MMP-9表達(dá)量 與空白對(duì)照組比較,槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組capan-1細(xì)胞內(nèi)MMP-2及MMP-9表達(dá)水平較明顯下降(P<0.05),呈劑量效應(yīng)關(guān)系,見圖3。

    A:各組MMP-2表達(dá)量;B:各組MMP-2表達(dá)量。 ①與空白組比較,P<0.05。圖3 ELISA檢測(cè)MMP2及MMP-9含量

    3 討論

    多項(xiàng)研究表明槐定堿對(duì)惡性腫瘤有治療作用。首先,槐定堿有誘導(dǎo)凋亡作用,李明潺等[6]發(fā)現(xiàn)槐定堿通過激活caspase-3/8途徑誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡,韓靚等[7]研究發(fā)現(xiàn)槐定堿能顯著抑制人胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞增殖。其次,槐定堿可以抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲,趙樹鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn)槐定堿通過NF-κB信號(hào)通路和激活凋亡caspase-3酶聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的侵襲、MMP-2的分泌及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloprotnases, MMPs)是重要的蛋白水解酶,與癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。

    本研究中不同濃度的槐定堿組對(duì)capan-1細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,不同濃度的槐定堿能明顯抑制capan-1細(xì)胞的增長(zhǎng),并具有濃度和時(shí)間的依賴性,尤其5 g·L-1濃度抑制效果尤其明顯,提示槐定堿能顯著抑制capan-1細(xì)胞的生長(zhǎng)。MMP-2和MMP-9均為MMPs中常見基質(zhì)金屬酶,能降解細(xì)胞外基質(zhì),破壞細(xì)胞基底膜的連續(xù)性和完整性,與胰腺癌[10]、肝癌[11]等癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力以及浸潤(rùn)密切相關(guān)。本研究顯示不同濃度的槐定堿加入capan-1細(xì)胞培養(yǎng)液中48 h后,結(jié)果顯示槐定堿能在一定程度下調(diào)MMP-2和MMP-9水平,而且槐定堿水平越高,MMP-2和MMP-9水平越低,上述結(jié)果與槐定堿對(duì)其他腫瘤侵襲的影響研究一致[8]。這也提示槐定堿能有效抑制capan-1細(xì)胞的增殖及侵襲能力,其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

    總之,槐定堿能有效抑制capan-1細(xì)胞的增殖和侵襲能力,通過協(xié)調(diào)MMPs的表達(dá)水平拮抗胰腺癌的侵襲,對(duì)其進(jìn)一步研究,可為胰腺癌的靶向治療提供新的方法。

    [1] 李雪梅,吳云光,潘達(dá)鑫.新型抗腫瘤藥槐定堿[J].中國(guó)中藥雜志,2006,8(15):656.

    [2]Wang M,Lu X,Dong X,et al.pERK1/2 silencing sensitizes pancreaticcancer BXPC-3 cell to gemcitabine-induced apoptosis via regulating Bax and Bcl-2 expression[J].World J Surg Oncol,2015,13(1):451.

    [3] 寇小平,邵瑩,占斌,等.槐定堿聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌中FHIT,Survivin及PTEN表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,16(24):4763-4766,+4778.

    [4] 楊碩,李洪利,李文通,等.乳腺癌中PKCζ、MMP-2、MMP-9的表達(dá)及相關(guān)性[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014,30(9):958-962.

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    [6] 李明潺,王玉麗,董林易.槐定堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞體外增殖和侵襲抑制作用及機(jī)制的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2015,53(13):1111-1116.

    [7]韓靚,鄧皖利,呂書勤,等.槐定堿抑制人胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,14(2):8-10.

    [8] 趙樹鵬,靳彩玲,高國(guó)軍,等.槐定堿對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、侵襲及相關(guān)信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2016,23(3):360-365.

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    [11]彭利,左連富,王順祥,等.肝癌組織中COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)及相互關(guān)系的免疫組化研究[J].實(shí)用腫瘤雜志,2005,20(2):134-136.

    Sophoridine Effect on the Proliferation and Invasiveness of Human Pancreatic Cancer Capan-1 Cells Lines

    REN Li-ping, LI Xian-jia, JIN Shao-ju

    (Luohe Medical College,Luohe 462002,China)

    ObjectiveTo explore the effect of Sophoridine on proliferation and invasiveness of human pancreatic cancer capan-1 cells lines.MethodsMTT was used to detect the effcct of Sophoridine with different concentration on the proliferation of capan-1 cells. Transwll assay detected the effect of Sophoridine on the invasiveness of capan-1 cells, and ELISA assay detected expression level of MMP-2 and MMP-9.ResultsCompared with control group, different concentration of Sophoridine could inhibit growth of capan-1 cells significantly (P<0.05).The expression level of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated for the group with the dosage of 1.25, 2.5, 5 g·L-1Sophoridine, respectively (P<0.05).ConclusionSophoridine could decrease MMPs expression level, inhibit cell proliferation of capan-1, and reduce the cell invasiveness of capan-1.

    pancreatic cancer;capan-1 cells;Sophoridine

    1672-688X(2016)04-0244-03

    10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.002

    1.河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(16B310004) 2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校2016年度校級(jí)研究資助計(jì)劃項(xiàng)目(2016-S-LMC-13)

    2016-10-07

    漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,河南漯河 462002

    任麗平(1984-),女,河南舞陽(yáng)人,講師,從事腫瘤藥理學(xué)研究。

    金少舉,男,博士,副教授,Email:37050573@qq.com

    R285.5;R735.9

    A

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