棉花粉蚧對(duì)木爾坦棉花曲葉病毒的獲取、存留和傳播風(fēng)險(xiǎn)

唐 遠(yuǎn)，何沐陽(yáng)，陸永躍*

(1. 廣西梧州市植物保護(hù)站，廣西梧州543003；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)系，廣州510642)

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棉花粉蚧對(duì)木爾坦棉花曲葉病毒的獲取、存留和傳播風(fēng)險(xiǎn)

唐 遠(yuǎn)1,2，何沐陽(yáng)2*，陸永躍2**

(1. 廣西梧州市植物保護(hù)站，廣西梧州543003；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)系，廣州510642)

為明確棉花粉蚧Phenacoccussolenopsis對(duì)扶桑Hibiscusrosa-sinensis感染的木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)的傳播風(fēng)險(xiǎn)，本文應(yīng)用PCR方法研究了棉花粉蚧獲取、存留和傳播CLCuMV的規(guī)律和能力。結(jié)果表明棉花粉蚧各取食危害蟲(chóng)期均可獲取、攜帶CLCuMV，獲取病毒所需時(shí)間為2-48 h，蟲(chóng)體內(nèi)病毒最多可存留312 h；但是，粉蚧體內(nèi)病毒無(wú)法侵染健康扶桑，亦不會(huì)經(jīng)卵或者交配進(jìn)行垂直和水平傳播。本研究證明了棉花粉蚧不能傳播CLCuMV，為防治該蟲(chóng)、該病毒病提供了依據(jù)。

棉花粉蚧；木爾坦棉花曲葉病毒；傳播風(fēng)險(xiǎn)

棉花粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsley又名扶桑綿粉蚧，原產(chǎn)于美國(guó)(Williams and Granara De Willink，1992)，為近年新入侵我國(guó)的一種重要害蟲(chóng)(武三安和張潤(rùn)志，2009)。該蟲(chóng)1990年代在世界范圍內(nèi)開(kāi)始擴(kuò)散危害(陸永躍等，2008)，2005-2006年以來(lái)曾對(duì)印度和巴基斯坦棉區(qū)造成嚴(yán)重危害，使棉花減產(chǎn)50%，損失巨大(Wangetal.，2010; Kumaretal.，2014)。該蟲(chóng)寄主范圍廣，繁殖速度快、潛力大，可隨植物及其包裝物、載體、介質(zhì)等調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播(陸永躍等，2008；Wangetal.，2010；胡婕等，2014)。自2008年我國(guó)發(fā)現(xiàn)棉花粉蚧以來(lái)，截至2015年全國(guó)已有15個(gè)省份報(bào)道其發(fā)生，且仍在不斷擴(kuò)散蔓延中。我國(guó)雖未報(bào)道棉花粉蚧對(duì)棉花造成明顯危害，但風(fēng)險(xiǎn)分析表明該蟲(chóng)對(duì)我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)潛在威脅巨大(王艷平等，2009；Wangetal.，2010；馬駿等，2011)。

植物生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭受多種病原物侵染，由此產(chǎn)生的植物病害導(dǎo)致世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)損失達(dá)10%-30%(Williams and Herman，2012)。由病毒侵染導(dǎo)致的植物病毒病為其中一類(lèi)較為嚴(yán)重的病害，通常難以防治(史曉斌等，2012)。大部分植物病毒可由昆蟲(chóng)作為介體傳播(Power，2000)，如煙粉虱傳播雙生病毒引起多種曲葉病(衛(wèi)靜等，2015)，褐飛虱可傳播水稻矮縮病毒Ricedwarfvirus(Chenetal.，2011)等。木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)是引發(fā)棉花毀滅性病害—棉花曲葉病的一種主要病原之一，主要經(jīng)介體昆蟲(chóng)攜帶傳播(何自福等，2010)。2006年我國(guó)就發(fā)現(xiàn)了CLCuMV，雖然目前尚未在我國(guó)棉花上檢測(cè)到，但其已侵染了華南地區(qū)重要園林植物—扶桑Hibiscusrosa-sinensis，導(dǎo)致了黃化曲葉病，并且發(fā)生分布已經(jīng)較為普遍(林林等，2011；唐遠(yuǎn)和陸永躍，2013)。扶桑上該病毒的分離物可成功侵染棉花，被侵染棉花表現(xiàn)曲葉病典型癥狀(何自福等，2010)。扶桑是棉花粉蚧的主要嗜食寄主之一，棉花粉蚧可在感染木爾坦棉花曲葉病毒的扶桑上發(fā)生危害。研究表明多種粉蚧可傳播病毒，其中榕臀紋粉蚧Planococcusficus、桔臀紋粉蚧Planococcuscitri、擬長(zhǎng)尾粉蚧Pseudococcusaffinis、柑橘棲粉蚧Pseudococcuslongispinus和長(zhǎng)尾粉蚧Pseudococcuscalceolariae等皆可傳播葡萄卷葉病毒(潘志勇和翟衡，2001)。作為我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)潛在危害極大的入侵害蟲(chóng)，棉花粉蚧是否會(huì)攜帶、傳播木爾坦棉花曲葉病毒?解釋此問(wèn)題將對(duì)防治棉花曲葉病有重要價(jià)值，亦對(duì)準(zhǔn)確把握和定位棉花粉蚧的危害有指導(dǎo)作用。本文采用分子生物學(xué)方法研究了棉花粉蚧對(duì)CLCuMV的獲取、存留和傳播，明確了該蟲(chóng)傳播該病毒的風(fēng)險(xiǎn)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1供試蟲(chóng)源

在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)系檢疫與入侵害蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱里(28℃±1℃，RH 60%-65%，光照周期(L ∶D)14 h ∶10 h)，以扶桑為寄主飼養(yǎng)、建立種群，實(shí)驗(yàn)時(shí)選取各齡健康蟲(chóng)態(tài)備用。

1.1.2供試寄主

扶桑幼苗種植于室內(nèi)(溫度28℃±1℃，RH 60%-65%)塑料花盆(直徑20 cm，高30 cm)中，常規(guī)管理，不使用任何農(nóng)藥防治病蟲(chóng)害，實(shí)驗(yàn)時(shí)選取約35 cm高健壯植株備用。

1.1.3感染CLCuMV的扶桑

染病扶桑樣品采自于廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園五山學(xué)生公寓周?chē)G化帶，經(jīng)病毒分子序列測(cè)定后確認(rèn)攜帶有CLCuMV的扶桑標(biāo)記為病毒來(lái)源植株。

1.1.4主要實(shí)驗(yàn)試劑

氯仿、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)自于廣州化學(xué)試劑廠；Tris-Cl、NaCl、EDTA、Taq酶、dNTPs、PCR buffer、DNA marker DL2000、瓊脂糖等購(gòu)自于寶生物工程(大連)有限公司；蛋白酶K購(gòu)自于天根生化科技(北京)有限公司；檢測(cè)所用引物于生工生物工程(上海)股份有限公司合成；48%吡蟲(chóng)啉懸浮劑購(gòu)自于陜西美邦農(nóng)藥有限公司，兌水配成3%水溶液備用。

1.1.5主要實(shí)驗(yàn)儀器

梯度PCR擴(kuò)增儀Mastercycle Pro、高速冷凍離心機(jī)Eppendorf 5417R，德國(guó)艾本德股份公司；電泳儀BG-subMIDI，北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD Gel Doc XR，美國(guó)BIO-RAD 公司；超凈工作臺(tái)SIV-CI-ZFD，廣州深華科技有限公司；低溫冰箱ULT Freezer，美國(guó)Thermo Forma公司；恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162，上海一恒科技儀器有限公司；滅菌鍋HV-110，日本HIRAYAMA公司；電子天平ALC-1100.2，珠海天創(chuàng)儀器有限公司；智能人工氣候箱RXZ，寧波江南儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1扶桑及棉花粉蚧DNA提取

在溫碩洋和何曉芳(2003)的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行一些修改(唐遠(yuǎn)和陸永躍，2013)。取單頭粉蚧(1齡若蟲(chóng)取10頭)放入1.5 mL離心管，先加入6 μL STE(100 mM NaCl；10 mM Tris-Cl，pH8.0；1 mM EDTA，pH8.0)，研磨勻漿，加入54 μL STE清洗研磨杵，再加入6 μL蛋白酶K(200 μg/mL)，研磨液在56℃恒溫器中消化2 h，消化后的產(chǎn)物在95℃孕育45 s，14000 r/min離心1 min沉淀殘?jiān)?，上清液作為做PCR的模板或保存在-20℃冰箱中備用。

1.2.2CLCuMV的PCR擴(kuò)增

根據(jù)CLCuMV的DNA-A區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)特異引物，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為580 bp(唐遠(yuǎn)和陸永躍，2013)(表1)。

表1　CLCuMV特異引物MJ-r及MJ-f的堿基序列

擴(kuò)增體積為25 μL：含模板DNA(扶?？侱NA)1 μL，20 μmol/L正向引物和反向引物各1 μL，2.5 mM dNTP混合液2 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，10×buffer(含鎂離子)2.5 μL，無(wú)菌雙蒸水17.3 μL。

擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 45 s；56℃ 45 s；72℃ 1 min；擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)(電壓72 V，電泳緩沖液為1×TAE)，紫外燈下觀察結(jié)果，以明確目的基因的存在與否及擴(kuò)增片段的大小。

1.2.3棉花粉蚧獲取木爾坦棉花曲葉病毒時(shí)間的測(cè)定

將100頭棉花粉蚧3齡若蟲(chóng)饑餓12 h后，置于已放有6片染病扶桑幼嫩葉片的培養(yǎng)皿(Φ15 cm)中，用保鮮膜封好皿口，用昆蟲(chóng)針在膜上扎出100個(gè)小孔供空氣流通，放入人工氣候箱(溫度28℃±1℃，相對(duì)濕度60%-65%)中培養(yǎng)。以在健康植株上取食的粉蚧為對(duì)照。于接蟲(chóng)后0、1、2、4、8、12、24、48 h分別從皿中隨機(jī)取10頭粉蚧，置于-40℃保存，用于單頭粉蚧CLCuMV的PCR檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

粉蚧帶毒率(%)=(檢測(cè)到攜帶CLCuMV DNA的粉蚧個(gè)體數(shù)量/被檢測(cè)的所有粉蚧個(gè)體數(shù)量)×100。

1.2.4棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV存留時(shí)間的測(cè)定

1.2.3試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)取食帶病毒葉片48 h后3齡粉蚧帶病毒率為100%。取已飼毒48 h的3齡若蟲(chóng)250頭，接到4株經(jīng)PCR檢測(cè)無(wú)CLCuMV的健康扶桑上，并用防蟲(chóng)籠隔離，在室內(nèi)條件下飼養(yǎng)。于接蟲(chóng)后0、12、24、36、48、72、96、120、168、240、312、360、480 h分別隨機(jī)取10頭粉蚧，置于-40℃保存，并用PCR檢測(cè)單頭粉蚧CLCuMV。重復(fù)2次。

1.2.5棉花粉蚧傳播CLCuMV能力的檢測(cè)

關(guān)于粉蚧傳毒研究發(fā)現(xiàn)飼毒24 h的10頭葡萄粉蚧對(duì)寄主的接種停留時(shí)間(inoculation access period，IAP)24 h時(shí)對(duì)GLRaV-3傳毒率為100%(Tsaietal.，2010)，飼毒24 h的15頭煙粉虱對(duì)寄主的IAP達(dá)24 h后對(duì)TYLCV傳毒率也為100%(Mansour and Al-Musa，1992)。因此，本試驗(yàn)將已飼毒48 h的棉花粉蚧3齡若蟲(chóng)200頭接種在10株經(jīng)PCR檢測(cè)無(wú)CLCuMV的健康扶桑苗的幼嫩部位上，每株接種20頭，接種后用防蟲(chóng)籠隔離飼養(yǎng)。接種停留時(shí)間為48 h后將植株上粉蚧全部移除，并噴灑3%吡蟲(chóng)啉液處理植株，然后隔離觀察扶桑葉片是否產(chǎn)生由CLCuMV引起的癥狀，并在15 d后采集植株嫩葉檢測(cè)CLCuMV。

1.2.6棉花粉蚧不同齡期攜帶CLCuMV能力的檢測(cè)

1齡若蟲(chóng)：選擇個(gè)體大小相近的棉花粉蚧1齡若蟲(chóng)100頭，饑餓8 h，其他培養(yǎng)方法同1.2.3。由于1齡粉蚧個(gè)體微小，用單頭粉蚧提取到的DNA含量非常少，在常規(guī)PCR中難以擴(kuò)增出條帶，因此在飼毒48 h后隨機(jī)取出10頭1齡粉蚧為一個(gè)樣品，放入2 mL的離心管中，置于-40℃保存，用PCR檢測(cè)粉蚧CLCuMV。重復(fù)5次。

2齡若蟲(chóng)：選擇個(gè)體大小相近的棉花粉蚧2齡若蟲(chóng)50頭，饑餓8 h，其他培養(yǎng)方法同1.2.3。飼毒48 h后隨機(jī)抽取5頭粉蚧放入2 mL的離心管中，置于-40℃保存，用PCR檢測(cè)單頭粉蚧CLCuMV。重復(fù)5次。

3齡若蟲(chóng)、雌成蟲(chóng)的處理方法同上。

1.2.7棉花粉蚧經(jīng)卵傳播體內(nèi)CLCuMV能力的檢測(cè)

選擇棉花粉蚧3齡末期若蟲(chóng)20頭，饑餓8 h后，其他培養(yǎng)方法同1.2.3。每隔2 d更換一次病葉，等粉蚧蛻皮成為成蟲(chóng)10 d后，將全部已飼毒粉蚧移至放有健康扶桑葉片的培養(yǎng)皿里繼續(xù)飼養(yǎng)，然后每天向培養(yǎng)皿里放入5頭雄蟲(chóng)供交配，直至雌蟲(chóng)產(chǎn)生卵囊以后。一是撥開(kāi)卵囊，隨機(jī)挑取20粒卵放入2 mL離心管中，置于-40℃保存，用PCR檢測(cè)CLCuMV。重復(fù)5次。二是待1齡若蟲(chóng)出現(xiàn)后隨機(jī)挑取10頭1齡若蟲(chóng)放入2 mL的離心管中，置于-40℃保存，用PCR檢測(cè)CLCuMV。重復(fù)5次。

2　結(jié)果與分析

2.1棉花粉蚧獲取木爾坦棉花曲葉病毒時(shí)間

接毒后0 h、1 h后檢測(cè)到的棉花粉蚧帶毒個(gè)體數(shù)量均為0頭，接毒后2、4、8、12、24、48 h后檢測(cè)到的帶毒個(gè)體總數(shù)分別為2頭、12頭、19頭、25頭、27頭、30頭；由此，計(jì)算出接毒0、1、2、4、8、12、24、48 h后棉花粉蚧獲毒率分別為0、0、6.67%、40%、63.33%、83.33%、90%、100%(圖1)。飼毒2 h后就能從粉蚧體內(nèi)檢測(cè)到CLCuMV的存在，飼毒4 h后粉蚧的獲毒率明顯提高，上升到了40%；隨著飼毒時(shí)間增加，粉蚧獲毒率仍呈上升趨勢(shì)，到飼毒12 h后，獲毒率在80%以上，趨于穩(wěn)定；飼毒48 h，粉蚧獲毒率為100%。

圖1　扶桑綿粉蚧獲取木爾坦棉花曲葉病毒的時(shí)間Fig.1　Virus acquisition time for Phenacoccus solenopsis

2.2棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV的存留時(shí)間

從圖2可看出，脫離病毒侵染植株后短時(shí)間內(nèi)(0-24 h)棉花粉蚧若蟲(chóng)帶毒個(gè)體比率較為穩(wěn)定，在95%以上；之后迅速降低，40 h后處于低水平穩(wěn)定階段，帶毒率在5%-15%。在棉花粉蚧體內(nèi)檢測(cè)到CLCuMV的最長(zhǎng)時(shí)間為312 h，僅檢測(cè)到1頭粉蚧帶毒。

圖2　棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV的存留時(shí)間動(dòng)態(tài)Fig.2　Retention time dynamic of ClCuMV in Phenacoccus solenopsis

圖3　不同處理時(shí)間棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV的DNA凝膠電泳條帶對(duì)比Fig.3　Comparison of DNA gel electrophoresis for CLCuMV in Phenacoccus solenopsis at different intrevals after leaving the infected plant注：C36、C48、C240、C312分別為粉蚧脫離病毒侵染植株后36、48、240、312 h。Note: C36, C48, C240, and C312 represented 36, 48, 240, and 312 h, respectively, after the mealybug leaving the infected plant.

從檢測(cè)粉蚧體內(nèi)病毒的電泳圖可觀察到，不同時(shí)間長(zhǎng)度的病毒DNA條帶明暗程度也有很大差異，隨著時(shí)間延長(zhǎng)DNA條帶亮度逐漸變暗(圖3)。36 h、48 h時(shí)病毒DNA條帶比較清晰明亮，而240 h、312 h時(shí)兩條條帶都非常暗淡。這說(shuō)明粉蚧體內(nèi)CLCuMV不能復(fù)制增殖，而是不斷減少，360 h、480 h時(shí)已經(jīng)完全檢測(cè)不到CLCuMV DNA的存在了。

2.3不同蟲(chóng)期棉花粉蚧攜帶CLCuMV的能力

檢測(cè)結(jié)果表明取食含有CLCuMV扶桑葉片48 h 后均能從各蟲(chóng)態(tài)粉蚧體內(nèi)檢測(cè)到CLCuMV，其中1齡若蟲(chóng)樣品陽(yáng)性數(shù)量為4份，帶毒率為80%；2齡若蟲(chóng)、3齡若蟲(chóng)、雌成蟲(chóng)CLCuMV檢出樣品數(shù)量均為5份，帶毒率為100%(表2)。

表2　棉花粉蚧不同蟲(chóng)期攜帶CLCuMV的比率

2.4棉花粉蚧經(jīng)卵或者交配傳播CLCuMV的能力

結(jié)果顯示，帶毒成蟲(chóng)所產(chǎn)卵、1齡若蟲(chóng)中均未檢測(cè)到CLCuMV的存在。因此，可確定棉花粉蚧不能經(jīng)卵將CLCuMV傳播給子代。對(duì)于與帶毒雌蟲(chóng)交配的雄蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果表明，10頭雄蟲(chóng)體內(nèi)均未檢測(cè)到CLCuMV，因此，認(rèn)為棉花粉蚧不能通過(guò)交配方式將CLCuMV傳播給雄蟲(chóng)。

2.5棉花粉蚧在寄主植物間傳播CLCuMV的能力

未發(fā)現(xiàn)健康扶桑葉片產(chǎn)生由CLCuMV所引起的癥狀，PCR檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)扶桑植株里有CLCuMV。因此，經(jīng)IAP 48 h接種帶毒棉花粉蚧，不能在扶桑之間傳播CLCuMV。

3　結(jié)論與討論

本試驗(yàn)應(yīng)用PCR檢測(cè)方法研究了棉花粉蚧對(duì)CLCuMV獲取、存留及傳播能力。結(jié)果表明，各蟲(chóng)期粉蚧均具有攜帶CLCuMV能力。其中，3齡若蟲(chóng)獲取該病毒所需時(shí)間為2-48 h，明顯長(zhǎng)于煙粉虱對(duì)同為雙生科病毒的番茄黃化曲葉病毒的獲毒時(shí)間(僅需5-10 min)(Atzmonetal.，1998)。棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV殘留隨著時(shí)間推移而減少，存留時(shí)間至少為36 h，最長(zhǎng)為312 h。

研究發(fā)現(xiàn)200頭帶毒棉花粉蚧對(duì)扶桑的傳毒率為0。由于本實(shí)驗(yàn)使用的為飼毒48 h且在植株的停留時(shí)間為24 h的3齡若蟲(chóng)(經(jīng)測(cè)定帶毒率為100%)，而考慮到煙粉虱獲取棉花曲葉病毒僅需15 min-4 h(Mann，2011)，帶毒粉蚧傳播葡萄卷葉病毒GLRaV-III的傳毒率在IAP 24 h達(dá)到峰值(Chiweietal.，2010)，故應(yīng)不存在獲毒失敗的可能，而在之后的檢測(cè)中并未在扶桑植株中發(fā)現(xiàn)CLCuMV。因此，認(rèn)為棉花粉蚧雖然可短期攜帶CLCuMV，但是不能向健康植株傳播。此外，該蟲(chóng)不能經(jīng)卵將CLCuMV傳給子代，也不能通過(guò)交配將病毒傳給雄蟲(chóng)。該病毒應(yīng)不能在棉花粉蚧體內(nèi)循環(huán)增殖。綜上所述，棉花粉蚧基本上不存在傳播CLCuMV的風(fēng)險(xiǎn)，其危害方式應(yīng)不包括對(duì)棉花曲葉病的傳播。

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Acquisition, retention and transmission risk ofCottonleafcurlMultanvirusby cotton mealybugPhenacoccussolenopsisTinsley

TANG Yuan1,2, HE Mu-Yang2*, LU Yong-Yue2**

(1. Wuzhou Plant Protection Station, Wuzhou 543003, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2. Department of Entomology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

To indentify the risk of spreading CLCuMV by cotton mealybugPhenacoccussolenopsisTinsley, it was tested that the abilities and dynamics ofP.solenopsisto acquire, conserve and transmit the virus by PCR method. The results showed that all feeding stages could acquire the virus in 2-48 h, and the virus could remain in mealybug bodies for the maximum of 312 h. However, CLCuMV in cotton mealybug nymphs was unable to infect the healthyHibiscusrosa-sinensis, and it did not transmit vertically and horizontally by oviposition and mating. This study cleared the risk ofP.solenopsistransmitting CLCuMV and provided the basis for the management of the two pests.

PhenacoccussolenopsisTinsley; CLCuMV; transmission risk

國(guó)家自然科學(xué)基金(31171855);廣東省研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃(2013JDXM14)

唐遠(yuǎn)，男，1988年生，廣西梧州人，碩士，研究方向?yàn)槔ハx(chóng)生態(tài)學(xué)，E-mail:ty06865@qq.com

*共同第一作者，E-mail: hemuyang@stu.scau.edu.cn

**

Author for correspondence，E-mail：luyongyue@scau.edu.cn

2016-01-07；接受日期Accepted： 2016-03-23

Q965;S433

A

1674-0858(2016)04-0736-06