梅州地區(qū)3309例女性人乳頭瘤病毒檢測(cè)結(jié)果及其基因類型分析

羅曉東，徐美蘭，邱玉林

(1.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，2.嘉應(yīng)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，梅州514031)

梅州地區(qū)3309例女性人乳頭瘤病毒檢測(cè)結(jié)果及其基因類型分析

羅曉東1，徐美蘭2，邱玉林1

(1.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，2.嘉應(yīng)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，梅州514031)

目的了解24種人乳頭瘤病毒(Human papillomaviruses，HPV)型別在梅州地區(qū)女性人群中的最新感染情況及分布特點(diǎn)。方法采用賽樂其基因芯片檢測(cè)方法對(duì)2011年12月到2014年12月在婦科體檢和就診的3309例不同年齡的女性患者進(jìn)行了HPV基因檢測(cè)，分析最新HPV亞型感染情況。結(jié)果3309例受檢者HPV總感染率為17.47%，其中單一基因型別感染率14.17%，雙重感染率2.60%，三重及以上感染率0.7%。HPV基因型分布陽性率居前5位的是HPV52(2.87%)、HPV43(2.51%)、HPV58(2.45%)、HPV16(2.39%)和HPV11(1.45%)。感染率居前3位的年齡段是≥60歲(33.33%)，20～29歲(19.14%)，30～39歲(17.32%);20～24歲及≥60歲年齡段與各組間(除55～59歲)總感染率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論梅州地區(qū)女性HPV感染率接近于國(guó)內(nèi)平均感染率，感染率年齡分布呈U型分布，HPV52、58、16為地區(qū)主要的感染亞型，需要針對(duì)不同年齡段、易感人群定期進(jìn)行HPV核酸檢測(cè)及基因分型篩查。

人乳頭瘤病毒;基因型別;宮頸癌

人乳頭瘤病毒(HPV)是一類具有高度種屬及組織特異性感染人類皮膚及黏膜鱗狀上皮，引起良性病變或惡性腫瘤的小雙股環(huán)狀DNA病毒，目前通過DNA測(cè)序識(shí)別的HPV基因型別已有130余種［1］。大量流行病學(xué)研究證實(shí)，高危型人乳頭狀瘤病毒持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要因素之一［2～4］。近幾年來，在一些國(guó)家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)病和死亡均有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，尤其是宮頸癌的年輕患者開始增加［5］。為掌握2011～2014年來梅州地區(qū)女性最新HPV感染率及其型別的分布情況，以及HPV感染與年齡的關(guān)系，采用賽樂其基因芯片檢測(cè)方法對(duì)3309名女性宮頸分泌物等進(jìn)行了HPV型別檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集2011年12月～2014年12月來我院婦科或體檢行HPV DNA檢查的3309例女性，年齡20～85歲，中位年齡38歲。將研究對(duì)象分為20～29歲、30～39歲、40～49歲，50～59歲，≥60歲，共5個(gè)不同年齡段。

1.2樣本采集所有待測(cè)標(biāo)本均由臨床醫(yī)生采集，在無菌條件下，用宮頸刷伸入宮頸管內(nèi)2 cm，旋轉(zhuǎn)數(shù)周并停留片刻后取出，將其放入生理鹽水保存管中。通過抽提DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，采用賽樂其基因芯片方法進(jìn)行HPV DNA 24種分型的檢測(cè)。24種HPV型別包括高危型16、18、26、31、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、MM4，以及低危型6、11、42、43、44、83、84。

1.3檢測(cè)方法DNA提取:震蕩混勻臨床標(biāo)本，取1 ml轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，12 000 rpm，離心10 min，棄上清后，采用賽樂其基因組抽提試劑盒提取DNA，具體操作步驟見試劑盒說明書，冷凍保存。將PCR反應(yīng)液及DNA模板依次添加混勻成25 μL/反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中DNA模板5 μL;另外，陰陽性對(duì)照各一管。擴(kuò)增程序:50℃，2 min，94℃15 min，94℃30 s，45℃1 min，72℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min后，4℃密封保存?zhèn)溆?基因芯片檢測(cè):將10 μL上述PCR產(chǎn)物加入直用型雜交液中，混勻后加入基因芯片孔中，經(jīng)45℃水浴35 min后，讓其冷卻至室溫。經(jīng)洗滌液洗滌后，加入直用型BW反應(yīng)液(100 μL)室溫下反應(yīng)15 min，洗滌后加入顯色液100 μL避光常溫下反應(yīng)5 min，充分洗滌后，應(yīng)用芯片自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行判斷。結(jié)果判斷:使用自動(dòng)分析報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，信號(hào)位置灰度值與背景灰度值大于4為陽性，或肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，出現(xiàn)藍(lán)色信號(hào)，信號(hào)斑點(diǎn)顏色有深淺，均代表陽性;多個(gè)圓點(diǎn)陽性即為多重感染。每張芯片上有PCR反應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)和雜交顯色質(zhì)控點(diǎn)各一個(gè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行整理，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2　結(jié)　果

2.1HPV檢測(cè)結(jié)果3309例檢測(cè)標(biāo)本中，共檢出23種 HPV亞型，HPV感染578例，總感染率為17.47%。其中，高危型總感染率為13.72%(454/ 3309)，以HPV52為主，檢出率2.87%;低危型總感染率為3.75%(124/3309)，以HPV43為主，檢出率2.51%。HPV型別檢測(cè)結(jié)果見表1、表2。

2.2HPV感染基因型分布及多重感染情況分布

單一基因型別者469例，檢出率14.17%;雙重感染者86例，檢出率2.60%;三重及以上感染者23例，檢出率0.7%。HPV基因型分布陽性率居前5位的是 HPV52(2.87%)、HPV43(2.51%)、HPV58 (2.45%)、HPV16(2.39%)和HPV11(1.45%)。

2.3HPV感染各年齡段分布如圖1所示，總HPV陽性率居前3位的是≥60歲(33.33%)，20～29歲(19.14%)，30～39歲(17.32%)，各年齡段總HPV感染率比較(P=0.007＜0.01)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表3所見，20～24歲及≥60歲年齡段與各組間(除55～59歲)總感染率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1　高危型感染率前6名

表2　低危型感染率前6名

圖1　不同年齡段HPV感染率比較

表3　不同年齡段HPV感染率

3　討　論

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌之后的女性惡性腫瘤，據(jù)世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)，每年約有50萬的新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5%，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家［7］。我國(guó)每年約有13.15萬的新發(fā)病例，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28.8%［7］。有研究證明持續(xù)性高危型HPV感染和多重感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件［2～4］，因此通過對(duì)HPV感染的篩查，對(duì)于宮頸癌前病變的提前發(fā)現(xiàn)，以及減少宮頸癌的發(fā)病率和病死率有其重要的意義。

HPV感染是常見的性傳播疾病，在女性的一生中，感染HPV的概率大于75%，但大多可自然消除［8］。在國(guó)內(nèi)，廣州地區(qū)HPV感染率為35.33%，山東地區(qū)為29.38%［9，10］，本研究對(duì)3309名本地區(qū)女性進(jìn)行 HPV型別檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)人群總感染率為17.47%，與深圳地區(qū)女性17.6%HPV感染率接近［11］，高于李霓等人［12］報(bào)道16.1%的中國(guó)婦女人乳頭瘤病毒感染率。結(jié)果顯示與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)有一定差異，可能與研究的目標(biāo)人群或采用的檢測(cè)方法不同造成;另外，檢測(cè)結(jié)果低于楊海坤等［13］報(bào)道的客家女性20.67%HPV總感染率，分析可能與梅州近年大力宣傳健康醫(yī)療，以及開放旅游、外來人口數(shù)增加有關(guān)。

目前在世界范圍內(nèi)流行最為廣泛的為高危型HPV16和HPV18，在世界各地區(qū)間沒有明顯差異，而其他高危型別的分布則有著明顯的差異［14］。Clifford GM等［15］對(duì)11個(gè)國(guó)家15 613名無宮頸病變婦女的HPV型別研究中發(fā)現(xiàn)，人群中主要的感染型別為HPV16、HPV42、HPV58、HPV31、HPV18、HPV56、HPV81、HPV35、HPV33和HPV 45。而在國(guó)內(nèi)對(duì)山西陽城縣、深圳市和沈陽市三個(gè)地區(qū)的感染調(diào)查中，則發(fā)現(xiàn)HPV16、HPV52、HPV58是婦女感染的主要高危型別［12］。通過研究發(fā)現(xiàn)，梅州地區(qū)HPV高危型感染前5名分別為HPV52、HPV58、HPV16、HPV33、HPV31，這與Lin等［17］的研究結(jié)果相似，與李利平等［18］報(bào)道的客家地區(qū)主要感染型別 HPV16、HPV58、HPV52、HPV31、HPV33略有差異，本研究對(duì)象為婦科就診患者及體檢者，不能完全代表各型別在自然人群中的感染率，但檢測(cè)結(jié)果可以分析各型別的大致分布情況。結(jié)果分析表明梅州地區(qū)女性HPV感染的優(yōu)勢(shì)型別主要為HPV52、HPV58、HPV16型，其中HPV52檢出率高于HPV16，可能是HPV變異體與宿主免疫系統(tǒng)間的相互作用有關(guān)［18］;另外，在感染HPV的過程中，70%～90%的HPV感染可被免疫系統(tǒng)自然清除［8］，可能導(dǎo)致同一地區(qū)不同時(shí)間段HPV感染率及感染型別發(fā)生變化。因此，在開展地區(qū)性的HPV疫苗接種前有必要研究該地區(qū)最新型別分布及主要感染型別。

HPV感染的影響因素中，包括地區(qū)、年齡、性生活開始時(shí)間、生活習(xí)慣等相關(guān)因素，其中年齡是其重要的一項(xiàng)因素。de Sanjos é S等［19］對(duì)相關(guān)報(bào)道的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，HPV感染高峰主要在34歲之前，在35 ～44歲年齡段HPV感染率逐漸降低，在45～54歲除亞洲地區(qū)外其他地區(qū)的HPV感染率又有所升高。張勁松等［20］的研究結(jié)果則顯示，女性HPV感染高峰在29歲以下和50歲左右，感染率年齡分布呈“S”形分布。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)20～29歲和≥60歲年齡段感染率較高，其中又以20～24歲及≥60歲年齡段感染更嚴(yán)重，與各組間(除55～59歲)總感染率比較均有顯著性差異，隨著年齡的增加HPV的感染率開始逐漸下降，在55～59歲年齡段又開始升高，并在≥60年齡段中達(dá)到一較高的感染率。感染率年齡分布與Franceschi S等［21］的研究結(jié)果基本一致，感染高峰呈明顯的U型分布，說明女性越年輕，開始性生活時(shí)間越早越活躍，感染HPV的概率越高，而中老年女性由于正處于圍絕經(jīng)期，激素的波動(dòng)可能導(dǎo)致機(jī)體生理及免疫力開始下降，使得對(duì)病毒的抑制及清除能力明顯減弱。所以有必要針對(duì)本地區(qū)20 ～24歲及≥55歲年齡段女性人群開展HPV宣傳教育，并建議其每年體檢，從而降低HPV的感染率。

綜上所述，通過分析2011～2014年3309例的HPV檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)梅州地區(qū)女性最新HPV感染率接近國(guó)內(nèi)平均感染率，感染率年齡分布呈U型分布，HPV52、HPV58、HPV16為地區(qū)主要的感染亞型，需要針對(duì)不同年齡段、易感人群加大衛(wèi)生健康宣傳教育，定期進(jìn)行HPV核酸檢測(cè)及基因分型篩查。

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(編輯:梁明佩)

An analysis of human papillomaviruses detection result and genotype of 3309 female in Meizhou

LUO Xiaodong1，XUE Meilang2，QIU Yulin1
(1.Medical College of Jiaying University，2.Clinical Laboratory Department，Hospital Affiliated to Jiaying University，Meizhou 514031，China)

ObjectiveTo understand the latest infection status and distribution features of 24 kinds of Human papillomaviruses(HPV)among women in Meizhou area.MethodsSeiler vakuumtechnik gene chip detection method was adopted to perform HPV genetic tests of 3309 female of varoius ages，who came to gynaecology to examin and receive treatment from December，2011 to December，2014.And the newest infection status of subtype HPV was analyzed.ResultsThe total infection rate of the 3309 patients was 17.47%，among which 14.17%were infected by single HPV genotype，2.60%by two genotypes and 0.7%by three or more genotypes.The top five HPV genotype distribution positive rate were HPV52(2.87%)，HPV43(2.51%)，HPV58(2.45%)，HPV16(2.39%)and HPV11(1.45%).The highest infection rate ages were≥60 (33.33%)，20～29(19.14%)，30～39(17.32%)，differences of total infection rate of patients aged 20～24，≥60 and other age groups(except for 55～59)were all statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe HPV infection rate of female in Meizhou area is close to the domestic average infection rate，and the age distribution of the infection rate is U type.The dominant genotypes of this area are HPV52，58 and 16.It is necessary to regularly carry out HPV nucleic acid detection and genotyping detection for women in different age groups and for the susceptible population.

HPV;genotype;cervical cancer

R737.33

ADOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.03.015

羅曉東，男，助教，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向:免疫學(xué)。E-mail:lqjatai@163.com

2016－03－16

2016－06－20)