溫運(yùn)清利法對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織DAG-PKCε信號(hào)通路的作用研究

毛堂友 高康麗 趙唯含 王允亮 郭一 謝添弘 陳晨 譚祥 韓亞飛 李軍祥

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溫運(yùn)清利法對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織DAG-PKCε信號(hào)通路的作用研究

毛堂友 高康麗 趙唯含 王允亮 郭一 謝添弘 陳晨 譚祥 韓亞飛 李軍祥

目的 探討溫運(yùn)清利法對(duì)非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝組織甘油二酯（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶Cε（protein kinase Cε，PKCε）信號(hào)通路的影響。方法 高脂飲食飼養(yǎng)SD大鼠8周制備NASH模型，造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為模型組、苓桂術(shù)甘湯組、茵陳蒿湯組、合方組（苓桂術(shù)等與茵陳蒿湯）、羅格列酮組，共5組，每組10只；另有空白組10只。藥物治療4周后，運(yùn)用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清生化指標(biāo)，HE染色、油紅O染色觀察肝組織病理，ELISA法檢測(cè)肝組織DAG，RT-PCR檢測(cè)PKCε mRNA、TNF-α mRNA，Western blot檢測(cè)PKCε和TNF-α蛋白的表達(dá)。結(jié)果 （1）各給藥組大鼠一般狀況、肝組織脂肪變性和炎癥反應(yīng)程度、血清生化指標(biāo)等均較模型組有一定的減輕；（2）苓桂術(shù)甘湯、合方組、羅格列酮組大鼠肝組織DAG較模型組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；（3）各治療組大鼠肝組織PKCε mRNA和蛋白含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），茵陳蒿湯組、合方組及羅格列酮組大鼠肝組織TNF-α mRNA和蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論 溫運(yùn)清利法可能是通過(guò)下調(diào)肝組織DAG，抑制PKCε表達(dá)，降低TNF-α水平，從而對(duì)肝內(nèi)脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗、炎癥損傷起到了調(diào)節(jié)作用，DAG/PKCε通路有可能成為治療NASH的新靶點(diǎn)。

溫運(yùn)清利法； 非酒精性脂肪性肝炎； DAG-PKCε信號(hào)通路； 作用研究

目前，非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，較為普遍接受的是“二次打擊”學(xué)說(shuō)，初次打擊的核心主要是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及脂質(zhì)代謝紊亂，及在此基礎(chǔ)上引發(fā)的第二次打擊——氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，而甘油二酯（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶Cε（protein kinase Cε，PKCε）信號(hào)通路參與這個(gè)過(guò)程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［1-3］，苓桂術(shù)甘湯可調(diào)節(jié)肝內(nèi)脂質(zhì)代謝和改善IR，減輕肝臟炎性損傷；而茵陳蒿湯亦可改善脂代謝紊亂及高胰島素血癥狀態(tài)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，但二者合方能否增強(qiáng)治療效果，尚未可知。因此，本研究以DAG-PKCε信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討進(jìn)一步苓桂術(shù)甘湯、茵陳蒿湯及其合方治療NASH的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（120± 20）g，購(gòu)自斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司合格證號(hào)：SCXK（京）2011-0004，常規(guī)飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房。高脂飼料（88%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇）購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2 藥物

苓桂術(shù)甘湯顆粒（茯苓12 g、桂枝9 g、白術(shù)6 g、炙甘草6 g）；茵陳蒿湯顆粒（茵陳蒿18 g、梔子9 g、大黃6 g）；茵陳蒿與苓桂術(shù)甘湯合方顆粒（茯苓12 g、桂枝9 g、白術(shù)6 g、炙甘草6 g、茵陳蒿18 g、梔子9 g、大黃6 g），均購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒藥房；陽(yáng)性藥物羅格列酮片，購(gòu)自成都恒瑞制藥有限公司（批號(hào)：H20051706）。

1.3 試劑與儀器

總膽醇（total choleste，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、高密度脂蛋白（high density lipid-cholesterol，HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）試劑盒，均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。油紅O染色及蘇木精-伊紅染色相關(guān)試劑（Sigma，USA）。TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒、2 mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)染色液等均購(gòu)自北京賽諾博生物技術(shù)中心。PKC-ε抗體 （CST，2683）；TNF-α抗體（abcam，ab6671）。7160全自動(dòng)生化儀（日本日立公司）；BT224S電子天平（德國(guó) Sartouris公司）；QL-902渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HB-202恒溫水洛箱（北京中西遠(yuǎn)大）；UCT型超薄切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；MR23i臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Nikon50I光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；美國(guó)Bio-Rad穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；NANODROP2000分光光度計(jì)（Thermo scientifi公司）等。

1.4 分組、造模及標(biāo)本采集

造模方式同前期研究［4-6］，將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，空白組（10只）給予普通飼料，其余大鼠（50只）給予高脂飼料，自由攝食、飲水。造模8周后，高脂飼料飼養(yǎng)組依據(jù)體重隨機(jī)分為模型組、苓桂術(shù)甘湯組、茵陳蒿湯組、合方組（苓桂術(shù)甘與茵陳蒿湯）、羅格列酮組。各給藥組分別以苓桂術(shù)甘湯、茵陳蒿湯、苓桂術(shù)甘與茵陳蒿湯合方、羅格列酮混懸液，按1 mL/100g大鼠等效劑量比例灌胃治療；模型組和正常對(duì)照組按1 mL/100g鼠重給予去離子水灌胃，均為每天上午灌胃1次，治療4周。每天觀察動(dòng)物進(jìn)食、飲水、行為、精神狀態(tài)、毛發(fā)及二便等情況，每周動(dòng)物稱體重1次。末次給藥后，禁食禁水24小時(shí)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，抽取大鼠腹主動(dòng)脈血，分離血清-80℃冰箱保存；在肝臟最大葉邊緣處取9小塊肝臟組織（1×1 cm），1份用 10%中性福爾馬林固定液固定，制作石蠟切片；一份用OCT固定液固定，制作冰凍切片；剩下的放置于凍存管，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血清指標(biāo)檢測(cè)

血清（ALT、AST）、血脂（TC、TG、HDL、LDL）均采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.6 肝組織病理檢測(cè)

常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋切片（4 μm），HE染色；冰凍切片（10 μm）行油紅O染色，并在光鏡下觀察肝脂肪變性程度、炎癥活動(dòng)度。

1.7 肝組織PKCε mRNA、TNF-α mRNA的檢測(cè)

肝組織樣本中提取總RNA后，計(jì)算其純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PKCε上游引物5′-AAGGGATTCTGAATGGCGTGACA-3′，下游引物5′-CACTGAGGGGCCGTACTCCAAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度98 bp；TNF-α上游引物5′-GGGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTG-3′，下游引物5′-GGGCTCTGAGGAGTAGACGATAAAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度128 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3′，下游引物5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度138bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，采用2-△△C T法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，計(jì)算PKCε、TNF-α值。

1.8 肝組織PKCε、TNF-α蛋白的檢測(cè)

將肝組織裂解后，離心取上清液，置于BSA標(biāo)準(zhǔn)液中，檢測(cè)樣品蛋白含量。調(diào)整濃度后，進(jìn)行電泳分離，分別加入一抗、二抗，漂洗后凝膠圖像分析，得出數(shù)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠體重及肝指數(shù)、血清血脂、血清肝功能及DAG的數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，且方差齊，因此采用單因素方差分析中的兩兩比較LSD法；PKCε mRNA和蛋白、TNF-α mRNA和蛋白的數(shù)據(jù)方差不齊，因此采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界限；P＜0.01為具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

模型組大鼠較空白組大鼠精神差、毛發(fā)凌亂無(wú)光澤、行動(dòng)笨拙、活動(dòng)減弱、精神萎靡、體質(zhì)量明顯減輕。各給藥組大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤、活動(dòng)行為以及體質(zhì)量增長(zhǎng)較模型組相比，均有不同程度的好轉(zhuǎn)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體重及肝指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠體重及肝指數(shù)比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別　n　　體質(zhì)量（g）　　肝指數(shù)（%）空白組10　520.14±43.27　2.39±0.28模型組　10　712.38±53.19a　4.19±0.17a苓桂術(shù)甘湯組　10　650.24±48.50b　3.26±0.20b茵陳蒿湯組　10　641.93±45.78b　3.11±0.24b合方組　10　618.37±50.74b　2.93±0.18b羅格列酮組　10　629.85±46.85b　3.09±0.16b

2.2 血清指標(biāo)

2.2.1 對(duì)血清肝功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯組、合方組、羅格列酮組大鼠血清ALT、AST明顯降低（P＜0.05），茵陳蒿湯組大鼠血清ALT明顯降低（P＜0.01），血清AST的含量無(wú)明顯改變（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.2.2 對(duì)血清血脂的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL含量均顯著升高（P＜0.05），HDL含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯組、茵陳蒿湯組、羅格列酮TG明顯降低（P＜0.05），TC、LDL、HDL含量無(wú)明顯變化（P＞0.05）；合方組TC、TG、LDL明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL含量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠血清肝功能的含量比較（U/L，±s）

表2 各組大鼠血清肝功能的含量比較（U/L，±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01。

組別　n 10　16.95±8.49　82.41±49.65模型組　10　41.78±14.04b　172.09±47.30a苓桂術(shù)甘湯組　10　21.52±6.86d　108.25±50.51c茵陳蒿湯組　10　25.49±12.90d　165.41±88.46合方組　10　18.06±4.12d　76.17±27.20c羅格列酮組　10　22.61±9.73d　104.09±38.43 ALT　AST空白組c

2.3 肝組織病理學(xué)檢測(cè)

HE染色顯示：空白組大鼠肝組織著色均勻，肝小葉結(jié)抅正常，肝索排列整齊呈放射狀（圖1A）；模型組大鼠存在明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，肝小葉界限不清，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝組織可見(jiàn)彌漫性、混合性的空泡及氣球樣改變，匯管區(qū)和小葉內(nèi)可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)呈灶狀積聚（圖1B）；各治療組病變較模型組均有不同程度的減輕，肝細(xì)胞形態(tài)和小葉結(jié)構(gòu)有不同程度恢復(fù)，胞內(nèi)脂滴及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。（圖1 C、D、E、F）。

油紅O染色顯示：空白組肝組織不著色（圖2 A）；模型組大鼠肝組織可見(jiàn)大量脂滴（圖2 B）；各治療組肝組織中脂滴明顯減少，呈不均勻分布（圖2 C、D、E、F）。

2.4 對(duì)肝組織DAG的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織DAG含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯、合方組、羅格列酮明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），茵陳蒿湯組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

2.5 對(duì)肝組織PKCε mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織PKCε mRNA和蛋白均顯著升高（P＜0.05），茵陳蒿湯組、合方組及羅格列酮組的PKCε mRNA顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠肝組織PKCε mRNA和蛋白含量均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表5、圖3。

表3 各組大鼠血清血脂的含量比較（mmol/L，±s）

表3 各組大鼠血清血脂的含量比較（mmol/L，±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01。

0.46±0.20　0.27±0.76組別　n 10　0.68±0.63　0.24±0.19　0.34±0.23　0.60±0.36模型組　10　1.28±0.46b　0.42±0.08a　0.65±0.29a　0.38±0.05a苓桂術(shù)甘湯組　10　0.86±0.52　0.28±0.13c　0.48±0.35　0.33±0.14b茵陳蒿湯組　10　1.30±0.69　0.30±0.11c　0.59±0.29　0.50±0.22合方組　10　0.60±0.32d　0.26±0.85c　0.35±0.11c　0.29±0.13羅格列酮組　10　0.97±0.41　0.28±0.09cTC　TG　LDL　HDL空白組

圖1 溫運(yùn)清利法對(duì)12周時(shí)大鼠肝組織石蠟切片蘇木精-伊紅染色的影響（×400）

圖2 溫運(yùn)清利法對(duì)12周時(shí)大鼠肝組織石蠟切片油紅O染色的影響（×100）

表4 各組大鼠肝組織DAG的比較（mmol/L，±s）

表4 各組大鼠肝組織DAG的比較（mmol/L，±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.05。

組別　n DAG空白組10　1.81±0.28模型組　10　2.66±0.23a苓桂術(shù)甘湯組　10　1.80±0.25b茵陳蒿湯組　10　1.90±0.22合方組　10　1.20±0.20b羅格列酮組　10　1.41±0.31c

表5 對(duì)肝組織PKCε mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

表5 對(duì)肝組織PKCε mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01。

組別　n　PKCε mRNA　PKCε蛋白空白組10　1.27±0.26　0.39±0.01模型組　10　2.47±0.38a　0.51±0.01a苓桂術(shù)甘湯組　10　1.60±0.97b　0.33±0.01c茵陳蒿湯組　10　1.64±0.00b　0.45±0.01b合方組　10　0.72±0.35c　0.26±0.01c羅格列酮組　10　0.51±0.13c　0.18±0.01c

圖3 大鼠肝組織PKCε的Western blot的表達(dá)

2.5 對(duì)肝組織TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織 TNF-α mRNA和蛋白均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，茵陳蒿湯組、合方組及羅格列酮組大鼠肝組織TNF-α mRNA和蛋白含量顯著降低（P＜0.05），苓桂術(shù)甘湯組大鼠也降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表6、圖4。

表6 對(duì)肝組織TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

表6 對(duì)肝組織TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01。

組別　n　TNFα mRNA　TNFα蛋白空白組10　0.85±0.12　1.16±0.12模型組　10　3.30±0.84a　2.19±0.24a苓桂術(shù)甘湯組　10　2.10±1.00　1.87±0.15茵陳蒿湯組　10　0.94±0.27b　1.58±0.21b合方組　10　0.62±0.32c　1.53±0.14b羅格列酮組　10　1.29±0.18b　1.66±0.19b

圖4 大鼠肝組織TNF-α的Western blot的表達(dá)

3 討論

胰島素抵抗是NASH發(fā)病的重要機(jī)制之一［7］，幾乎所有的NASH患者都存在周圍組織和肝臟的IR。高脂飲食狀態(tài)下，脂肪在肝臟大量蓄積，致使其對(duì)胰島素的敏感性下降，從而發(fā)生IR，而IR又可反過(guò)來(lái)增加脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，形成惡性循環(huán)。持續(xù)的脂肪蓄積會(huì)誘生炎癥、氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化，從而造成肝臟的炎性損傷。因此，改善IR及炎癥反應(yīng)是防治NASH的關(guān)鍵。

DAG是甘油三酯和磷脂合成的中間物質(zhì)，與NASH密切相關(guān)［8］。DAG含量的升高是NASH發(fā)生IR的一個(gè)重要標(biāo)志，其與胰島素敏感性的相關(guān)度達(dá)到64%，并與胰島素抵抗指數(shù)呈顯著正相關(guān)［8］。PKCε是DAG的靶蛋白，其被激活后，可下調(diào)胰島素受體，抑制胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化［9］，從而引起胰島素生物效應(yīng)的減弱，影響胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)IR的發(fā)生。因此，DAG/PKCε信號(hào)通路的異?？梢鹬|(zhì)代謝紊亂和IR，是形成NASH的發(fā)病基礎(chǔ)［8］。

DAG在肝細(xì)胞內(nèi)大量合成并蓄積后，會(huì)引發(fā)肝細(xì)胞的脂肪變性，造成持續(xù)的肝臟損傷，從而引起TNF-α的過(guò)度分泌，其一方面通過(guò)降低胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化來(lái)加重IR，另一方面同時(shí)又直接損傷肝細(xì)胞，增加肝內(nèi)ROS的產(chǎn)生，增強(qiáng)氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的炎癥、壞死［10］，促進(jìn)NASH的發(fā)生發(fā)展。

本次實(shí)驗(yàn)以高脂飼料誘導(dǎo)大鼠NASH模型，8周后可見(jiàn)大鼠體重及肝指數(shù)、血清生化指標(biāo)等均明顯升高，肝臟組織病理可見(jiàn)大量脂肪空泡及氣球樣變，證明模型構(gòu)建成功。研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織DAG、PKCε、TNF-α mRNA和蛋白均較正常組升高，提示DAG-PKCε通路參與了NASH的發(fā)生發(fā)展。而苓桂術(shù)甘湯組及含有苓桂術(shù)甘湯成分的合方組能顯著降低肝組織DAG的含量，同時(shí)下調(diào)PKCε mRNA和蛋白的表達(dá)水平較茵陳蒿湯組明顯，推測(cè)苓桂術(shù)甘湯在針對(duì)第一次打擊的脂質(zhì)代謝和IR發(fā)揮著更為重要的作用；而茵陳蒿湯組及含有茵陳蒿湯組能夠顯著下調(diào)TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)，推測(cè)茵陳蒿湯可能更針對(duì)第二次打擊，而合方組的療效均優(yōu)于單用苓桂術(shù)甘湯組及茵陳蒿湯組。

本課題組認(rèn)為，“痰濁內(nèi)阻，濕熱瘀結(jié)，肝體用失調(diào)”是NASH中醫(yī)病機(jī)的關(guān)鍵，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“二次打擊學(xué)說(shuō)”，痰濁內(nèi)阻，阻滯氣機(jī)，壅塞肝絡(luò)，肝體用失調(diào)，病情較輕，是造成脂類物質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，形成對(duì)肝臟“第一次打擊”的發(fā)病基礎(chǔ)；痰濁內(nèi)阻，久郁化熱，濕熱瘀結(jié)，損傷肝絡(luò)，肝體用失調(diào)，病情漸重，是致使脂肪酸氧化增強(qiáng)，進(jìn)而出現(xiàn)氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化的肝臟“第二次打擊”的病理機(jī)制。因此創(chuàng)立溫運(yùn)清利法治療NASH，以苓桂術(shù)甘湯著眼中焦，茵陳蒿湯擅入肝膽，兩方合用，兼顧肝脾，既可運(yùn)脾溫化痰濁，又可清利肝膽郁積之濕熱，溫運(yùn)清利并用，增強(qiáng)療效。本研究的結(jié)果也證實(shí)，苓桂術(shù)甘湯和合方組針對(duì)第一次打擊的IR，效果要優(yōu)于茵陳蒿湯組；針對(duì)第二次打擊之炎癥損傷，茵陳蒿湯組及合方組要優(yōu)于苓桂術(shù)甘湯組，而合方組又要優(yōu)于單用苓桂術(shù)甘湯組及茵陳蒿湯組，由此可推測(cè)，苓桂術(shù)甘湯與茵陳蒿湯合方可同時(shí)針對(duì)引起NASH發(fā)病的二次打擊，從而達(dá)到治療NASH的目的。

本次研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了DAG-PKCε信號(hào)通路對(duì)NASH大鼠的調(diào)控機(jī)制，對(duì)溫運(yùn)清利法治療NASH的作用機(jī)制做了初步研究，進(jìn)一步深化了NASH發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。但本次研究?jī)H是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，DAG-PKCε信號(hào)通路能否促進(jìn)人類NASH的發(fā)生發(fā)展，還有待今后進(jìn)一步研究。

［1］ 張會(huì)存，蘇冬梅，劉瑩，等.二陳湯與苓桂術(shù)甘湯治療非酒精性脂肪性肝病炎性損傷的機(jī)制研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2015，23（8）：525-530.

［2］ 劉瑩，張會(huì)存，段娜，等.茵陳蒿湯對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪性肝炎的藥效學(xué)觀察［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（13）：217-220.

［3］ 劉瑩，陳曉偉，李健，等.茵陳蒿湯拆方對(duì)非酒精性脂肪性肝炎的正交實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2013，21 （4）：182-187.

［4］ 蘇冬梅，李健，李軍祥，等.健脾疏肝方對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠ADP、TNF-α的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（12）：826-831.

［5］ 蘇冬梅，諸葛麗，李軍祥，等.健脾疏肝方對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脂代謝分子網(wǎng)絡(luò)的影響［J］.世界華人消化雜志，2012，20（2）：91-99.

［6］ 王允亮，諸葛麗，李軍祥，等.調(diào)肝解毒方對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織抗氧化能力的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2012，32（10）：1042-1045.

［7］ Ong JP，Younossi ZM.Epidemiology and natural history of NAFLD and NASH［J］.Clin Liver Dis，2007，11（1）：1-16.

［8］ Kumashiro N，Erion DM，Zhang D，et al.Cellular mechanism of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease［J］.PNAS，2011，108（39）：16381-16385.

［9］ Samuel VT，Liu ZX，Wang A，et al.Inhibition of protein kinase C epsilon prevents hepatic insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease［J］.J Clin Invest，2007，117（3）：739-745.

［10］ HotamisligilGS，ShargillNS，SpiegelmanBM.Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha：direct role in obesitylinked insulin resistance［J］.Science，1993，259（5091）：87-91.

（本文編輯：蒲曉田）

Experimental study of“Wenyun Qingli”method on DAG-PKCε signal pathway in liver tissue of NASH rats

MAO Tang-you，GAO Kang-li，ZHAO Wei-han，et al.Dongfang Hospital of Beijing
University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China

Li Jun-xiang；E-mail：lijunxiang1226@163.com

Objective To investigate the effect of Wenyun Qingli method on DAG-PKCε signal pathway in NASH rats.Methods High fat diet was used to induce NASH model on SD rats for 8 weeks. After 4 weeks of treatment，the automatic biochemical analyzer was used to measure the serum liver function （AST，ALT），blood lipid（TC，LDL，HDL，TG）level.HE staining and oil-red O staining method was used to observe the pathological changes of liver tissue，ELISA was used to detect the DAG of liver tissue，RT-PCR was used to detect the PKCε mRNA and TNF-α mRNA，Western blot was used to observe the expression of PKCε and TNF-α.Results （1）The mental state：general condition，liver index，inflammation and serum biochemical indices of treated groups were decreased compared with the model group；（2）The DAG levels of Linggui Zhugan decoction group，combination group，rosiglitazone group were decreased significantly compared with the model group（P＜0.05，P＜0.01）；（3）The PKC mRNA and protein content of treated groups were decreased significantly compared with the model group（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α mRNA and protein content in liver tissue of Yinchenhao decoction group，combination group，rosiglitazone group were significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion Wenyun Qingli method plays a role in protecting and treating NASH by down-regulating hepatic DAG and PKC expression，decreasing the levels of TNF alpha.DAG/PKCε pathway may be a new target for treating NASH.

WenyunQinglimethod； NASH； DAG-PKCεsignalpathway；Experimental study

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.08.002

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20130013110007）；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目（2015-JYBXS172）

100078 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院脾胃肝膽科［毛堂友（博士研究生）、高康麗（碩士研究生）、趙唯含（博士研究生）、王允亮、郭一（博士研究生）、謝添弘（博士研究生）、陳晨（碩士研究生）、譚祥（碩士研究生）、韓亞飛（碩士研究生）、李軍祥］

毛堂友（1989-），2014級(jí)在讀博士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治胃腸疾病的研究。E-mail：maotangyouqun@126.com

李軍祥（1964-），博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治慢性肝膽和胃腸道疾病。E-mail：lijunxiang1226@163.com

（2016-02-26）