精液對母兔子宮免疫及孕向發(fā)育的影響

劉瑞風(fēng)，劉新峰，郝志明

(1.天津市神澤農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，天津 301721;2.天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)系，天津 300384)

與自然本交相比，人工授精和胚胎移植的妊娠成功率和產(chǎn)仔率都還較低，特別是胚胎移植，其妊娠率還有較大的差距，嚴(yán)重影響了其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用，成為胚胎移植技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸。比較自然本交妊娠和胚胎移植妊娠可以發(fā)現(xiàn)，在胚胎移植情況下，特別是家畜的胚胎移植，胚胎生長發(fā)育的子宮環(huán)境常常并未與精液接觸。

近年來的研究表明，精液與子宮內(nèi)膜的接觸能夠促進(jìn)胚胎的生長，能夠提高母畜的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)。Carp H J等研究發(fā)現(xiàn)，不與結(jié)扎輸精管的公鼠交配，胚胎移植受體鼠的胚泡著床率會下降，胚胎的發(fā)育生長會減緩[1]。在家畜，胚胎移植受體母畜若未與輸精管結(jié)扎的公畜交配，移植的胚胎雖能正常附植，但胎兒生長和胎盤發(fā)育緩慢[2]。另外，Mah J等在進(jìn)行豬的配種時發(fā)現(xiàn)，自然本交的母豬，若再用輸精管結(jié)扎的公豬交配來補(bǔ)充精漿能夠提高母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)[3]?；诖?，本試驗(yàn)擬就精液對兔子宮免疫及孕向發(fā)育的影響進(jìn)行探究，以期揭示接觸精液的子宮所發(fā)生的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特性的變化，為提高人工授精和胚胎移植的成功率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物

健康的新西蘭白兔10只，空懷，體重2.0～2.5 kg，其中母兔8只，公兔2只。試驗(yàn)動物購買后，飼養(yǎng)觀察兩周再進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)前和試驗(yàn)期間，試驗(yàn)兔飼養(yǎng)在室溫條件下，喂以青草和兔專用配合飼料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精液的采集

采精時，一手抓住母兔的兩耳及頸部皮膚將其保定好，使母兔后軀朝向籠內(nèi)，另一手將自制假陰道置于母兔兩后肢之間，假陰道開口緊貼母兔外陰部，并使假陰道與水平面呈30°。當(dāng)公兔爬跨母兔并伸出陰莖時，立即將假陰道套于陰莖上。射精時，公兔會尖叫一聲倒向一側(cè)，這時應(yīng)將母兔放開，豎直假陰道，讓精液流入集精杯。

1.2.2 母兔誘導(dǎo)發(fā)情和誘發(fā)排卵

為了模擬發(fā)情排卵后母兔的生理狀態(tài)，試驗(yàn)?zāi)竿眯柽M(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)情和誘發(fā)排卵處理。

誘導(dǎo)發(fā)情處理:所用藥物為孕馬血清(PMSG，寧波市三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號070108)，按照50IU/kg的劑量，于早上6:00～7:00一次頸部皮下注射。

誘發(fā)排卵處理:在PMSG注射后約50 h前后，當(dāng)母兔陰戶濕潤腫大，陰道黏膜潮紅，并接受試情公兔爬跨時，將無菌玻璃棒插入陰道，以此來刺激陰道，誘發(fā)排卵。

1.2.3 精液宮內(nèi)注入手術(shù)

誘發(fā)排卵處理后4 h進(jìn)行精液宮內(nèi)注入手術(shù)。手術(shù)方法:犬眠寶(0.1 mL/kg)皮下注射麻醉。在最后一對乳頭前約1 cm的腹中線處，常規(guī)手術(shù)方法打開腹壁。當(dāng)腹壁打開后，小指伸入腹腔，觸摸拉出子宮。用縫線結(jié)扎兩側(cè)子宮頸，以防注入兩側(cè)子宮角的液體混合，并以縫線打結(jié)方式在一側(cè)子宮角作標(biāo)記。分別在兩側(cè)子宮角注入0.3 mL新鮮精液(試驗(yàn)組)或生理鹽水(對照組)。然后將子宮送回腹腔，常規(guī)方法縫合腹壁并消毒。

1.3 子宮的采集和分析

1.3.1 子宮大小和重量的測量

精液宮內(nèi)注入手術(shù)后48 h，處死試驗(yàn)兔，完整摘取子宮，去除周圍脂肪等組織，拍照。用游標(biāo)卡尺分別測量兩側(cè)子宮角的長度和直徑，并分別進(jìn)行稱重。根據(jù)體重和子宮角重量，計算子宮角指數(shù)。

子宮角指數(shù)=一側(cè)子宮角重量(g)/體重(kg)

1.3.2 子宮組織切片制作和觀察測定

按常規(guī)方法進(jìn)行制片，并分別進(jìn)行HE和甲苯胺蘭染色。顯微鏡下利用計算機(jī)圖像采集系統(tǒng)分別測量子宮壁、子宮肌層、黏膜層、黏膜上皮和腺上皮的厚度以及腺體的周長，計數(shù)子宮黏膜單位面積內(nèi)的血管、腺體和肥大細(xì)胞數(shù)量。每個切片采集10個視野進(jìn)行觀察和計數(shù)，最后算出平均數(shù)。

1.3.3 子宮沖洗液體細(xì)胞計數(shù)和涂片染色觀察

自子宮角基部剪斷子宮，吸取1 mL無菌生理鹽水，從宮管結(jié)合部向子宮角基部沖洗子宮腔，收集沖洗液。子宮沖洗液體細(xì)胞計數(shù)按白細(xì)胞計數(shù)方法進(jìn)行。為確定子宮沖洗液中的細(xì)胞類型，還進(jìn)行了涂片姬姆薩染色觀察。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用樣本均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，并用PSPS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 精液對子宮免疫的影響

同一子宮的兩個子宮角分別注入生理鹽水(對照組)和精液后48 h，子宮黏膜內(nèi)的肥大細(xì)胞數(shù)分別為3.72±0.04/mm2和2.85±0.05/mm2，精液組子宮黏膜的肥大細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05);兩子宮角沖洗液中的細(xì)胞數(shù)也有很大差異，對照組為8.87±0.36×109/L，精液組為53.3±4.03×109/L，精液組極顯著高于對照組(P＜0.01)，詳見表1。子宮沖洗液涂片染色檢查發(fā)現(xiàn)，子宮沖洗液細(xì)胞主要為嗜中性粒細(xì)胞。

表1 精液對子宮黏膜肥大細(xì)胞數(shù)及子宮沖洗液體細(xì)胞數(shù)的影響

2.2 精液對子宮孕向發(fā)育的影響

2.2.1 對子宮大小和子宮角指數(shù)的影響從表2看，宮內(nèi)注入精液可使子宮角指數(shù)明顯增加(P＜0.05)，子宮角長度顯著延長(P＜0.05)，子宮角明顯增粗(P＜0.05)。

表2 精液對子宮角指數(shù)、長度及直徑的影響

對照組子宮角指數(shù)、子宮角長和子宮角直徑分別為 0.85±0.07 cm、5.58±0.30 cm和0.80 ±0.05 cm，而精液組則分別為1.30±0.04 cm、6.93±0.32 cm和0.90±0.04 cm。

2.2.2 對子宮壁、黏膜層、黏膜上皮層和肌層厚度的影響

表3 精液對子宮壁、黏膜層、黏膜上皮層及肌層厚度的影響

子宮注入精液后48 h，子宮壁、黏膜層、黏膜上皮層和肌層的厚度分別達(dá)到1.92±0.03 mm、1.51±0.02 mm、2.06±0.02 μm和0.29±0.06 mm。與對照組相比，子宮壁及黏膜層的厚度顯著增加(P＜0.05)，黏膜上皮層的厚度極顯著增加(P＜0.01)，子宮肌層的厚度雖有增加但差異不顯著(P﹥0.05)，詳見表3。

2.2.3 對黏膜腺體和血管的影響

表4 精液對子宮黏膜腺體數(shù)、腺上皮厚、腺體周長以及血管數(shù)的影響

由表4可見，子宮注入精液后，每平方毫米子宮黏膜內(nèi)的腺體數(shù)量較對照組明顯增加(P＜0.05)，達(dá)11.75±0.27個;腺上皮厚度較對照組顯著增加(P＜0.05)，達(dá)1.65±0.03 μm;腺體周長與對照組比較則沒有明顯差異(P﹥0.05)。另外，每平方毫米子宮黏膜內(nèi)的血管數(shù)精液組較對照組也有明顯增加(P＜0.05)。

3 討論

3.1 精液對子宮免疫的影響

在整個妊娠期，小鼠和田鼠子宮壁內(nèi)肥大細(xì)胞的數(shù)量都呈先減少后增加的變化，據(jù)認(rèn)為，這種變化與胚泡的附植有關(guān)[4]。胚泡植入子宮壁時肥大細(xì)胞數(shù)量減少，可使子宮局部免疫水平暫時低下，從而使具有父方抗原特征的胚泡不被排斥，可能是胚泡不被母體排斥的免疫學(xué)機(jī)制之一。本試驗(yàn)就精液對子宮壁肥大細(xì)胞數(shù)量的影響也進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，兔的精液也可明顯降低母兔子宮壁肥大細(xì)胞數(shù)量，生理鹽水組子宮壁肥大細(xì)胞數(shù)為3.72±0.04個/mm2，而精液組只有2.85±0.05個/mm2。另外，從我們的試驗(yàn)看，妊娠早期母兔子宮肥大細(xì)胞數(shù)量的減少可能是從子宮接觸精液開始的，精液有可能是子宮肥大細(xì)胞減少的啟動物。

交配后白細(xì)胞遷移進(jìn)入子宮腔是精子上行過程中的重要組成部分[5，6]。許多研究顯示，豬交配后精液可誘導(dǎo)子宮發(fā)生炎癥反應(yīng)，可使大量多核嗜中性粒細(xì)胞(PMN)進(jìn)入子宮腔[6]。在母馬也有類似現(xiàn)象[7]。與上述研究結(jié)果相似，本試驗(yàn)在兔同一子宮的兩側(cè)子宮角分別注入精液和生理鹽水后，注入精液側(cè)的子宮角腔沖洗液中的細(xì)胞數(shù)極顯著高于對照子宮角腔沖洗液中的細(xì)胞數(shù);對子宮沖洗液細(xì)胞涂片染色檢查發(fā)現(xiàn)，其中主要也是嗜中性粒細(xì)胞。

3.2 精液對子宮孕向發(fā)育的影響

我們知道，動物發(fā)情排卵后，殘留的卵泡發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)辄S體，使子宮由雌激素誘導(dǎo)下的發(fā)育轉(zhuǎn)變成由孕酮誘導(dǎo)下的發(fā)育，從而導(dǎo)致子宮的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化。這些變化主要表現(xiàn)為子宮黏膜上皮的生長;子宮腺的增生，腺體的彎曲和分支增多，分泌物增加;以及子宮頸的收縮等[8]。子宮的這種在孕酮作用下的發(fā)育就叫孕向發(fā)育。

在發(fā)情排卵時通過自然本交或人工授精輸入雌性生殖道的精液對妊娠有什么作用已有一些報道。在豬，自然交配的同時給母豬輸入精漿可使母豬的產(chǎn)仔率由70%提高到80%，即使在既進(jìn)行人工授精又進(jìn)行自然本交的母豬，若再輸入精漿也能提高產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)[9]。對生殖道遭受過感染的雌性動物，人工授精時增加精漿輸入量可提高這些動物的妊娠率和產(chǎn)仔率[10]。在家畜，胚胎移植受體母畜若未與輸精管結(jié)扎的公畜交配，移植的胚胎雖能正常附植，但胎兒生長和胎盤發(fā)育緩慢[2]。另外在大鼠和小鼠的研究也表明，胚胎移植受體動物子宮在移植前與精漿接觸，能促進(jìn)胚胎的卵裂和胚泡的附植，能提高胚胎和胎兒的發(fā)育速度，減少流產(chǎn)和畸形胎兒的產(chǎn)生[11，1]?？梢酝茰y，精漿的這些作用肯定是對子宮原有的孕向發(fā)育產(chǎn)生影響，從而改變了胚胎發(fā)育賴以生存的子宮內(nèi)環(huán)境所致。

精液對子宮的孕向發(fā)育到底有什么樣的影響，我們還未見到一篇有關(guān)的報道。從本研究的試驗(yàn)結(jié)果來看，精液注入48 h后，可以顯著增加子宮的大小;可明顯增加子宮壁、黏膜層和黏膜上皮層的厚度;可明顯增加黏膜中腺管和血管的數(shù)量，可顯著增加腺上皮的厚度。

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