超細(xì)毛羊冷凍胚胎移植報告

陳新華，譚先偉，倪建宏，張 賓，劉長彬

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團農(nóng)四師77團，新疆 昭蘇 835601;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000)

動物胚胎移植是現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展史上的一次技術(shù)革命，由于其可以加快優(yōu)良品種擴繁速度，縮短繁育周期，減少生殖道疾病和傳染病的發(fā)生率，降低牲畜在品種運輸中產(chǎn)生的成本等，在生產(chǎn)上的應(yīng)用越來越廣泛[1]。羊胚胎移植技術(shù)是借助一定的儀器設(shè)備，采用微創(chuàng)手術(shù)的方式，將優(yōu)良品種的胚胎，移植到同類普通品種的生殖道內(nèi)，俗稱“借腹懷胎”。胚胎移植技術(shù)在品種改良工作中起到積極的推動作用[2，3]。1890 年英國劍橋大學(xué)希普(W Heape)首次在安哥拉兔上通過胚胎移植獲得后代，標(biāo)志著首次家畜胚胎移植的成功，胚胎移植技術(shù)已經(jīng)有100多年歷史。1934年美國的Warwick等在綿羊的胚胎移植上獲得成功。1973年Wilmut等超低溫(液氮)保存胚胎獲得成功。20世紀(jì)30年代在綿羊和山羊上獲得成功，但直到1950年后胚胎移植技術(shù)才有較大發(fā)展[4]。我國從20世紀(jì)70年代后期開始將胚胎移植應(yīng)用到畜牧業(yè)生產(chǎn)上，首先在家兔上獲得成功，之后分別在綿羊、牛、小鼠、奶山羊上獲得成功[5]。隨著國內(nèi)畜牧業(yè)的發(fā)展，胚胎移植越來越受到人們的重視。目前，我國的羊胚胎移植技術(shù)已經(jīng)成熟，在生產(chǎn)實踐中已得到大范圍的推廣應(yīng)用，為我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展做出了巨大的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受體羊 無繁殖及傳染性疾病的3～5歲健康本地雜交羊。受體母羊最好出自本地區(qū)現(xiàn)有的羊只，檢查布魯氏桿菌病及結(jié)核病，淘汰陽性羊;膘情在中等以上;必須在當(dāng)年產(chǎn)過一胎羔羊，且目前羔羊成活。挑出患有乳腺炎的羊只、四肢殘疾羊、個體較大的羊。杜絕羊群內(nèi)的公羊。

1.1.2 實驗設(shè)備 擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的羊?qū)Ｓ门咛ヒ浦彩中g(shù)架，腹腔內(nèi)窺鏡一套(OLYMPUS，Japan)，實體顯微鏡(NIKON，Japan)，CO2鋼瓶(國產(chǎn))，恒溫水浴鍋、手術(shù)刀、止血鉗、剪刀、持針鉗、注射器(1 mL、5 mL、20 mL)、胚胎移植管、四孔板、Holding液、溫度計、創(chuàng)巾、布膠帶、曲別針、縫合針及線、工作服、碘酒及酒精、消毒液、牛皮紙、衛(wèi)生紙等。

1.1.3 實驗藥品 陰道海綿栓、孕馬血清促性腺激素(PMSG，1000IU/瓶)、青霉素、速眠新及蘇醒靈(長春農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 同期發(fā)情 受體羊均采用陰道海綿栓誘導(dǎo)發(fā)情。放栓的任意一天為第0天，第13天撤栓，撤栓同時注射PMSG 400 IU，隔天開始試情，若接受試情公羊爬跨而不反抗的即為發(fā)情羊只，進行標(biāo)記，7 d后進行胚胎移植。

1.2.2 胚胎鑒定 在體視鏡下對解凍后的胚胎進行分級鑒定，根據(jù)胚胎形態(tài)的完整性及內(nèi)細(xì)胞團的形態(tài)特征分為A、B、C級。透明帶內(nèi)細(xì)胞團呈均勻?qū)ΨQ的球形，形態(tài)典型，單個分裂球的大小、顏色、密度一致，輪廓清晰，胚胎發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段一致者為A級。透明帶內(nèi)細(xì)胞團的大小和形狀以及單個細(xì)胞的顏色和密度存在一定的不規(guī)側(cè)，細(xì)胞質(zhì)較致密，分布均勻，具有完好的、具活性的胚胎細(xì)胞團者為B級。透明帶內(nèi)細(xì)胞團的大小和形狀以及單個細(xì)胞有明顯變異，分裂球輪廓稍不清晰，或部分不清晰，細(xì)胞質(zhì)不致密，分布不均勻，色調(diào)發(fā)暗，但仍有部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、具有活性的胚胎細(xì)胞團者為C級。

1.2.3 胚胎移植 采用微創(chuàng)手術(shù)，用移胚針將符合移植要求的胚胎移植到同期化受體羊的子宮角內(nèi)。在進行移植操作時，利用內(nèi)窺鏡觀察只有卵巢上有黃體發(fā)育的個體才能移植。

1.2.4 手術(shù) 在發(fā)情的第6天受體羊短時斷水24 h，第7天進行胚胎移植。將受體羊保定于手術(shù)架上，固定前、后肢，將乳房向前、腹中線兩側(cè)剃除面積巴掌大小的腹毛，3%碘酊消毒，75% 酒精脫碘手術(shù)部位，在乳房前3～5 cm與腹中線左或右側(cè)3～5 cm交點處，避開乳靜脈及體表較大靜脈下刀，切開皮膚和腹膜，刀口長2 cm左右。

1.2.5 縫合 胚胎移植后，輕輕提起腹壁皮膚或用手輕輕按住子宮體及子宮角自然回復(fù)腹腔內(nèi)。由于切口較小可以采用腹膜與肌肉皮膚進行兩層縫合(如切口皮膚和肌肉層錯位且不出血的情況下可以不縫合)。縫合結(jié)束后，肌肉注射青霉素G 80萬單位，用3%碘酊消毒創(chuàng)口。

1.2.6 妊娠檢查 于胚胎移植后的50～60 d進行B超檢查。

2 結(jié)果

經(jīng)B超檢查并統(tǒng)計受胎率，詳見表1。

表1 超細(xì)毛羊胚胎移植效果

3 討論

羊胚胎移植受諸多因素的影響。據(jù)報道，不同處理方案、胚胎保存環(huán)境、保存液配方、胚胎級別鑒定準(zhǔn)確度、手術(shù)操作時手法技巧、手術(shù)后子宮內(nèi)環(huán)境的變化、受體羊發(fā)情同期化程度、移植時受體羊所處的增重狀態(tài)、受體羊的年齡、飼養(yǎng)狀況、管理狀態(tài)等是影響羊受胎率的重要因素。發(fā)情表現(xiàn)的啟動主要體現(xiàn)在促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放，GnRH刺激 FSH分泌，F(xiàn)SH促進卵泡的發(fā)育，發(fā)情開始啟動[6]。有研究者認(rèn)為在同期發(fā)情處理的第13天血液中E2分泌量達(dá)到峰值，反饋引起LH分泌增加至峰值引起排卵[7～10]。嚴(yán)格受體羊的挑選標(biāo)準(zhǔn)，選擇體況適宜或膘情稍差的羊只作為受體羊，這些羊胚胎移植后經(jīng)過近1個月的補飼體況很快能得到改善和提高。受體羊在移植后這段時間的飼養(yǎng)管理，膘情上升較快，滿足了體內(nèi)胚胎生長發(fā)育需要，此時受胎率要比在胚胎移植時就有較好膘情的受體要高一些。蛋白質(zhì)水平高低直接影響受體的生殖內(nèi)分泌活動而間接影響胚胎的發(fā)育。蛋白質(zhì)水平過高時，機體組織中氨、尿素及其他含氮化合物濃度升高，血液中較高的氮和尿素濃度引起生殖系統(tǒng)中氨和尿素含量升高會影響胚胎存活[11]。

綜上所述，受體羊在飼養(yǎng)、管理環(huán)節(jié)上主要采用放牧加補飼，其中補飼主要以補飼優(yōu)質(zhì)干草為主;或者在圈養(yǎng)的條件下，給受體羊提供優(yōu)質(zhì)干草，尤以牧草種類繁多的天然草場收割的牧草為好。在管理上主要是保障每只受體羊都能有足夠的采食時間。給足采食時間，受體羊才能采食更多的干草，才能攝入更多的干物質(zhì)，才能保障瘤胃微生物區(qū)系的需要，才能有助于受體羊營養(yǎng)的全面。

胚胎移植技術(shù)是第二次生物技術(shù)革命，給畜牧業(yè)發(fā)展帶來舉足輕重的作用。同時胚胎移植技術(shù)也是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程，在實踐操作中忽視任何一個環(huán)節(jié)都將以失敗告終。本次冷凍胚胎移植能夠取得較好成績與嚴(yán)格的受體羊選擇、精心飼養(yǎng)和管理等各環(huán)節(jié)密不可分。

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