腸道病毒性腦炎的患兒T細(xì)胞活化亞群和細(xì)胞因子的變化

方春艷 鄒小杰 袁哲峰 黃明海 高峰

310000杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院［方春艷（研究生在讀）、袁哲峰、高峰］；313000湖州，浙江省湖州市中心醫(yī)院（鄒小杰）；315000寧波市婦女兒童醫(yī)院（方春艷、黃明海）

腸道病毒性腦炎的患兒T細(xì)胞活化亞群和細(xì)胞因子的變化

方春艷 鄒小杰 袁哲峰 黃明海 高峰

310000杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院［方春艷（研究生在讀）、袁哲峰、高峰］；
313000湖州，浙江省湖州市中心醫(yī)院（鄒小杰）；315000寧波市婦女兒童醫(yī)院（方春艷、黃明海）

目的 通過對腸道病毒性腦炎（Enterovirus Encepha1itis，EVE）的患兒T細(xì)胞活化亞群、細(xì)胞因子的檢測，探討其在EVE發(fā)病機(jī)制中的可能作用。方法 選擇2014年6月至2015年7月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)科病房收住院的24例腦脊液腸道病毒陽性的EVE患兒為病例組，其中14例予活化T細(xì)胞亞群檢測，24例均予細(xì)胞因子流式測定，同期門診體檢的49例健康兒童為對照組。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組外周血CD25+/CD3+CD4+、CD69+/CD3+CD4+、HLA-DR/ CD3+CD4+、CD25+/CD3+CD8+、CD69+/CD3+CD8+、HLA-DR/CD3+CD8+，及IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ水平。結(jié)果 病例組外周血CD69/CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+的表達(dá)含量（1.193%±2.849%，0.696% ±1.242%）低于對照組（Z=-2.722，P=0.006；Z=-3.321，P= 0.001）。外周血病例組 IL-2的表達(dá)水平（3.342±1.089 pg/m1）低于對照組（Z=-2.722，P= 0.019）；而IL-6，TNF-α的表達(dá)水平（123.046±355.349；3.367±1.717 pg/m1），與對照組相比，有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-3.471，P=0.001；Z=-4.803，P＜0.001）。結(jié)論 EVE患兒存在一定程度的免疫功能紊亂，T細(xì)胞活化亞群和細(xì)胞因子可能參與了EVE的發(fā)病過程。

【主題詞】 腸道病毒性腦炎；腦脊液腸道病毒DNA陽性；T-淋巴細(xì)胞；細(xì)胞因子類

腸道病毒性腦炎（Enterovirus Encepha1itis，EVE），是小兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染常見病、多發(fā)病。近年來，腸道病毒性腦炎成為我國病毒性腦炎的第一位病原［1，2］。EVE是腸道病毒感染所致。其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣、涉及人體各個系統(tǒng)。腸道病毒引起的疾病大部分表現(xiàn)是溫和的，包括上呼吸道感染、手口足病、皮疹、有發(fā)熱、乏力等［3，4］。但EVE的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與免疫相關(guān)［5］。本研究對EVE患兒進(jìn)行外周血T細(xì)胞活化亞群及細(xì)胞因子的檢測，以探討其在EVE發(fā)病中的意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2014年6月至2015年7月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)科病房收住院的24例腦脊液腸道病毒陽性EVE患兒為病例組，其中14例予活化T細(xì)胞亞群檢測，24例均予細(xì)胞因子流式測定，所有病例臨床均符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)［6-8］。具體是首先排除其他病原體所引起的腦膜炎：1）腦脊液腸道病毒DNA陽性，同時咽拭子、糞便等標(biāo)本檢測腸道通用病毒核酸陽性者；2）在一病程中，同時出現(xiàn)嘔吐癥狀及頭痛伴發(fā)熱（≥37.5℃）的15歲以下兒童；3）腦電圖或腦脊液檢測具備病毒性腦炎表現(xiàn)者。同期門診體檢的49例健康兒童為對照組，男性23例，女性26例，年齡0.6歲至15.16歲。正常對照組與EVE患兒組年齡和性別無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。標(biāo)本收集均經(jīng)過患者家屬知情同意，本研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會審查通過。

1.2研究方法

1.2.1儀器：FACS Ca1ibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2.2試劑：細(xì)胞因子試劑盒Ⅱ（BDTMCBA Human Th1/Th2Cytokine Kit II，BD Biosciences，應(yīng)用于流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)人檢測T輔助細(xì)胞1/2）。購自美國BD公司的熒光抗體CD25-FITC/CD4-PE/ HLA-DR-APC/CD69PerCP、CD25-FITC/CD8-PE/ HLA-DR-APC/CD69PerCP、磷酸鹽緩沖液 （PBS 0.01mo1/L，pH7.4）和溶血素（FACS1M）。

1.2.3 標(biāo)本采集：兩組入院后24 h內(nèi)采集外周血2.9 m1，分2管，各為0.9 m1、2 m1，分別行T細(xì)胞活化亞群、細(xì)胞因子檢測。

1.2.4T細(xì)胞活化亞群檢測：分別取肝素抗凝的外周血0.3 m1加入3管Fa1con管中，然后分別加入熒光抗體CD25-FITC/CD4-PE/HLA-DR-APC/CD69Per CP、CD25-FITC/CD8-PE/HLA-DR-APC/CD69PerCP，對照管中加入對應(yīng)的同型對照，4℃避光孵育30 min，然后每管分別加入2 m1溶血素，室溫避光孵育20 min，離心棄上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次后，加入PBS 0.3 m1懸浮細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀FACS Ca1ibur（美國BD公司）進(jìn)行檢測，收集20 000個細(xì)胞，使用Ce11 Quest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5細(xì)胞因子檢測：取2 m1外周血，2 h水?。?7℃）后，分離血清。上述試劑置于室溫1 h，混合TNF-a、INF-r、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10捕獲微球，5 min 200 g離心，棄上清。加入同體積血清樣本增強(qiáng)緩沖液，微球重懸避光反應(yīng)30 min，然后每FACS管加入50 μ1藻紅蛋白（PE）熒光抗體，50 μ1標(biāo)準(zhǔn)品和待檢血清，50 μ1混合捕獲微球，混勻。室溫3 h避光孵育，每管加洗液1 m1，5 min 200 g離心，每管加洗液300 μ1，流式細(xì)胞檢測在3 h內(nèi)進(jìn)行。數(shù)據(jù)獲取后，標(biāo)準(zhǔn)曲線自動繪制（使用CBA軟件），樣本中各細(xì)胞因子含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得。細(xì)胞因子的檢測的范圍為上限5000.0 pg/m1和下限1.0 pg/m1。

1.2.6腦脊液腸道病毒DNA檢測方法：上海之江生物科技股份有限公司的腸道病毒通用型、EV71型、CA16型核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀，檢測方法按試劑盒說明書操作。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。首先通過K-S檢驗，對資料進(jìn)行分布特征分析，如為非正態(tài)性分布數(shù)據(jù)，則采用Mann-Whitney U檢驗；如為正態(tài)性分布數(shù)據(jù)，則采用獨立樣本的t檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患兒外周血T細(xì)胞活化亞群的表達(dá)含量

14例EVE患兒外周血中 CD69/CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+的表達(dá)含量分別為（1.193± 2.849）%，（0.696±1.242）%與對照組（2.595± 4.134）%，（2.422±2.697）%相比，有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.722，P=0.006；Z= -3.321，P=0.001）。而外周血 CD25+/CD3+ CD4+、CD25+/CD3+CD8+、HLA-DR+/CD3+ CD4+、HLA-DR+/CD3+CD8+的表達(dá)含量與正常對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表1）。

表1　腸道病毒性腦炎患兒與正常對照兒童T細(xì)胞活化亞群表達(dá)（%，±s）Tab.1 The 1eve1s of CD25+/CD3+CD4+，HLA-DR/CD3+CD4+，CD69+/CD3+CD4，CD25+/CD3+CD8+，HLA-DR/CD3+CD8+，+CD69+/CD3+CD8+，expression in periphera1 b1ood（%，±s）

表1　腸道病毒性腦炎患兒與正常對照兒童T細(xì)胞活化亞群表達(dá)（%，±s）Tab.1 The 1eve1s of CD25+/CD3+CD4+，HLA-DR/CD3+CD4+，CD69+/CD3+CD4，CD25+/CD3+CD8+，HLA-DR/CD3+CD8+，+CD69+/CD3+CD8+，expression in periphera1 b1ood（%，±s）

組別Group例數(shù)n CD25+ /CD4+CD3+ HLA-DR+ /CD3+CD4+ CD69+ /CD3+CD4 CD25+ /CD3+CD8+ HLA-DR+ /CD3+CD8+ CD69+ /CD3+CD8+ EVE　14　7.256±5.362　7.256±9.367　1.193±2.849　0.886±0.969　17.983±12.634　0.696±1.242正常對照組Contro1 group　43　9.863±5.230　6.645±3.574　2.595±4.134　1.463±1.405　22.028±12.543　2.422±2.697 t/Z　t=1.355　Z=-1.242　Z=-2.722　Z=-1.451　t=0.5147　Z=-3.321 P 0.1827　0.214　0.006　0.147　0.6077　0.001

表2　腸道病毒性腦炎患兒與正常對照兒童細(xì)胞因子的表達(dá)水平（pg/m1，±s）Tab.2 The 1eve1s of IL-2，IL-4，IL-6、IL-10，TNF-α，INF-γexpression in periphera1 b1ood（pg/m1，±s）

表2　腸道病毒性腦炎患兒與正常對照兒童細(xì)胞因子的表達(dá)水平（pg/m1，±s）Tab.2 The 1eve1s of IL-2，IL-4，IL-6、IL-10，TNF-α，INF-γexpression in periphera1 b1ood（pg/m1，±s）

組別Group　例數(shù)n　IL-2　IL-4　IL-6　IL-10　TNF-α　INF-γ EVE　24　3.342±1.089　3.05±0.79455 123.046±355.349 6.383±7.883　3.367±1.717　9.338±9.058正常對照組Contro1 group　49　4.114±1.292　3.108±0.855　12.412±28.988　4.398±2.621　2.039±0.746　6.292±3.438 t/Z　Z=-2.722　Z=-0.429　Z=-3.471　Z=-0.523　Z=-4.803　Z=-1.480 P 0.019　0.668　0.001　0.601　0.000　0.139

2.2兩組患兒外周血細(xì)胞因子的表達(dá)水平 24例EVE患兒外周血中，病例組IL-2的表達(dá)水平（3.342 ±1.089 pg/m1）低于對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義（Z= -2.722，P=0.019）；而 IL-6，TNF-α的表達(dá)水平（123.046±355.349；3.367±1.717pg/m1），與對照組相比，有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z= -3.471，P=0.001；Z=-4.803，P＜0.001）。外周血IL-4、IL-10和INF-γ的表達(dá)水平與正常對照組比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表2）。

3 討論

腸道病毒是引起急性神經(jīng)系統(tǒng)感染一種較常見的病原［9］，通過唾液、糞便污染的物品而密切接觸傳播，所以特別容易在幼兒園或者小學(xué)的兒童中流行爆發(fā)。近來由于腸道病毒引起的小兒病毒性腦炎表現(xiàn)多樣而復(fù)雜，缺乏特異性的癥狀與體征，病因?qū)W診斷困難，所以常有漏診、誤診［9］，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，已有研究闡述免疫因素對發(fā)病有一定的作用［5］。本研究就EVE外周血T細(xì)胞活化亞群、細(xì)胞因子表達(dá)異常進(jìn)一步闡明其急性期存在免疫功能紊亂。

CD69又稱活化誘導(dǎo)分子（activation inducer mo1ecu1e，AIM），早期活化抗原一1（ear1y activation antigen一1，EA-1），有研究表明，CD69表達(dá)量的顯著增高，表明了T細(xì)胞活性的增強(qiáng)［10］。因此，被認(rèn)為是T細(xì)胞活化的早期標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)病例組外周血CD69/CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+的表達(dá)含量低于對照組，提示EVE存在T細(xì)胞早期活化受到抑制，有所減少。而CD25+/CD3+CD4+、CD25+/CD3+CD8+、HLA-DR+/CD3+CD4+、HLA-DR+/CD3+CD8+與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，未提示T細(xì)胞早期活化受到抑制，考慮可能與病程有關(guān)。

IL-2在調(diào)節(jié)感染的免疫應(yīng)答和免疫病理的過程中起著非常重要的作用［11，12］。IL-2的功能的正常發(fā)揮最終能夠增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的活性，抑制病毒感染或其它相關(guān)病理變化。但是如果IL-2的產(chǎn)生或表達(dá)異常，則會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。在本研究中，檢測病例組外周血細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)IL-2的表達(dá)水平明顯低于對照組，提示腸道病毒性腦炎患者的免疫功能低下，主要表現(xiàn)在Th細(xì)胞分泌IL-2的能力減少，從而反映了T細(xì)胞免疫功能的低下與紊亂。另外IL-2能夠刺激NK細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ，增強(qiáng)細(xì)胞毒效應(yīng)，而其表達(dá)的減少可能抑制INF-γ的水平。在本研究中，EVE患者與正常對照組相比較，INF-γ的表達(dá)水平?jīng)]有顯著統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，其原因有待進(jìn)一步探討。

TNF-α有兩個主要的作用，一是它可引起宿主嚴(yán)重的病理損害如損傷、發(fā)熱、休克等，主要是因為其可作為病菌感染時重要的炎癥遞質(zhì)；二是它能夠防御病原微生物的侵入，主要通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能［11，12］。在本研究中，TNF-α的表達(dá)水平，EVE患者與正常對照組相比，明顯增加。TNF-α是由Th1分泌的促炎因子，外周血中檢測其表達(dá)的升高，提示在疾病的發(fā)展過程中，其分泌可能升高。病毒激活的炎癥級聯(lián)反應(yīng)中，TNF-α是最先激活的細(xì)胞因子，它又能夠誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生，因此，在本研究中亦發(fā)現(xiàn)EVE患者的IL-6的表達(dá)水平明顯升高。IL-2的表達(dá)減少，以及IL-6、TNF-α過度分泌，破壞了平衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)功能紊亂，加重了免疫病理損傷。這些結(jié)果表明 IL-2、IL-6以及TNF-α在EVE的發(fā)生和發(fā)展中可能有重要作用。

本研究顯示EVE患兒急性期外周血 CD69/ CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+，IL-2的表達(dá)含量降低，IL-6、TNF-α表達(dá)水平升高，提示T細(xì)胞活化亞群和細(xì)胞因子可能參與了EVE的發(fā)病過程，并使機(jī)體出現(xiàn)一定程度的免疫功能紊亂，引起免疫損傷，導(dǎo)致相應(yīng)的臨床癥狀。因此，細(xì)胞因子IL-2、IL-6和TNF-α，以及T細(xì)胞亞群CD69/CD3+CD4+、CD69/ CD3+CD8+的表達(dá)水平可以作為診斷腸道病毒性腦炎輔助指標(biāo)。對于是否需在腸道病毒性腦炎病程急性期進(jìn)行一定的免疫調(diào)節(jié)干預(yù)尚有待進(jìn)一步的臨床研究。

［1］ 孫毅，靳艷，黃衛(wèi)東，等.腸道病毒腦炎39例病原學(xué)及影響其預(yù)后的相關(guān)因素分析.中國小兒急救醫(yī)學(xué)，2006，13：154-155.doi：110.3760/cma.j.issn.1673-4912.2006.3702.3027.

［2］ Frantzidou F，Kamaria F，Dumaidi K，et a1.Aseptic meningitis and encepha1itis because of herpesviruses and enteroviruses in an immunocompetent adu1t popu1ation.Eur J Neuro1 2008；15：995-997.doi：910.1111/j.1468-1331.2008.02233.x.

［3］ Marques FB，Conde M，Pinto M，Moreira A.Autism spectrum disorder secondary to enterovirus encepha1itis.J Chi1d Neuro1，2013，29：708-714.doi：710.1177/08830 73813508314.

［4］ Sapka1 GN，Bondre VP，F(xiàn)u1ma1i PV，et a1.Enteroviruses in patients with acute encepha1itis，uttar pradesh，India.Emerging Infectious Diseases，2009，15：295-298.doi：210.3201/ eid1502.080865.

［5］ Jain S，Pate1 B，Bhatt GC.Enterovira1 encepha1itis in chi1dren：c1inica1 features，pathophysio1ogy，andtreatment advances. Pathogens and G1oba1 Hea1th，2014，108：216-222.doi：210. 1179/2047773214Y.0000000145.

［6］ Pi11ai S，Tantsis E，Pre1og K，et a1.Confirmed enterovirus encepha1itis with associated steroid-responsive acute disseminated encepha1omye1itis：an over1apping infection and inf1ammation syndrome.Eur J Paediatr Neuro1，2015，19：266-270.doi：210.1016/j.ejpn.2014.1012.1015.

［7］ Granerod J，Cunningham R，Zuckerman M，et a1.Causa1ity in acute encepha1itis：defining aetio1ogies.Epidemio1ogy and Infection，2010，138：783-800.doi：710.1017/S09502688 10000725.

［8］ 劉華，龍振晝，池宏亮，等.兒童腸道病毒性腦炎234例流行病學(xué)及臨床分析.熱帶醫(yī)學(xué)雜志2014，14：324-326.

［9］ 尤克友，李克誠，章國忠，等.腸道病毒腦炎的季節(jié)分布及臨床特點.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，12：12-14.doi：10.3969/j. issn.1673-9701.2011.3912.3006.

［10］ 李珊珊，馬春華，李璐，等.H BV相關(guān)慢加急性肝功能衰竭患者外周血單核細(xì)胞CD1 63和CD69的表達(dá)及其與病情、預(yù)后的關(guān)系.肝臟，2014，19：8-11.doi：10.14000/j.cnki.issn. 11008-11704.12014.14001.14016

［11］ 茅君卿.化療后粒細(xì)胞缺乏患兒感染時Th1/Th2細(xì)胞因子動態(tài)檢測的臨床意義［D］.2009，浙江大學(xué).

［12］ 萬政.膿毒癥患兒細(xì)胞因子水平及臨床意義［D］.2008，浙江大學(xué).

The T cell activation and cell factor's changes in enterovirus encephalitis children

Fang Chunyan，Zou Xiaojie，Yuan Zhefeng，Huang Minghai，Gao Feng The Children's Hospital Affiliated Medical school of Zhejiang University，Hangzhou，310000，China（Fang CY，Yuan ZF，Gao F）；Huzhou Central Hospital，Huzhou，313000，China（Zou XJ）；Ningbo Women& Children's Hospital，Ningbo，315000，China（Fang CY，Huang MH）

Gao Feng，Email：peakgf@126.com

Objective To exp1ore the action of immune function in Enterovirus Encepha1itis（EVE）chi1dren by detecting the T ce11 activation and ce11 factors.Methods 24 infant patients with EVE hospita1ized in the wards of department of neuro1ogy of the Chi1dren's Hospita1 Affi1iated to Medica1 Schoo1 of Zhejiang University from June 2014 to Ju1y 2015 were se1ected as the experimenta1 group，14 of the 24 patients were detected for the T ce11 activation.Whi1e another 49 hea1thy infants accepting physica1 check in the same period were se1ected as the contro1 group.F1ow cytometry was adopted to detect the periphera1 b1ood CD25+/CD3+CD4+，CD69+/CD3+CD4+，HLA-DR+/CD3+CD4+，CD25+/CD3+CD8+，CD69+/CD3+CD8+，HLA-DR+/CD3+CD8+，and IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α，IFN-γ 1eve1s of the two groups.Results The periphera1 b1ood CD69/CD3+CD4+、CD69/CD3+CD8+ expression 1eve1s（1.193%±2.849%，0.696% ±1.242%）of the experiment group were 1ower than those of the contro1 group（Z=-2.722，P=0.006；Z=-3.321，P=0.001）.The expression 1eve1 of the periphera1 b1ood IL-2（3.342±1.089 pg/m1）was 1ower than that of the contro1 group（Z=-2.722，P= 0.019）；whi1e the expression of IL-6 and TNF-α（123.046±355.349；3.367±1.717pg/m1）were significant1y higher than the contro1 group（Z=-3.471，P=0.001；Z=-4.803，P＜0.001）。Conclusion There is certain degree of immune dysfunction in EVE patients，T ce11 activation subgroup and the ce11 factors may participate in the morbidity progress of EVE.

Enterovirus Encepha1itis；CSF enterovirus DNA positive；T ce11 activation subgroup；Ce11 factor

高峰，Emai1：peakgf@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.015

2016-01-31）