陜西省漢灘病毒分離株全基因組序列分析及生物學(xué)特性研究

馬穎欣 余鵬博 張全福 李建東 王世文 李德新

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（馬穎欣、張全福、李建東、王世文、李德新）；陜西省疾病預(yù)防控制中心（余鵬博）馬穎欣、余鵬博并列第一作者

陜西省漢灘病毒分離株全基因組序列分析及生物學(xué)特性研究

馬穎欣 余鵬博 張全福 李建東 王世文 李德新

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（馬穎欣、張全福、李建東、王世文、李德新）；陜西省疾病預(yù)防控制中心（余鵬博）
馬穎欣、余鵬博并列第一作者

目的 從腎綜合征出血熱（HFRS）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（periphera1 b1ood 1eukocytes，PBMC）中分離漢坦病毒，并對(duì)分離株全基因組序列測(cè)定及進(jìn)化分析。方法 采集急性期HFRS患者外周血，分離PBMC后與Vero-E6細(xì)胞混合培養(yǎng)分離漢坦病毒，通過(guò)Rea1-time PCR和IFA法檢測(cè)，擴(kuò)增分離株全基因組片段進(jìn)行序列測(cè)定及分析，并采用SX26分離株樣本與HFRS患者恢復(fù)期血清和免疫接種者血清各50份進(jìn)行微量中和試驗(yàn)。結(jié)果 成功分離到兩株漢灘型毒株并獲得全基因組序列，進(jìn)化分析顯示與西安分離株XAAa10091712同源性較高；微量中和試驗(yàn)結(jié)果顯示50份HFRS患者恢復(fù)期血清分別中和分離株SX26與疫苗株Z10，中和抗體滴度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另50份免疫接種者血清樣本針對(duì)SX26和Z10毒株產(chǎn)生的中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為72%及88%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 通過(guò)PBMC分離漢坦病毒可作為病毒分離的另一種途徑；流行株與Z10疫苗株的抗原性存在差別，疫苗株產(chǎn)生的抗體中和流行株效果較弱，提示病毒進(jìn)化過(guò)程中已發(fā)生部分變異，為疫苗免疫效果研究和腎綜合征出血熱的防治工作提供依據(jù)。

【主題詞】 漢坦病毒；病毒分離；外周血單個(gè)核細(xì)胞；全基因組測(cè)序；進(jìn)化分析；微量中和試驗(yàn)

Fund programs：Nationa1 Science and Techno1ogy Major Project of China“Infectious disease 1aboratory monitoring of core techno1ogy and techno1ogy system research”（2012ZX10004215）；Nationa1 Science and Techno1ogy Infrastructure Program“The techno1ogy research for the prevention and contro1 of ka1a azar，ma1aria，vira1 hemorrhagic fever”（2014BAI13B05）

漢坦病毒（Hantavirus，HV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，為有包膜分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，主要引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with rena1 syndrome，HFRS）［1，2］。目前HV分離難度較大，多數(shù)研究以鼠肺途徑分離為主，而人源分離株的相關(guān)報(bào)道較少，且主要來(lái)自于HFRS患者外周血或血漿。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3，4］，HFRS發(fā)病機(jī)制與外周血單個(gè)核細(xì)胞（periphera1 b1ood 1eukocytes，PBMC）密切相關(guān)，有研究證明可從患者PBMC中分離出PUUV型漢坦病毒［5］，我國(guó)學(xué)者也曾用該方法分離到漢坦病毒［3］。因此本研究嘗試從PBMC中分離漢坦病毒，并通過(guò)序列分析研究陜西省西安地區(qū)漢坦病毒流行毒株情況，為驗(yàn)證PBMC途徑分離方法以及進(jìn)一步研究宿主源與人源分離株的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病毒、抗體、細(xì)胞 漢灘病毒84FLi株、漢城病毒L99株以及抗核蛋白抗體L13F3均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所出血熱室提供；非洲綠猴腎上皮（Vero-E6）細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)中心（ATCC）；細(xì)胞培養(yǎng)基MEM及胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2樣本采集及外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離

于2014年11月—2015年1月，在陜西省西安市八院采集急性發(fā)熱期HFRS患者外周血38份，恢復(fù)期患者血清樣本29份，膠體金方法（廈門波生生物技術(shù)公司）檢測(cè)IgM、IgG抗體后進(jìn)行PBMC分離；另恢復(fù)期患者血清樣本31份，漢坦病毒疫苗免疫接種者血清50份由陜西省疾病預(yù)防控制中心提供。PBMC分離方法如下，抗凝血8 m1與等量Hank's液混勻后緩緩覆蓋到 16 m1淋巴細(xì)胞分離液（HisTOPAQUE-1077，Sigma）上，400 g水平離心30 min；吸出白色PBMC層，無(wú)菌PBS溶液洗一遍后用完全培養(yǎng)基重懸備用。

1.3漢坦病毒分離 取上述PBMC與Vero-E6細(xì)胞用MEM細(xì)胞維持液（含2%FBS）1∶1混合培養(yǎng)（37℃，5%CO2），每4～6 d換液，21 d后進(jìn)行次代盲傳，每代細(xì)胞上清液進(jìn)行Rea1-time PCR檢測(cè)，細(xì)胞制備抗原片進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，三代均為陰性的樣本視為未分離出病毒。

1.4Real-time PCR及間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)

根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)（RNeasy Mini Kit，Qiagen），提取待測(cè)樣本RNA作為Rea1-time PCR檢測(cè)模板，采用一步法熒光定量 RT-PCR試劑盒（AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit，ABI）按說(shuō)明書(shū)配制25 μ1雙重反應(yīng)體系，其中HTNV型和SEOV型引物及探針均由本科室提供。反應(yīng)條件為50℃30 min，95℃15 s，60℃45 s，共40個(gè)循環(huán)進(jìn)行熒光檢測(cè)。取核酸陽(yáng)性樣本制備抗原片，抗核蛋白鼠單抗L13F3（1∶100稀釋）為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗鼠IgG抗體（Sigma）作為二抗，選擇漢灘病毒84FLi株感染的Vero-E6細(xì)胞和正常Vero-E6細(xì)胞制備的抗原片作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，紫外熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5空斑純化試驗(yàn) 將Vero-E6細(xì)胞傳至6孔板并長(zhǎng)滿單層，病毒分離株進(jìn)行10倍梯度稀釋，接種于細(xì)胞表面，1.5 h后加入第一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基；7 d后加入第二層含3.3%中性紅溶液（Sigma）的瓊脂糖固體培養(yǎng)基，出斑后用毛細(xì)吸管挑取形狀規(guī)則的獨(dú)立斑，傳至單層Vero-E6細(xì)胞的6孔板中，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)連續(xù)挑斑三代進(jìn)行病毒純化。

1.6分離株全基因組序列測(cè)定及進(jìn)化分析 以分離株病毒RNA為模板，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)（Transcriptor High Fide1ity cDNA Synthesis Kit，Roche公司）合成cDNA，并以此為模板，擴(kuò)增全基因組片段（FastStart High Fide1ity PCR System，Roche），1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增片段測(cè)序由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。用DNASTAR軟件分析病毒全基因組序列，與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中漢坦病毒序列比對(duì)，通過(guò)MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行同源性分析。

1.7微量中和試驗(yàn) 將采集的恢復(fù)期和疫苗免疫血清56℃水浴30 min滅活，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，從1∶10開(kāi)始進(jìn)行2倍梯度稀釋，50 μ1稀釋血清與等體積的病毒稀釋液（100TCID50）混合，4℃中和過(guò)夜后加入100 μ1 Vero-E6細(xì)胞懸液（105個(gè)細(xì)胞/ m1），每稀釋度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，7 d培養(yǎng)后棄上清，細(xì)胞用丙酮固定后用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的L13F3抗體檢測(cè)，比較同一份血清樣本對(duì)不同毒株的中和抗體滴度區(qū)別。

2 結(jié)果

2.1樣本信息及IgM、IgG抗體檢測(cè) 外周血樣本共計(jì)38例，均采自發(fā)病3～6 d，其中男性31例、女性7例，男性多于女性，最高體溫平均38.8℃，IgM抗體陽(yáng)性率91.4%，IgG抗體陽(yáng)性率42.8%，其中IgM（+）且IgG（-）19例，占50%。

2.2熒光定量PCR及IFA檢測(cè) 38份樣本的PBMC經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示僅一例陽(yáng)性，盲傳三代后有2例樣本的IFA結(jié)果顯示陽(yáng)性（圖1），圖中可見(jiàn)特異性針尖樣綠色熒光灶，且熒光定量PCR顯示為HTNV型漢坦病毒，即證明分離得到兩株漢灘型病毒，分別命名為SX26和SX27。

2.3空斑純化試驗(yàn) SX26和SX27病毒分離株感染Vero-E6細(xì)胞后，均于第7天左右出現(xiàn)空斑（圖2），空斑呈大小不等的類圓形，直徑約為0.5～1.0 mm，計(jì)算每孔出斑數(shù)量，獲得空斑滴度分別為2× 106和2×105PFU/m1。

圖1　間接免疫熒光法檢測(cè)分離株漢坦病毒抗原Fig.1 Ana1ysis of antigen of HV iso1ates by immunof1uorescence assay

2.4SX26、SX27序列系統(tǒng)進(jìn)化及同源性分析BLAST檢索相關(guān)毒株序列，并用 MEGA 6.0和DNASTAR軟件包中的MegA1ign軟件進(jìn)行比對(duì)及構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果顯示兩分離株S片段在進(jìn)化樹(shù)上高度同源，核苷酸相似性為97.3%，與西安分離株XAAa10091712同源性較高，與漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株76-118、疫苗構(gòu)成株Z10和漢城型毒株同源性較低，核苷酸相似性分別為96.9% ～98.4%、86% ～87%、89%和73%左右；L片段與S片段結(jié)果類似，與西安分離株XAAa10091712同源性較高，分別為98.6%和95.6%；而與漢灘病毒代表株同源性均在85.0%以下；M片段與天津分離株TJJ16同源性最高，為98.4% ～96.2%，與漢灘病毒代表毒株76-118及疫苗株Z10的同源性均在84%左右，與漢坦病毒其他型別毒株同源性低于80%。S、M及L三個(gè)片段的氨基酸同源性均約為95%～99%左右。

2.5微量中和試驗(yàn)

2.5.1患者恢復(fù)期血清中和抗體滴度分析：同一份恢復(fù)期血清樣本針對(duì)SX26和Z10毒株的中和抗體滴度，呈現(xiàn)4倍及以上差別的共29例（圖4）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)配對(duì)秩和檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P=0.001＜0.05，即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示目前陜西省本地流行株與漢坦病毒疫苗株的抗原性存在一定差異。

圖2　空斑純化實(shí)驗(yàn)鑒定分離株漢坦病毒抗原Fig.2 Identification of HV iso1ates using p1aque forming test

圖3　漢坦病毒部分S、M及L片段系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 Phy1ogenetic ana1ysis of partia1 S、M and L segment of Hantavirus

圖4　患者恢復(fù)期血清中和抗體滴度分析Fig.4 The neutra1ization antibody titer of conva1escent serum samp1e

2.5.2疫苗免疫者血清中和抗體滴度分析：根據(jù)中國(guó)藥品生物制品檢定所相關(guān)研究［6］，確定中和抗體滴度≥1∶10為抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，則50份免疫接種者血清樣本針對(duì)SX26及Z10毒株的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為72%及88%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析（表1）顯示P=0.046 ＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示疫苗接種后針對(duì)陜西分離株產(chǎn)生的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率低于Z10毒株，推測(cè)目前所使用的漢坦病毒疫苗針對(duì)西安市流行毒株的免疫效果較弱。

3 討論

我國(guó)HFRS發(fā)病率較高，以HTN和SEO型病毒感染為主［7］，陜西歷年發(fā)病位居全國(guó)前列，2010-2012年出現(xiàn)明顯的報(bào)告病例數(shù)上升，監(jiān)測(cè)顯示可能與嚙齒動(dòng)物帶毒率較高相關(guān)［8］。近期研究報(bào)道該地區(qū)黑線姬鼠鼠肺中分離到漢灘型毒株［9］，而從患者中分離到漢坦病毒毒株報(bào)道較少。

表1　免疫接種者血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率比較Tab.1 The comparision of serum conversion rate of antibody after HFRS vaccine inocu1ation

根據(jù)以往病毒分離經(jīng)驗(yàn)，由于HFRS患者體內(nèi)病毒載量低，以及外周血中和抗體IgM和IgG阻礙病毒感染等原因，較難從外周血中分離到病毒，但外周血單個(gè)核細(xì)胞與漢坦病毒發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，研究顯示其原因可能是PBMC結(jié)合的病毒能夠避免與抗體結(jié)合［3］。Juto等［5］報(bào)道從PBMC中分離到漢坦病毒普馬拉型（PUUV），我國(guó)學(xué)者楊為松等［3］研究也顯示可通過(guò)此方法分離到漢坦病毒，且與血清分離法相比分離率較高。另有研究報(bào)道［10］通過(guò)RTPCR方法，檢測(cè)到早期流行性出血熱患者的PBMC中，HV核酸陽(yáng)性率較高，這可能提示患者PBMC中出血熱病毒有較高結(jié)合水平。因此，我們采集急性期HFRS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，嘗試此方法進(jìn)行病毒分離并成功獲得兩株漢灘型毒株。本研究初始階段采用Rea1-time PCR方法對(duì)PBMC樣本的核酸進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率均較低，與以往研究結(jié)果有一定差異，可能與檢測(cè)方法的靈敏度以及PBMC中病毒載量有關(guān)，但經(jīng)過(guò)三代盲傳后病毒分離成功，揭示漢坦病毒確與出血熱患者的PBMC有一定結(jié)合，但其主要免疫效應(yīng)細(xì)胞群尚不清楚［4］。研究結(jié)果證實(shí)PBMC分離方法可作為漢坦病毒分離的另一種途徑，且為進(jìn)一步研究該地區(qū)漢坦病毒流行株提供依據(jù)。

研究獲得兩株漢坦病毒SX26和SX27全基因組序列，通過(guò)進(jìn)化分析，與陜西省A16株病毒在同一分支，根據(jù)文獻(xiàn)［11］，推斷分離株S片段和M片段均屬 H9亞型，與 2010年新發(fā)現(xiàn)西安分離株XAAa10091712同源性較高，提示屬于同一亞型，符合漢坦病毒具有地區(qū)聚集性特點(diǎn)［12］，而與西安分離株84FLi和疫苗株Z10的核苷酸同源性較低，且M片段變異更大，而M片段編碼包膜糖蛋白，存在漢坦病毒中和抗原位點(diǎn)，是病毒毒力的主要決定因素［13］，該變異可能造成本地流行株與疫苗株的抗原性差異，降低疫苗株刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的中和活性，與微量中和試驗(yàn)研究結(jié)果吻合?；颊呋謴?fù)期血清和疫苗免疫血清對(duì)中和流行毒株和疫苗株的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明西安地區(qū)漢坦病毒流行株與Z10疫苗株的抗原性差別較大，且與疫苗株產(chǎn)生的中和抗體中和效果較弱，提示在進(jìn)化過(guò)程中病毒已發(fā)生部分變異，但漢坦病毒疫苗的人群保護(hù)率還需進(jìn)一步驗(yàn)證，這為改進(jìn)研究疫苗免疫效果和腎綜合征出血熱的防治工作提供依據(jù)。

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Complete genome sequence analysis of the Hantaan viruses isolated from Shaanxi Province and its Characteristics

M
a Yingxin，Yu Pengbo，Zhang Quanfu，Li Jiandong，Wang Shiwen，Li DexinNational Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China.（Ma YX，Zhang QF，Li JD，Wang SW，Li DX）Shaanxi Provincial Centre for Disease Control and Prevention，Xi′an 710054，Shaanxi，China（Yu PB）Ma Yingxin and Yu Pengbo are the first autlurs who contributed equally to this article

Li Dexin，Email：lidx@chinacdc.cn

Objective To sequence the who1e genome and to ana1yze the mo1ecu1ar and evo1utionary of Hantavirus（HV）iso1ated from periphera1 b1ood 1eukocytes（PBMC）of HFRS patients.Methods PBMC were iso1ated from periphera1 b1ood of HFRS patients and cocu1tured with Vero-E6 ce11s.Quantitative rea1-time RT-PCR and IFA tests were used to detect virus titer.The genome segments were amp1ified by PCR with predesigned primers，who1e sequence were obtained and further study on its evo1ution was ana1yzed. The differences between the iso1ate strains and Vaccine strain were tested by microneutra1ization test.Results Two Hantaan virus strains were iso1ated from PBMC of HFRS patients successfu11y.The who1e genomic fragments were obtained.Mo1ecu1ar phy1ogenetic ana1ysis resu1t showed that both of the strains had the comparative1y high simi1arity with XAAa10091712 strain.The seroneutra1ization titer of SX26 and Z10 had significant differences.Conclusion Hantaan virus cou1d be successfu11y iso1ated from PBMC of HFRS patients，and it proved to be a feasib1e way of iso1ation of hantavirus from periphera1 white b1ood ce11s；The microneutra1ization test proved that the antigenicity of two strains exist significant differences.It provided basis for the further study of hantavirus epidemic strains in this region.

Hantavirus；virus iso1ation；periphera1 b1ood mononuc1ear ce11；genome sequencing；phy1ogenetic ana1ysis；microneutra1ization test

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題“傳染病實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)核心技術(shù)和技術(shù)體系研究”（2012ZX10004215）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃“黑熱病、瘧疾與病毒性出血熱綜合防治技術(shù)研究”（2014BAI13B05）

李德新，Emai1：1idx@chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.008

2016-02-26）