鴨血球短肽的優(yōu)化制備及其特性研究

鄭召君　余占橋　衛(wèi)旭彪　張日俊*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100192)

?

鴨血球短肽的優(yōu)化制備及其特性研究

鄭召君1余占橋2衛(wèi)旭彪1張日俊1*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100192)

本試驗(yàn)旨在篩選水解效率高且脫色效果好的商業(yè)蛋白酶，建立血球短肽的優(yōu)化工藝，比較其在酶解前后營養(yǎng)特性的變化，研究其功能特性與體外抗氧化能力，以研發(fā)功能性血球短肽產(chǎn)品，為家禽血液資源高值化的轉(zhuǎn)化利用與深度挖掘提供理論依據(jù)與技術(shù)借鑒。比較酶種類、酶濃度、溫度、pH、水解時(shí)間等因素對(duì)蛋白酶水解度(DH)、脫色程度、水解物產(chǎn)量的影響，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化血球短肽的最佳工藝，對(duì)血球短肽進(jìn)行營養(yǎng)價(jià)值、功能特性及抗氧化性能評(píng)價(jià)。確定酸性蛋白酶為最佳水解酶，其水解鴨血球蛋白制備短肽的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶用量6 000 U/g，溫度50 ℃，pH 3.5，水解時(shí)間7.0 h。在此條件下，水解度為(25.10±0.65)%，水解物產(chǎn)量為(60.09±1.77)%。通過高效液相色譜分析水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布。結(jié)果表明，酶解對(duì)血球蛋白有明顯的降解作用，酶解產(chǎn)物主要以3 ku以下的短肽為主，其中1 ku以下占大部分(62.82%)。血球短肽粉呈乳白色，氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量豐富(53.31%)，鴨血球蛋白酶解后的溶解性大大提高(>60%)，且具有良好的乳化穩(wěn)定性。血球短肽清除自由基能力較強(qiáng)，隨血球蛋白濃度的提升，清除1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·)與超氧陰離子能力隨之愈強(qiáng)，還原力也逐漸增加。由此可見，酸性蛋白酶可有效水解鴨血球蛋白獲得氨基酸含量豐富、溶解性好且具有抗氧化活性的乳白色血球短肽，可以作為功能性原料應(yīng)用于食品與飼料中。

血球短肽；酸性蛋白酶；功能特性；抗氧化活性

血液是家禽肉類加工的副產(chǎn)物，占體重的6%～8%，其營養(yǎng)價(jià)值豐富，蛋白質(zhì)含量高(17%～22%)，脂肪含量低(0.15%～0.20%)，素有“液態(tài)肉”的美譽(yù)[1-2]。中國是畜禽養(yǎng)殖大國，2013年家禽出欄數(shù)為119億羽，血液產(chǎn)量高達(dá)119萬t，除部分被加工成血豆腐、血粉等低附加值的產(chǎn)品及用于生化制藥生產(chǎn)血紅素、超氧化物歧化酶、蛋白胨外，開發(fā)的產(chǎn)品較單調(diào)，深加工程度低，浪費(fèi)了寶貴的蛋白質(zhì)資源。血球蛋白是血液中最主要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白質(zhì)的2/3，由于其色澤猩紅、金屬味重、難貯藏以及消化利用率低，而難以開發(fā)利用。利用酶工程水解蛋白質(zhì)目前已成為血球蛋白高效利用的重要方向，它可以將難以消化利用的大分子蛋白質(zhì)水解成肽及L-氨基酸，水解后獲得的血球短肽還具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制[3-4]、阿片樣活性[5-6]、刺激細(xì)菌生長[7]、止痛[8]、抗菌[9-10]及抗氧化[11-12]等生理活性，大大提高其營養(yǎng)價(jià)值和功能特性。綜上可見，優(yōu)化建立血球酶解工藝，研發(fā)高功能性短肽產(chǎn)品，探討其營養(yǎng)特性、功能性質(zhì)與抗氧化性能，對(duì)家禽血液的高值化利用與推廣具有重要的理論與實(shí)際意義。由于酶法具有反應(yīng)條件溫和、水解過程易于控制、產(chǎn)物營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，大量研究學(xué)者采用蛋白酶水解不同蛋白質(zhì)以制備高附加值產(chǎn)物。鄧佳等[13]采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行復(fù)合水解以及條件優(yōu)化，水解10 h后得到水解度19.1%的酶解液；Guo等[14]證實(shí)，胰酶(pancreatin)和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(flavourzyme)組合酶水解豬血紅蛋白，總氮得率高達(dá)97.69%，水解液的分子質(zhì)量散亂分布在>15 ku與<1 ku，短肽含量有待進(jìn)一步提高；Sun等[15]采用不同蛋白酶水解豬血紅蛋白，堿性蛋白酶(alcalase)水解效果最好，胃蛋白酶(pepsin)次之，說明酸堿條件有助于提高蛋白質(zhì)水解效果，且水解液中含有抗氧化活性的肽段；于美娟等[1]研究了中性蛋白酶與木瓜蛋白酶復(fù)合水解豬血紅蛋白，水解度(DH)達(dá)24.5%，總氮得率為74.64%；In等[16]研究表明，98%左右的亞鐵血紅素存在于低pH(3～5)、高水解度(>20%)的蛋白質(zhì)沉淀物中，說明酸性條件下高度水解有助于去除血紅素鐵以改善水解液色澤。目前的研究目標(biāo)大多集中于血球蛋白潛在的生理活性探討，而因其含有亞鐵血紅素而導(dǎo)致的“色澤差、適口性差、消化性差”等問題仍未得到妥善解決。如何利用酶解反應(yīng)獲得更多顏色淺、無異味、高水解度的短肽，已成為生產(chǎn)工藝中亟待解決的技術(shù)難題。此外，關(guān)于酶解鴨血球蛋白制備短肽并探討其功能性質(zhì)與抗氧化能力的研究還是有限的。本研究以鴨血球蛋白為原料，通過考察酶種類、酶用量、pH、酶解溫度、時(shí)間對(duì)水解度和水解物產(chǎn)量的影響，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化鴨血球蛋白酶解的最佳工藝，以期獲得色澤佳、無異味、易吸收、氨基酸平衡性好的血球短肽，并考察該產(chǎn)品的功能特性與抗氧化活性，為血球短肽的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

新鮮鴨血球蛋白，由北京鴻順養(yǎng)源生物科技有限公司提供，-20 ℃避光保存?zhèn)溆茫褂们爸糜? ℃過夜解凍。

酸性蛋白酶(5×104U/g)購于北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶(4×104U/g)、堿性蛋白酶(4×104U/g)、木瓜蛋白酶(8×104U/g)和風(fēng)味蛋白酶(1×104U/g)購于南寧龐博生物工程有限公司；對(duì)苯二甲醛(OPA)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·)、鄰苯三酚購自美國Sigma公司；其他試劑均為化學(xué)純。

1.2主要儀器

SD-BASIC噴霧干燥儀，英國LabPlant公司；GL-20G-C高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HYG-A恒溫振蕩器，江蘇省太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蛋白酶的篩選

以蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo)，對(duì)5種蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)進(jìn)行篩選。將血球蛋白配成16%溶液，溫度45 ℃，其中酸性蛋白酶初始pH為3.0，堿性蛋白酶初始pH為8.0，其他蛋白酶的初始pH為7.0，水解時(shí)間均為5 h，分別檢測蛋白質(zhì)的水解度。試驗(yàn)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2工藝流程

鴨血球蛋白酶法水解工藝中關(guān)鍵的步驟是水解度的控制，基本流程見圖1，工藝要點(diǎn)如下。

1)溶血破膜：血球蛋白溶于0.1 mol/L HCl(血球蛋白∶HCl=3∶2，m/v)和去離子水中，制備蛋白質(zhì)濃度16%的溶液，混合均勻后，置于40 ℃、200 r/min振蕩器中反應(yīng)30 min，使血球破壁及蛋白質(zhì)變性。

2)酶解：溶血后的溶液冷卻至室溫，85%乳酸或4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至預(yù)定pH，加入適量蛋白酶，放入轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫振蕩器中進(jìn)行酶解。

3)滅酶：反應(yīng)結(jié)束后，90 ℃水浴15 min滅酶。

4)離心：6 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，去除非溶性物質(zhì)取上清，得到鴨血球蛋白酶解液。

5)噴霧干燥：上清液于進(jìn)口溫度110～130 ℃、出口溫度60～80 ℃的條件下進(jìn)行噴霧干燥成血球短肽粉。

1.3.3水解度測定

蛋白質(zhì)的水解度是指蛋白質(zhì)水解反應(yīng)過程中被裂開的肽鍵的百分?jǐn)?shù)。采用OPA法[17]進(jìn)行水解度測定，取稀釋適宜倍數(shù)的水解液0.4 mL加入3 mL OPA試劑精確反應(yīng)2 min，340 nm測定吸光值。

圖1　酶法水解鴨血球蛋白工藝流程

1.3.4水解物產(chǎn)量

采用Low等[18]方法測定水解物產(chǎn)量(HY)。稱重離心后的水解上清液，其所占的重量百分比即為水解物產(chǎn)量。

1.3.5肽分子質(zhì)量分布檢測

采用高效液相色譜法檢測血球蛋白以及血球肽的分子質(zhì)量分布，配制的多肽樣品與標(biāo)準(zhǔn)品(分子質(zhì)量分別為6 500、13 700、43 000 u)，進(jìn)樣量為100 μL，檢測時(shí)間50 min，根據(jù)峰值與峰面積計(jì)算肽分子質(zhì)量所占百分比。

1.3.6色度檢測

參照Bhaskar等[19]的方法用Minolta CR-410色度儀(日本)分別測定血球蛋白粉和血球短肽粉的色度，亮度(L*)值表示黑-白(亮)度，L*值越大則越白(亮)；紅度(a*)值表示綠-紅色，a*值越大則越紅；黃度(b*)值表示藍(lán)-黃色，b*值越大則越黃。白度(whiteness index，WI)計(jì)算公式如下：

WI=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]/2。

1.3.7氨基酸組成及疏水性分析

采用AminoPac PA10氨基酸分析柱，用積分安培離子色譜法測定樣品中氨基酸含量。

1.3.8血球短肽的苦味評(píng)價(jià)

苦味評(píng)價(jià)包含2部分：一是氨基酸疏水性分析，根據(jù)血球短肽的氨基酸組成，按照Ney[20]的Q準(zhǔn)則可計(jì)算出其中各個(gè)氨基酸的疏水性值△Q，則蛋白質(zhì)的疏水性值Q就等于各個(gè)氨基酸疏水性值△Q的和；二是感官評(píng)價(jià)，稱取1 g血球短肽溶于10 mL無菌水，挑選6名感官評(píng)定人員對(duì)血球短肽溶液進(jìn)行品嘗，鑒定該產(chǎn)物是否含有苦味。

1.3.9功能特性測定

1.3.9.1溶解度的測定方法

參照Liu等[21]方法，稱取干粉0.30 g溶于30 mL去離子水中，用6 mol/L HCl或6 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH(3～8)，攪拌30 min，3 000 r/min離心15 min，采用Bradford法測上清液含氮量，其占總氮含量的百分比即為溶解度。

1.3.9.2乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定方法

采用濁度法[18]。不同pH(3～8)的0.2%(m/v)樣品15 mL與5 mL植物油混合，室溫下20 000 r/min離心1 min，立即吸取50 μL底部乳狀液與5 mL 0.1%SDS混合，500 nm處測吸光值A(chǔ)0。靜置15 min后按同樣方法測定吸光值A(chǔ)15，按如下公式計(jì)算乳化性及乳化穩(wěn)定性：

乳化性(EAI，m2/g) =(2×2.303×A0)/

(0.25×c×100)；

乳化穩(wěn)定性(ESI，min)=A0×15/(A0-A15)。

式中：c為樣品的蛋白質(zhì)濃度。

1.3.9.3起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定方法[21]

0.5%(m/v)干粉溶于30 mL、0.02 mol/L檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH 3～8)，混合均勻，20 000 r/min勻漿1 min，靜置10 min。記錄勻漿前后溶液的體積。起泡性和泡沫穩(wěn)定性表示如下：

起泡性(%)=[(V1-V0)/V0]×100；

泡沫穩(wěn)定性(%)=[(V10-V0)/V0]×100。

式中：V0為勻漿前溶液的體積；V1為勻漿結(jié)束后溶液的體積；V10為靜置10 min后溶液的體積。

1.3.10抗氧化活性測定

1.3.10.1DPPH·清除率測定[22]

1.5 mL不同濃度的肽溶液與1.5 mL DPPH·溶液(1.0 mmol/L)混合，室溫避光反應(yīng)30 min，517 nm處測吸光值。

1.3.10.2超氧陰離子清除率測定[23]

0.1 mL不同濃度的肽粉溶液加入2.8 mL Tris-HCl-乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.2)緩沖液，25 ℃水浴保溫10 min后加入0.1 mL、3 mmol/L鄰苯三酚溶液，迅速混勻，325 nm每30 s測吸光值，5 min結(jié)束。作吸光值隨時(shí)間變化的回歸方程，求其斜率。超氧陰離子清除率表示如下：

清除率(%)=[(V對(duì)照-V樣品)/V對(duì)照]×100。

式中：V對(duì)照為對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率(△A/min)；V樣品為樣品組鄰苯三酚氧化速率(△A/min)。

1.3.10.3還原力測定[11]

1.0 mL樣品與1.0 mL磷酸鈉溶液(pH 6.6)及1.0 mL、1%鐵氰化鉀混合，50 ℃孵化20 min。加入1.0 mL 10%三氯乙酸(TCA)溶液，5 000 r/min離心10 min。2.0 mL上清液與2.0 mL去離子水、0.4 mL、0.1%三氯化鐵混合，室溫靜置10 min，700 nm測吸光值。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用JMP 10.0對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，采用Origin Pro 9.0軟件繪制圖形。

2　結(jié)果與分析

2.1酶的篩選

以水解度為指標(biāo)，對(duì)5種蛋白酶進(jìn)行篩選，其結(jié)果如圖2所示。整體而言，在相同條件下，風(fēng)味蛋白酶的初始水解度最低，但水解速率明顯較其他蛋白酶快；酸性蛋白酶的初始及總體水解度最高，中性蛋白酶次之。因中性蛋白酶成本較高，水解上清顏色為紅棕色需使用其他方法輔助脫色，故而選用酸性蛋白酶作為工具酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2血球酶解正交試驗(yàn)

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定水解鴨血球蛋白的最優(yōu)條件。試驗(yàn)選擇的4個(gè)因素分別為：酶用量、pH、水解溫度和水解時(shí)間，詳見表1。K、k值分別代表各因素水平蛋白質(zhì)水解度與水解物產(chǎn)量的總值、平均值，R值為各因素水平蛋白質(zhì)水解度和水解物產(chǎn)量的極差。較大的K或k值表示優(yōu)先考慮的因素水平，較大的R值表示該因素的影響力較大。

圖2　不同蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響

對(duì)水解度來說，各試驗(yàn)因素對(duì)血球蛋白水解程度的影響主次順序?yàn)樗鈺r(shí)間(D)>溫度(A)>酶用量(C)>pH(B)，即最大影響因素為水解時(shí)間，最小影響因素是pH。此外，由直觀分析的結(jié)果可知，酸性蛋白酶水解血球蛋白最佳因素組合為：酶用量6 000 U/g，溫度50 ℃，pH 3.5，水解時(shí)間7 h。對(duì)于水解物產(chǎn)量來說，影響最大的因素是pH，各因素影響能力依次是pH(B)>溫度(A)>酶用量(C)>時(shí)間(D)，最佳因素組合與水解度的最優(yōu)組合一致。綜合上述結(jié)果，最佳條件是：溫度50 ℃，pH 3.5，酶用量6 000 U/g，水解時(shí)間7 h。由表1可知，該條件與第16個(gè)組合一致，即在最優(yōu)條件下蛋白質(zhì)水解度為(25.10±0.65)%，水解物產(chǎn)量為(60.09±1.77)%。

2.3血球蛋白與血球短肽的分子質(zhì)量分布

采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)血球短肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，血球蛋白洗脫時(shí)間短，洗脫峰相對(duì)單一，主要以大分子質(zhì)量(>10 ku)肽段為主，約占82.34%。血球蛋白經(jīng)過酸性蛋白酶水解，隨著洗脫液體積的增加，樣品分子質(zhì)量(20～80 ku)向低分子質(zhì)量(<10 ku)分布遷移(表2)。大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)被水解為分子質(zhì)量較小的肽段，小分子質(zhì)量肽含量明顯增加，小于10 ku占97.65%，百分含量比未酶解時(shí)提高了80%；而其中以小于3 ku的小分子肽約81.89%，約為未水解的血球蛋白的6.1倍，尤其是低于1 ku的小肽含量明顯增加，寡肽含量豐富。

表1　酶解血球蛋白的正交試驗(yàn)結(jié)果

表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；K、k值分別代表各因素水平蛋白質(zhì)水解度與水解物產(chǎn)量的總值、平均值；R值為各因素水平蛋白質(zhì)水解度、水解物產(chǎn)量的極差；Q代表每個(gè)因素的最優(yōu)水平。

Values in the table are three average values±standard deviation; K, k represent the total DH of protein and hydrolysate yield, average DH of protein and hydrolysate yield, respectively; R value means range between average DH of protein and hydrolysate yield; Q represents the optimal level of four factors.

2.4血球短肽氨基酸組成

表3列出了鴨血球蛋白及血球短肽中常見的17種氨基酸含量。與鴨血球蛋白氨基酸相比，血球短肽的必需氨基酸種類齊全，含量豐富，總結(jié)有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1)異亮氨酸及蛋氨酸含量明顯提高，有效彌補(bǔ)血液及其產(chǎn)品中限制性氨酸(蛋氨酸、異亮氨酸)含量低的缺陷；2)天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸等呈味氨基酸含量約占總氨基酸的31%，這是肽粉呈現(xiàn)圓潤柔和的甜味及鮮味的主要物質(zhì)基礎(chǔ)；3)血球短肽中賴氨酸的含量較豐富，可作為一種很好的谷物蛋白質(zhì)互補(bǔ)物，這對(duì)提高動(dòng)物性蛋白質(zhì)源的利用率及改善飼糧營養(yǎng)具有重要意義；4)血球短肽的必需氨基酸含量占總氨基酸量的一半以上(53.31%)，與非必需氨基酸的比值為1.24，均高于聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)規(guī)定的40%必需氨基酸/總氨基酸(EAA/TAA)與60%必需氨基酸/非必需氨基酸(EAA/NAA)理想蛋白質(zhì)模式，說明該血球短肽粉具有較高的營養(yǎng)價(jià)值；5)與NRC推薦的必需氨基酸模式相比較，多數(shù)必需氨基酸評(píng)分大于1，基本滿足甚至超過肉仔雞以及幼鯉的氨基酸需要。無論1～3周齡肉雞還是幼鯉模式，血球短肽的第一限制性氨基酸均為蛋氨酸，因此使用血球短肽時(shí)需要補(bǔ)充添加適量的蛋氨酸。相關(guān)學(xué)者[19,23]認(rèn)為，氨基酸含量高于最低需要量的30%即表明該蛋白質(zhì)水解物是營養(yǎng)價(jià)值豐富的成分。就此而言，血球短肽因氨基酸平衡且必需氨基酸含量高可作為飼料添加劑應(yīng)用于豬、家禽、水產(chǎn)等養(yǎng)殖領(lǐng)域。

A：血球蛋白 blood corpuscle protein；B：血球短肽 blood corpuscle short peptide。

圖3　血球蛋白與血球短肽的分子質(zhì)量分布圖

2.5血球短肽粉的感官評(píng)價(jià)

鴨血球蛋白經(jīng)噴霧干燥制成的血球蛋白粉呈現(xiàn)紅棕色，具有刺激的血腥味。與鴨血球蛋白粉相比，血球短肽粉的外觀發(fā)生明顯變化，呈乳白色，無明顯的血腥味，觸感細(xì)膩黏滑。采用Minolta CR-410色度儀分別測定血球蛋白粉和血球短肽粉的色度，結(jié)果見圖4。血球短肽粉的L*值與白度(WI)值是血球蛋白粉L*、WI值4倍左右，差異極顯著(P<0.01)，說明血球蛋白經(jīng)酶解后脫色效果明顯，血球短肽粉趨近于乳白色。a*值越大，表示紅色度值越大，紅色度明顯，血球蛋白粉的a*值為9.95，而經(jīng)酶解的血球短肽粉a*值降低了67.23%；經(jīng)酸性蛋白酶處理后的血球短肽粉b*值極顯著高于血球蛋白粉(P<0.01)，這表明酸性蛋白酶水解有助于血球蛋白顏色由紅色向黃色轉(zhuǎn)變。酸性蛋白酶酶解有助于血球蛋白脫色，這主要?dú)w因于在酸性pH條件下，血紅蛋白肽鍵經(jīng)蛋白酶作用而斷裂，亞鐵血紅素或富含亞鐵血紅素的肽段被釋放出來，且亞鐵血紅素難溶于低pH(3.0～5.0)溶液而被滯留在沉淀中，因此獲得乳白色血球短肽粉。

表3　血球短肽的氨基酸組成

1)△Q為每個(gè)氨基酸疏水性值，Q=Σ△Q?！鱍is the hydrophobicity value of every amino acid,Q=Σ△Q.

2)參考NRC(1994)1～3周齡肉雞的必需氨基酸需要量模式。Essential amino acid requirements of broilers (1 to 3 weeks) according to NRC (1994).

3)參考NRC(1993)幼鯉必需氨基酸需要量模式。Essential amino acid requirements of juvenile common carp according to NRC (1993).

4)參考肉雞必需氨基酸需要量得到的血球短肽的氨基酸評(píng)分。The chemical score of blood corpuscle short peptide based on the essential amino acid requirements of broilers.

5)參考幼鯉必需氨基酸需要量得到的血球短肽的氨基酸評(píng)分。The chemical score of blood corpuscle short peptide based on the essential amino acid requirements of juvenile common carp.

在制取短肽過程中，經(jīng)蛋白酶修飾的蛋白產(chǎn)物的口感和風(fēng)味往往會(huì)發(fā)生變化，易產(chǎn)生苦味進(jìn)而限制了水解產(chǎn)物的推廣使用。這主要是是因?yàn)槊杆庵率故杷园被醾?cè)鏈充分暴露出來形成苦味肽。對(duì)血球肽粉進(jìn)行感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)其不具有苦味或澀味等不良風(fēng)味。為避免主觀偏見引起的誤差，對(duì)產(chǎn)物的氨基酸及其疏水性值進(jìn)行分析客觀評(píng)判水解液的苦味度。由表2可知，血球短肽中亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸等疏水性氨基酸均有不同程度地降低。且按照Ney[20]的Q準(zhǔn)則得出血球短肽的Q值為4 304 J/mol，遠(yuǎn)小于5 443 J/mol，說明血球蛋白經(jīng)酸性蛋白酶水解后產(chǎn)物不具有苦味。由上可知，經(jīng)感官評(píng)定及疏水性分析，血球蛋白經(jīng)酸性蛋白酶水解不會(huì)產(chǎn)生苦味活澀味等不良風(fēng)味。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Value columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

圖4酶解前后血球蛋白粉和

血球短肽粉色度差異

Fig.4Color difference between blood corpuscle protein power and blood corpuscle short peptide powder before and after enzymatic hydrolysis

2.6血球短肽的功能性質(zhì)評(píng)價(jià)

2.6.1溶解性

在最佳酶解工藝條件下，血球短肽的溶解性如圖5-A所示。與血球蛋白相比，血球短肽的溶解度均在60%以上，明顯優(yōu)于血球蛋白。隨著溶液pH的逐漸增加，血球短肽和血球蛋白的溶解度均呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì)，在pH為6.0時(shí)溶解度最低。另外，pH 6.0最接近血球蛋白的等電點(diǎn)，酶解產(chǎn)物在等電點(diǎn)附近具有較低的溶解度，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[24]相似。

2.6.2乳化性

圖5-B和圖5-C是血球短肽與血球蛋白的乳化性及其穩(wěn)定性隨pH變化的趨勢(shì)圖。由圖5-B和圖5-C可知，血球短肽表現(xiàn)的乳化能力低于血球蛋白，水解產(chǎn)生小分子肽導(dǎo)致血球短肽的乳化性能降低，這與Liu等[21]、Turgeon等[25]的結(jié)果一致。在pH 6.0時(shí)，血球短肽和血球蛋白的乳化值最低，說明pH 6.0很可能是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，造成大分子物質(zhì)沉淀或其凈電荷丟失，進(jìn)而導(dǎo)致乳化能力降低。相比較之下，血球蛋白的乳化穩(wěn)定性較差，而鴨血球蛋白經(jīng)酶解獲得的血球短肽的乳化穩(wěn)定性的改善非常明顯，酸性環(huán)境中有較好的乳化穩(wěn)定性。

2.6.3起泡性

泡沫是由持久的液體或水相和分散的氣體或空氣相形成的兩相膠狀系統(tǒng)，而蛋白質(zhì)會(huì)引起兩相界面的表面張力降低，從而產(chǎn)生起泡性。血球短肽和血球蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性隨pH變化的趨勢(shì)見圖5-D和圖5-E。與血球蛋白相比，血球短肽在酸性環(huán)境中(pH<7)起泡性較差，但在中性及堿性環(huán)境中的起泡效果較好，這很可能與酸性蛋白酶水解產(chǎn)生的小肽鏈?zhǔn)沟妹附馕锏谋砻婊钚詼p小的緣故。此外，血球短肽的泡沫穩(wěn)定性低于6%，效果不佳，酸性環(huán)境對(duì)血球短肽的起泡性及其穩(wěn)定性影響較大。

2.7血球短肽抗氧化活性分析

血球短肽的抗氧化能力隨蛋白質(zhì)濃度變化的趨勢(shì)見圖6。雖然噴霧干燥時(shí)瞬間高溫破壞了血球短肽的部分活性物質(zhì)，但其仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH·清除能力、超氧陰離子清除能力和還原力。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為2%時(shí)，血球肽粉清除DPPH·的能力超過了80%，之后隨著蛋白質(zhì)濃度的提升，其清除DPPH·的能力接近100%。相比DPPH·清除率，血球短肽清除超氧陰離子的能力相對(duì)較弱，但總體趨勢(shì)是清除能力隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增強(qiáng)。通常而言，樣品的抗氧化能力與還原力呈正相關(guān)，根據(jù)還原力的測定方法，吸光值越大則樣品的還原力越強(qiáng)。由血球短肽的還原力曲線可以看出，還原力與蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)濃度為8%時(shí)，還原力最大為2.02，展現(xiàn)出極佳的還原力。

3　討　論

家禽血液是一種高營養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)源，蛋白質(zhì)含量高達(dá)20%左右，其中60%以上的蛋白質(zhì)來自于血球。本研究表明，血球蛋白含量約占血球重量的38%，賴氨酸等必需氨基酸含量豐富。而血球蛋白主要存在于紅細(xì)胞中，雖然紅細(xì)胞在自然狀態(tài)下會(huì)因血液水分、外界壓力等作用發(fā)生自溶，擠破細(xì)胞膜，產(chǎn)生少量血紅蛋白，但自溶現(xiàn)象發(fā)生率較低，關(guān)聯(lián)因素復(fù)雜而難以控制。因此，蛋白酶水解血球的首要步驟是對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行人工溶血處理，破碎細(xì)胞膜以釋放蛋白質(zhì)。本研究采用化學(xué)滲透法改變紅細(xì)胞膜的通透性，結(jié)合水溶脹的方式改變滲透壓，并利用溫度及機(jī)械震蕩加速破膜，提高細(xì)胞破碎效率。選用乳酸調(diào)節(jié)溶液pH進(jìn)一步深化破膜度，蛋白質(zhì)充分外溢，為后續(xù)的蛋白酶水解血球蛋白與脫色奠定了基礎(chǔ)。

圖5　pH對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響

本文采用5種蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶)對(duì)鴨血球蛋白進(jìn)行酶法水解，采用水解度對(duì)各蛋白酶水解進(jìn)程進(jìn)行評(píng)價(jià)。綜合考慮成本和水解效率，筆者選擇酸性蛋白酶作為酶解鴨血球蛋白的工具酶。酸性蛋白酶是由黑曲霉發(fā)酵精煉而成的內(nèi)切性蛋白酶，因其安全性高、活性強(qiáng)而廣泛應(yīng)用于食品與飼料領(lǐng)域。劉鵬宇等[26]采用6種商業(yè)酶水解蟹殼，酸性蛋白酶水解蟹殼蛋白的效率最高。馮琬幀等[27]用酸性蛋白酶對(duì)咸蛋清進(jìn)行酶解及工藝優(yōu)化，酶解48 h獲得的酶解液中肽(<3 ku)約占85.01%，其中分子質(zhì)量小于1 ku約占35.73%，而本研究酶解鴨血球蛋白7 h得到分子質(zhì)量3 ku以下的小分子肽約占81.89%，與文獻(xiàn)值相近，而分子質(zhì)量1 ku以下的肽約占62.82%，優(yōu)于文獻(xiàn)值。肽理論表明，小分子肽吸收具有速度快、耗能低、載體不易飽和等特點(diǎn)，比蛋白質(zhì)和氨基酸更容易被腸道吸收，而且肽在機(jī)體內(nèi)合成蛋白質(zhì)率比氨基酸高，由此可知血球短肽粉具有良好的消化吸收率。此外，在動(dòng)物飼糧中添加適宜的血球短肽可促進(jìn)其對(duì)氨基酸吸收，避免氨基酸間的吸收競爭。

圖6　蛋白質(zhì)濃度對(duì)血球短肽抗氧化活性的影響

本研究獲得的最佳血球蛋白水解度為(25.10±0.65)%，略高于中性蛋白酶酶解豬血紅蛋白的效率[28]，與木瓜蛋白酶和中性蛋白酶雙酶水解血紅蛋白的程度相接近[1]。此外，研究表明致使血液呈棕紅色的亞鐵血紅素在酸性、高水解度的產(chǎn)物中呈難溶狀態(tài)[16]，離心可去除富含亞鐵血紅素的沉淀進(jìn)而達(dá)到脫色的目的。這恰好與本文研究結(jié)果相符，鴨血球蛋白經(jīng)酸性蛋白酶水解后脫色效果明顯，其短肽粉趨近于乳白色，L*值與WI值約是血球蛋白粉的4倍。通常酶解過程伴有苦味肽生成，致使水解液呈苦味或澀味，而本研究得到的血球短肽經(jīng)品嘗沒有苦味，且其氨基酸疏水性值Q低于5 443 J/mol，說明酸性蛋白酶水解并未對(duì)產(chǎn)物風(fēng)味造成不良影響。

血球短肽的賴氨酸等必需氨基酸含量豐富，呈味氨基酸約占總氨基酸的31%，可作為一種很好的谷物蛋白互補(bǔ)物，也可適量補(bǔ)充蛋氨酸應(yīng)用于家禽、水產(chǎn)等飼料中。為深入了解血球酶解產(chǎn)物的應(yīng)用價(jià)值，本文對(duì)血球短肽的功能特性與抗氧化特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。與多數(shù)蛋白質(zhì)水解研究相似[29-31]，高水解強(qiáng)度下獲得的血球短肽具有較高的溶解性。這主要?dú)w因于酶解使得血球的二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，肽鏈長度縮短，與水結(jié)合形成強(qiáng)烈的氫鍵，從而增加其溶解性[24,29]。本試驗(yàn)中，pH對(duì)血球短肽的溶解性影響較大，且在等電點(diǎn)pH 6.0時(shí)溶解性最低，這主要是因?yàn)閜H影響肽段的靜電荷數(shù)量的變化，在弱酸環(huán)境(pH 6.0)中側(cè)鏈基團(tuán)的電荷釋放受限，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)或肽段在此沉淀性增強(qiáng)。血球短肽起泡性及其穩(wěn)定性在酸堿環(huán)境中波動(dòng)較大，乳化能力整體偏低，但易被吸附在油水界面形成的黏膜上而產(chǎn)生較好的乳化穩(wěn)定性，這或許與水解產(chǎn)生小分子肽有關(guān)[20,25]。血球短肽具有良好的乳化穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)樗嵝缘鞍酌杆庋虻鞍桩a(chǎn)生的小肽易被吸附在油水界面形成的黏膜上，或是酸性水解環(huán)境降低了小肽與油水膜間的電荷排斥作用，導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性能提高。

酶的種類影響酶解產(chǎn)物的抗氧化性。江勇等[32]分別使用5種商業(yè)蛋白酶水解鯊魚皮明膠，酸性蛋白酶水解產(chǎn)物具有最佳的抗氧化活性，本試驗(yàn)有類似的結(jié)果。鴨血球蛋白酶解產(chǎn)物具有自由基清除能力，隨濃度增加而清除自由基能力愈強(qiáng)。血球短肽還具有較高的還原能力，這主要?dú)w功于酸性蛋白酶水解使血球蛋白斷裂產(chǎn)生許多小分子肽段或氨基酸殘基成分(<3 ku約占82%)。由此可見，血球短肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為自由基穩(wěn)定劑和氫供體抑制脂質(zhì)氧化及預(yù)防食物腐敗變性。此外，血球短肽中含有少量的糖類和脂質(zhì)，經(jīng)噴霧干燥發(fā)生美拉德反應(yīng)抑制油脂類自動(dòng)氧化，有助于延長貯藏時(shí)間，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性。由此可見，血球短肽可以作為一種功能性原料應(yīng)用于食品或者飼料中。

4　結(jié)　論

① 采用水解度和水解物產(chǎn)量雙指標(biāo)衡量正交試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化確定了酸性蛋白酶水解鴨血球蛋白制備短肽的工藝條件為：酶用量6 000 U/g，溫度50 ℃，pH 3.5，水解時(shí)間7 h。在此條件下，蛋白水解度為(25.10±0.65)%，水解物產(chǎn)量為(60.09±1.77)%。

② 與血球蛋白粉相比，鴨血球短肽粉呈乳白色且無異味，L*值與WI值較高，且其小分子肽含量高，3 ku以下的占81.89%，1 ku以下的占62.82%，有利于動(dòng)物的消化吸收。

③ 血球短肽氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量豐富，約占總氨基酸的53.31%，異亮氨酸、蛋氨酸等血球限制性氨基酸含量均有不同幅度的增加，且賴氨酸含量高，可作為一種很好的谷物蛋白質(zhì)互補(bǔ)物。

④ 經(jīng)酸性蛋白酶改性的鴨血球蛋白具有良好的溶解性(>60%)、乳化穩(wěn)定性及清除自由基、還原力等抗氧化活性，功能特性良好，可作為功能性原料應(yīng)用于飼料與食品行業(yè)中。

[1]于美娟,馬美湖,單楊,等.采用兩酶復(fù)合水解豬血紅蛋白(Hb)制備水解蛋白的研究[J].食品科學(xué),2007,28(1):196-200.

[2]OFORI J A,HSIEH Y H P.Issues related to the use of blood in food and animal feed[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2014,54(4):687-697.

[3]YU Y K,HU J E,MIYAGUCHI Y,et al.Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from porcine hemoglobin[J].Peptides,2006,27(11):2950-2956.

[4]DENG H L,ZHENG J,ZHANG F S,et al.Isolation of angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitor from pepsin hydrolysate of porcine hemoglobin[J].European Food Research and Technology,2014,239(6):933-940.

[5]NYBERG F,SANDERSON K,GLMSTA E L.The hemorphins:a new class of opioid peptides derived from the blood protein hemoglobin[J].Biopolymers,1997,43(2):147-156.

[6]ZHAO Q Y,GARREAU I,SANNIER F,et al.Opioid peptides derived from hemoglobin:hemorphins[J].Biopolymers,1997,43(2):75-98.

[7]ZHAO Q Y,MOLINA P,PIOT J M.Peptic peptide mapping by HPLC,on line with photodiode array detection,of a hemoglobin hydrolysate produced at pilot-plant scale from an ultrafiltration process[J].Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies,1997,20(11):1717-1739.

[8]TAKAGI H,SHIOMI H,FUKUI K,et al.Isolation of a novel analgesic pentapeptide,neo-kyotorphin,from bovine brain[J].Life Sciences,1982,31(16/17):1733-1736.

[9]DAOUD R,DUBOIS V,BORS-DODITA L,et al.New antibacterial peptide derived from bovine hemoglobin[J].Peptides,2005,26(5):713-719.

[10]NEDJAR-ARROUME N,DUBOIS-DELVAL V,ADJE E Y,et al.Bovine hemoglobin:an attractive source of antibacterial peptides[J].Peptides,2008,29(6):969-977.

[11]CHANG C Y,WU K C,CHIANG S H.Antioxidant properties and protein compositions of porcine haemoglobin hydrolysates[J].Food Chemistry,2007,100(4):1537-1543.

[12]SUN Q,LUO Y K,SHEN H X,et al.Purification and characterisation of a novel antioxidant peptide from porcine haemoglobin hydrolysate[J].International Journal of Food Science & Technology,2012,47(1):148-154.

[13]鄧佳,劉學(xué)文,鄧冕.豬血血紅蛋白酶解的優(yōu)化研究[J].食品科技,2007,32(11):210-213.

[14]GUO S G,ZHAO M M,CUI C,et al.Optimized nitrogen recovery and non-bitter hydrolysates from porcine hemoglobin[J].Food Science and Technology Research,2008,14(1):39-48.

[15]SUN Q,SHEN H X,LUO Y K.Antioxidant activity of hydrolysates and peptide fractions derived from porcine hemoglobin[J].Journal of Food Science and Technology,2011,48(1):53-60.

[16]IN M J,KIM D C,CHAE H J,et al.Effects of degree of hydrolysis and pH on the solubility of heme-iron enriched peptide in hemoglobin hydrolysate[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2003,67(2):365-367.

[17]NIELSEN P M,PETERSEN D,DAMBMANN C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[J].Journal of Food Science,2001,66(5):642-646.

[18]LOW A,LAY M,VERBEEK J,et al.Decoloring hemoglobin as a feedstock for second-generation bioplastics[J].Preparative Biochemistry and Biotechnology,2012,42(1):29-43.

[19]BHASKAR N,MAHENDRAKAR N S.Protein hydrolysate from visceral waste proteins of Catla (Catlacatla):optimization of hydrolysis conditions for a commercial neutral protease[J].Bioresource Technology,2008,99(10):4105-4111.

[20]NEY K H.Prediction of bitterness of peptides from their amino acid composition[J].Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung,1971,147(2):64-68.

[21]LIU Q,KONG B H,XIONG Y L,et al.Antioxidant activity and functional properties of porcine plasma protein hydrolysate as influenced by the degree of hydrolysis[J].Food Chemistry,2010,118(2):403-410.

[22]KOU X H,GAO J,XUE Z H,et al.Purification and identification of antioxidant peptides from chickpea (CicerarietinumL.) albumin hydrolysates[J].LWT-Food Science and Technology,2013,50(2):591-598.

[23]LI Y H,JIANG B,ZHANG T,et al.Antioxidant and free radical-scavenging activities of chickpea protein hydrolysate (CPH)[J].Food Chemistry,2008,106(2):444-450.

[24]POPINEAU Y,MASSON P,THEBAUDIN J Y.Enzymatic processing of wheat proteins[M]//GODON B.Bioconversion of Cereal Products.New York:VCH Publishers,1993:129-131.

[25]TURGEON S L,GAUTHIER S F,PAQUIN P.Interfacial and emulsifying properties of whey peptide fractions obtained with a two-step ultrafiltration process[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1991,39(4):673-676.

[26]劉鵬宇,胡建恩,盧航,等.酶法水解蟹殼蛋白的工藝研究[J].食品科技,2014,39(2):220-224.

[27]馮琬幀,崔春,任嬌艷,等.咸蛋清蛋白深度酶解工藝優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(2):146-149.

[28]胡剛,王春維,周海,等.酶解豬血紅蛋白工藝條件的研究[J].飼料工業(yè),2009,30(23):18-22.

[29]孔祥珍,周惠明,錢海峰.小麥面筋蛋白酶解物的制備及其功能性質(zhì)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(3):593-598.

[30]DONG S Y,ZENG M Y,WANG D F,et al.Antioxidant and biochemical properties of protein hydrolysates prepared from Silver carp (Hypophthalmichthysmolitrix)[J].Food Chemistry,2008,107(4):1485-1493.

[31]KONG B H,XIONG Y L.Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(16):6059-6068.

[32]江勇,汪少蕓,饒平凡.鯊魚皮明膠水解肽的制備、分離純化與抗氧化活性研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2012,12(3):28-33.

(責(zé)任編輯武海龍)

, professor, E-mail: feedbiotech@yahoo.com

Preparation and Characterization of Enzymatic Hydrolysis of Duck Blood Corpuscle Short Peptide

ZHENG Zhaojun1YU Zhanqiao2WEI Xubiao1ZHANG Rijun1*

(1. College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. State Key Laboratory of Direct-Fed Microbial Engineering, Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd.,Beijing 100192, China)

The aims of this study were to screen the commercial protease with high hydrolysis efficiency and good decolorization effect, and to establish process technology of blood corpuscle short peptide, compared the nutritional characteristics before and after enzymatic hydrolysis, to study its nutritional value, functional properties and antioxidant activityinvivo. The functional product of blood corpuscle short peptide was produced so as to offer theoretic basis and technical reference for the efficient conversion and utilization of poultry blood. Taking degree of hydrolysis (DH), decoloration and hydrolysate yield as criterion, the effects of main parameters (such as types of protease, enzyme dosage, temperature, pH and hydrolysis time) and the optimal hydrolysis conditions were established based on the method of single-factor and orthogonal experiments. The blood corpuscle short peptide was used to study its nutritional, functional properties and antioxidant activity. We selected the acidic protease as the best enzyme to hydrolyze protein in our experiments. The suitable conditions of enzymatic hydrolysis, i.e. enzyme dosage 6 000 U/g, hydrolysis temperature 50 ℃, pH 3.5, hydrolysis time 7.0 h, and the degree of hydrolysis was (25.10±0.65)%, hydrolysate yield was (60.09±1.77)% under the optimal conditions. The molecular weight distribution of the hydrolysate as determined by high performance liquid chromatography (HPLC) suggested that significant degradation of blood corpuscle proteins produced the hydrolysate mostly consisting of short peptides below 3 ku with molecules less than 1 ku accounting for the majority (62.82%) of the total peptides. The white blood corpuscle short peptide powder containing all the common amino acids was rich in essential amino acids (53.31%) and had excellent solubility (>60%) and emulsifying stability. With the increasing concentration of blood corpuscle protein, its free radical scavenging activity [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl (DPPH·) and superoxide anion] and reducing power increased. Therefore, acid protease serves best for the hydrolysis of duck blood corpuscle protein, and its peptide powder has good features with high protein, rich essential amino acids and strong antioxidant activity. The blood corpuscle short peptide can be utilized as functional material for the food and feed industry.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2521-2533]

blood corpuscle short peptide; acid protease; functional property; antioxidant activity

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.024

2016-02-21

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2011BAD26B0403)；農(nóng)業(yè)部科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2011GB2A000009)；國家自然科學(xué)基金(31272476)

鄭召君(1988—)，女，山東臨沂人，博士研究生，從事家禽營養(yǎng)研究。E-mail: zhaojun064@163.com

張日俊，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: feedbiotech@yahoo.com

S834；S816

A

1006-267X(2016)08-2521-13