大豆異黃酮對肥胖大鼠腸道瘦素介導(dǎo)Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

李立科　羅啟慧,2　唐秀瑩　黃　超　陳曉林　劉文濤,2　陳正禮,2*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，實驗動物疾病模型研究室，成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，實驗動物工程技術(shù)中心，雅安625014)

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大豆異黃酮對肥胖大鼠腸道瘦素介導(dǎo)Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

李立科1羅啟慧1,2唐秀瑩1黃超1陳曉林1劉文濤1,2陳正禮1,2*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，實驗動物疾病模型研究室，成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，實驗動物工程技術(shù)中心，雅安625014)

本試驗旨在研究大豆異黃酮(SIF)對肥胖大鼠腸道瘦素介導(dǎo)Janus激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用，探討SIF對肥胖大鼠的干預(yù)機制。選取80只5周齡SD雄性大鼠，適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機分為基礎(chǔ)飼糧組(12只)和高脂飼糧組(68只)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧和高脂飼糧，飼喂8周后高脂飼糧組大鼠成功建立食源型肥胖大鼠模型。將40只肥胖大鼠隨機分為SIF干預(yù)低、中、高劑量組和肥胖對照組，每組10只。低、中、高劑量組大鼠分別灌胃50、150、450 mg/kg BW的SIF提取物，基礎(chǔ)飼糧組和肥胖對照組灌胃不含SIF提取物的溶媒劑。SIF連續(xù)干預(yù)肥胖大鼠5周，監(jiān)測大鼠體重，并采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)染色法研究大鼠腸道中長型瘦素受體(OB-Rb)、Janus激酶2(JAK2)、磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)、細(xì)胞因子信號3抑制因子(SOCS3)和神經(jīng)肽Y(NPY)的分布和表達(dá)。結(jié)果顯示：試驗各時期基礎(chǔ)飼糧組大鼠體重均極顯著低于肥胖對照組(P<0.01)。SIF干預(yù)5周后，與肥胖對照組相比，各SIF干預(yù)組大鼠體重均下降，并表現(xiàn)出劑量依賴性，其中中、高劑量組極顯著低于肥胖對照組(P<0.01)。各組大鼠OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3和NPY在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸和直腸均有表達(dá)；同基礎(chǔ)飼糧組相比，肥胖對照組大鼠上述5種因子在各腸段的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；SIF干預(yù)組中OB-Rb、JAK2、p-STAT3和NPY的表達(dá)量在各腸段均較肥胖對照組增多，總體呈現(xiàn)劑量依賴性。由此得出，SIF可通過增加腸道中OB-Rb的表達(dá)，激活JAK，加速STAT的磷酸化，改善能量代謝，減弱肥胖大鼠瘦素抵抗?fàn)顟B(tài)，來起到減重作用。

大豆異黃酮；免疫組織化學(xué)SABC染色法；OB-Rb；JAK2；p-STAT3；SOCS3；NPY；肥胖大鼠

肥胖癥是遺傳與環(huán)境因素共同作用所致的營養(yǎng)代謝障礙性疾病，肥胖者患Ⅱ型糖尿病、血管粥樣硬化、高血壓、脂肪肝等風(fēng)險增加[1]。然而，肥胖及相關(guān)疾病在亞洲國家發(fā)生率較低，這可能和亞洲人飲食中含有較多的大豆以及大豆相關(guān)食物有關(guān)[2]。研究表明，亞洲人每日異黃酮的攝入量為25～40 mg，遠(yuǎn)大于美國人日攝入量[3-4]。大豆異黃酮(soy isoflavone,SIF)是一種植物性雌激素，具有與雌激素相似的分子結(jié)構(gòu)和分子量，能與雌激素受體結(jié)合，具弱雌激素樣作用。在多個信號通路的作用下，可以減少前脂肪細(xì)胞，改善血脂和血糖代謝[5-7]，達(dá)到減肥降脂的功效[8]。相關(guān)資料證實SIF能顯著改善機體瘦素(leptin,Lep)水平并調(diào)控機體能量代謝[9-10]。Lep是一種由脂肪細(xì)胞分泌并能感知和調(diào)節(jié)機體自身能量的功能性多肽[11]，主要生理功能是調(diào)節(jié)攝食和能量輸出。Lep與長型瘦素受體(obese receptor b,OB-Rb)結(jié)合后，能夠磷酸化激活內(nèi)源性酪氨酸激酶Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)分子，活化的JAK2能使受體特定部位的酪氨酸殘基(Tyr985和Tyr1138)磷酸化，其中p-Tyr1138是磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)的錨定位點，p-STAT3分子被磷酸化后，形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)特異的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成[12-13]，影響膜電位和動作電位發(fā)放頻率，改變神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)的釋放，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)肥胖的作用。而在哺乳動物細(xì)胞系中，細(xì)胞因子信號3抑制因子(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)過量表達(dá)時，通過與JAK2分子結(jié)合，抑制JAK2所誘導(dǎo)的自身磷酸化和受體磷酸化，能夠阻斷Lep作用。在外周系統(tǒng)中，腸道無疑是Lep作用的重要部位。因此，為了研究SIF調(diào)控肥胖大鼠腸道中OB-Rb及Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(phosphorylated signal transducer and activator of transcription，STAT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子的變化，探討SIF對肥胖的干預(yù)機制，本試驗利用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)染色法，檢測在不同劑量SIF干預(yù)下大鼠腸道中OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3和NPY分布和表達(dá)的變化，以期通過SIF調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減弱Lep抵抗，改善動物體重。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物

試驗動物為80只5周齡SD雄性大鼠，體重為(140±10) g，購自于四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所[使用許可證：SCXK(川)2013-15]。

1.1.2試驗物品及試劑

試驗大鼠專用基礎(chǔ)飼糧、高脂飼糧、墊料均購自四川普萊美生物科技有限公司，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1；SIF提取物購自西安天豐生物科技有限公司，產(chǎn)品批號NF-20140806，高效液相色譜法檢測SIF純度為80%；兔抗鼠OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3、NPY抗體試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；即用型SABC-AP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3試驗用具及儀器設(shè)備

Leica冷凍切片機(德國徠卡有限公司)、Nikon50i-BF熒光生物數(shù)碼顯微鏡(日本尼康公司)、江蘇捷達(dá)801形態(tài)分析軟件(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)、超凈工作臺等。

1.2試驗方法

1.2.1動物處理

將80只大鼠隨機分籠，在晝夜交替的自然光下飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，試驗期間室內(nèi)溫度保持在(20±2) ℃，濕度保持在50%～60%。動物適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機抓取大鼠分為基礎(chǔ)飼糧組(12只)和高脂飼糧組(68只)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧和高脂飼糧。飼喂8周后，將高脂飼糧組體重大于基礎(chǔ)飼糧組大鼠平均體重加1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差的大鼠選出(共40只)，并隨機分為4組，即SIF干預(yù)低、中、高劑量組和肥胖對照組，每組10只。低、中、高劑量組大鼠分別灌胃低、中、高劑量(50、150、450 mg/kg BW)的SIF提取物，SIF提取物用0.5%羧甲基釬維素鈉溶液溶解，基礎(chǔ)飼糧組和肥胖對照組大鼠灌胃不含SIF提取物的0.5%羧甲基釬維素鈉溶液，各組大鼠均按照2 mL/kg BW的灌注量進(jìn)行灌胃。SIF干預(yù)5周，記錄每周各組大鼠的體重變化。試驗中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2.2取材和切片

13周末將大鼠用4%戊巴比妥腹腔注射麻醉后全部處死，迅速分離出各腸段，于4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定。將固定的組織流水沖洗過夜后，依次梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片(厚4～5 μm)、烘片后備用。

1.2.3樣品染色與分析

每只大鼠選取常規(guī)石蠟切片5張，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。

表1　試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼糧提供Mineral premix provided the following per kg of diets:NaCl 4 g，CaHPO313 g，K2HPO410 g，MgSO45 g，F(xiàn)eSO41 g，ZnSO40.2 g。

2)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供Vitamin premix provided the following per kg of diets:硫胺素 thiamine 100 mg，核黃素 riboflavin 100 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 500 mg，煙酸 nicotinic acid 500 mg，吡哆醇 pyridoxine 100 mg，鈷胺素 cobalamine 100 mg，生物素 biotin 50 mg，膽堿 choline 4 000 mg，肌醇 inositol 2 000 mg，VC 1 000 mg，VA 10 000 IU，VD34 000 IU，VE 100 mg，VK 20 mg。

3)代謝能為實測值，其余為計算值。ME was a measured value, while the others were calculated values.

取每只大鼠腸道組織常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)SABC染色后檢測OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3、NPY的分布與表達(dá)。免疫組織化學(xué)SABC染色步驟：常規(guī)石蠟切片脫蠟后，將切片侵入濃度為3%新鮮配制的過氧化氫(H2O2)中避光反應(yīng)30 min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，95 ℃抗原修復(fù)15 min，10%山羊血清37 ℃封閉30 min，PBS洗3次，PBS稀釋一抗4 ℃過夜(稀釋比例均為1∶200)，陰性對照不加一抗，PBS洗3次，PBS稀釋二抗1 h(稀釋比例均為1∶100)，PBS洗3次后滴加SABC 37 ℃孵育20 min，PBS洗4次后DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，雙蒸水終止顯色后雙蒸水洗4次，最后脫水、透明、封片、鏡檢。試驗均設(shè)陰性對照。

1.2.4圖像采集以及數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1肥胖大鼠模型的建立

從第4周開始，高脂飼糧組大鼠的體重開始大于基礎(chǔ)飼糧組大鼠。到第8周末，高脂飼糧組大鼠的平均體重大于基礎(chǔ)飼糧組大鼠的平均體重加1.4標(biāo)準(zhǔn)差，達(dá)到肥胖大鼠判定標(biāo)準(zhǔn)[14]，表明高脂飼糧誘導(dǎo)的大鼠肥胖模型建立成功。

2.2SIF對膳食誘導(dǎo)肥胖大鼠體重的影響

從表2可知，在SIF干預(yù)試驗初期(第9周)，SIF干預(yù)組(低、中、高劑量組)大鼠的體重與肥胖對照組無顯著差異(P>0.05)。試驗各時期基礎(chǔ)飼糧組大鼠體重均極顯著低于肥胖對照組(P<0.01)。隨著時間的推移，各SIF干預(yù)組大鼠體重的增長幅度明顯低于肥胖對照組。SIF干預(yù)5周后(第13周)，與肥胖對照組相比，各SIF干預(yù)組大鼠體重均下降，并表現(xiàn)出劑量依賴性，其中中、高劑量組極顯著低于肥胖對照組(P<0.01)。

表2　大豆異黃酮干預(yù)各時期大鼠體重

*、**分別表示與肥胖對照組相比具顯著(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)。

* and ** mean significant difference (P<0.05) and extremely significant difference compared with obesity control group (P<0.01), respectively.

2.3HE染色結(jié)果

HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)各組大鼠各腸道組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核染色鮮艷，組織切片完整均勻，各組均沒有明顯異常病理變化(圖1)。

圖1　HE染色結(jié)果

2.4免疫組織化學(xué)SABC染色結(jié)果

2.4.1OB-Rb在腸道中的表達(dá)

光學(xué)顯微鏡下對切片進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，OB-Rb表達(dá)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)黃褐色，OB-Rb陽性物質(zhì)多表達(dá)于胞質(zhì)中(圖2，因各組大鼠表現(xiàn)一致，本文僅展示了中劑量組)，腸道從外至內(nèi)的各層組織中以黏膜層中的固有層表達(dá)最為豐富，尤以十二指腸較明顯。

如圖3-A所示，基礎(chǔ)飼糧組大鼠OB-Rb在各腸段中的表達(dá)量均顯著高于肥胖對照組(P<0.05)。OB-Rb的表達(dá)量在十二指腸和直腸中表現(xiàn)為隨SIF劑量的增加而顯著增加(P<0.05)；在空腸和回腸中表現(xiàn)為高劑量組顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；而結(jié)腸中則表現(xiàn)為高、中劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)。

圖2　OB-Rb在十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)、結(jié)腸(D)、直腸(E)中的分布

Ⅰ:肥胖對照組；Ⅱ：低劑量組；Ⅲ：中劑量組；Ⅳ：高劑量組；Ⅴ：基礎(chǔ)飼糧組。同部位數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Ⅰ: obesity control group; Ⅱ: low dosage group; Ⅲ: middle dosage group; Ⅳ: high dosage group; Ⅴ: basal diet group. In the same sect1, data columns with the same small letters mean no significant difference (P>0.05)，and with different small letters mean significant difference (P<0.05).

圖3大豆異黃酮對大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸中OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3、NPY表達(dá)的影響

Fig.3Effects of SIF on OB-Rb, JAK2, p-STAT3, SOCS3 and NPY expression in duodenum, jejunum, ileum, colon and rectum of rats

2.4.2JAK2在腸道中的表達(dá)

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，整個腸道中均有JAK2的表達(dá)(圖4，因各組大鼠表現(xiàn)一致，本文僅展示了中劑量組)，JAK2陽性反應(yīng)呈棕褐色或棕黃色。JAK2在腸道各段陽性表達(dá)于腸腺、腸絨毛上，黏膜下層也有表達(dá)。

如圖3-B所示，基礎(chǔ)飼糧組大鼠JAK2在各腸段中的表達(dá)量均顯著高于肥胖對照組(P<0.05)。JAK2在的表達(dá)量在十二指腸中表現(xiàn)為低、中劑量組顯著高于高劑量組(P<0.05)；在空腸中表現(xiàn)為高劑量組顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；在回腸、結(jié)腸和直腸中則表現(xiàn)為隨SIF劑量的增加而顯著增加(P<0.05)。

圖4　JAK2在十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)、結(jié)腸(D)、直腸(E)中的分布

2.4.3p-STAT3在腸道中的表達(dá)

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，p-STAT3陽性反應(yīng)的細(xì)胞體呈棕褐色或棕黃色(圖5，因各組大鼠表現(xiàn)一致，本文僅展示了中劑量組)。對整個腸道進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)腸道各段均有p-STAT3的表達(dá)，且腸道各段陽性產(chǎn)物表達(dá)多分布于腸腺、腸絨毛、黏膜下層上。

如圖3-C所示，除空腸外，基礎(chǔ)飼糧組大鼠p-STAT3在各腸段中的表達(dá)量均顯著高于肥胖對照組(P<0.05)。p-STAT3的表達(dá)量在十二指腸中表現(xiàn)為低劑量組顯著高于中、高劑量組(P<0.05)；在空腸中表現(xiàn)為中劑量組顯著高于低、高劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著高于高劑量組(P<0.05)；在回腸中表現(xiàn)為中、高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)；在結(jié)腸中表現(xiàn)為高劑量組顯著高于低、中劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著高于中劑量組(P<0.05)；而在直腸中則表現(xiàn)為隨SIF劑量的增加而顯著增加(P<0.05)。

圖5　p-STAT3在十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)、結(jié)腸(D)、直腸(E)中的分布

2.4.4SOCS3在腸道中的表達(dá)

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，SOCS3陽性染色呈棕褐色或棕黃色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖6，因各組大鼠表現(xiàn)一致，本文僅展示了中劑量組)。在整個腸道中均有SOCS3陽性表達(dá)產(chǎn)物，陽性產(chǎn)物集中表達(dá)在黏膜層中的固有層。

如圖3-D所示，基礎(chǔ)飼糧組大鼠SOCS3在各腸段中的表達(dá)量均顯著高于肥胖對照組(P<0.05)。SOCS3的表達(dá)量在十二指腸中表現(xiàn)為高、中劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)；在空腸中表現(xiàn)為低、中劑量組顯著高于高劑量組(P<0.05)；在回腸中表現(xiàn)為低劑量組顯著高于中、高劑量組(P<0.05)；在結(jié)腸中表現(xiàn)為低、中劑量組顯著高于高劑量組(P<0.05)；在直腸中表現(xiàn)為高劑量組顯著高于低、中劑量組(P<0.05)。

2.4.5NPY在腸道中的表達(dá)

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，NPY陽性反應(yīng)呈棕褐色或棕黃色(圖7，因各組大鼠表現(xiàn)一致，本文僅展示了中劑量組)。在各腸道的漿膜至黏膜下層以及十二直腸區(qū)域均有粗大的NPY陽性神經(jīng)纖維，而在回腸區(qū)域NPY陽性神經(jīng)纖維開始減少。NPY陽性神經(jīng)纖維分布密度與神經(jīng)叢的分布可能直接相關(guān)，存在小血管的地方幾乎都有NPY陽性神經(jīng)纖維的伴行。

如圖3-E所示，基礎(chǔ)飼糧組大鼠NPY在各腸段中的表達(dá)量均顯著高于肥胖對照組(P<0.05)。NPY的表達(dá)量在十二指腸和結(jié)腸中表現(xiàn)為高劑量組顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；在空腸、回腸和直腸中則表現(xiàn)為隨SIF劑量的增加而顯著增加(P<0.05)。

圖6　SOCS3在十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)、結(jié)腸(D)、直腸(E)中的分布

圖7　NPY在十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)、結(jié)腸(D)、直腸(E)中的分布

3　討　論

3.1SIF對膳食誘導(dǎo)肥胖大鼠體重的影響

近年來，肥胖及相關(guān)疾病的患病率迅速增加，尤以西方國家更為明顯，肥胖已成為危害公共健康的一個風(fēng)險因素，因此如何有效減輕或防止肥胖具有重要意義。本研究中SIF干預(yù)后可顯著降低肥胖大鼠的體重，這與Ali等[9]、?rgaard等[15]研究結(jié)果相一致，肥胖大鼠體重隨SIF劑量增加而降低，表明SIF具有減重作用并呈劑量依賴性。研究表明，SIF可顯著降低甘油三酯、總膽固醇以及低密度脂蛋白含量，同時提高高密度脂蛋白含量以及低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的比值[15-16]。因此，在畜牧業(yè)應(yīng)用中，可將SIF作為一種飼料添加劑，通過抑制脂肪細(xì)胞分化[17]，縮小脂肪細(xì)胞面積[18]，減少脂肪沉積[19]，降低Lep抵抗，從而改善動物肥胖狀態(tài)。

3.2SIF對肥胖大鼠腸道OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3和NPY表達(dá)的影響

El-Haschimi等[20]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)肥胖患者血清Lep水平顯著高于正常人群，稱作高Lep血癥，但高水平的血清Lep并未使患者體重減輕，提示發(fā)生Lep抵抗，并推斷這種抵抗是肥胖的根本原因。目前認(rèn)為Lep抵抗涉及中樞和外周抵抗2種機制[21-25]。數(shù)據(jù)顯示，在飲食誘導(dǎo)肥胖中，Lep抵抗主要發(fā)生在血腦屏障缺陷和受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷2個環(huán)節(jié)[26]。

本試驗結(jié)果表明，在SIF干預(yù)的肥胖大鼠腸道中，OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3以及NPY均有表達(dá)，這與Cammisotto等[26]的研究相一致。研究顯示SIF是一種相對較強的雌激素受體激動劑，具有潛在的減少前脂肪細(xì)胞的作用，其發(fā)揮肥胖逆轉(zhuǎn)作用與Lep有關(guān)[27]，因為脂肪組織是Lep的主要來源，Lep能夠穿過血腦屏障為大腦提供機體脂肪儲備信息，并進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)[28]，同時脂肪也會干擾Lep、OB-Rb以及NPY。作為Lep的主要功能受體，OB-Rb在中樞和外周系統(tǒng)均有分布，但主要分布在下丘腦[29]，其主要作用是控制飽腹感、能量消耗以及其他神經(jīng)內(nèi)分泌功能[30]。JAK/STAT是Lep生物學(xué)作用的主要信號通路[31]，在嚙齒類動物上，下丘腦STAT磷酸化和STAT轉(zhuǎn)錄結(jié)合的水平常被作為Lep的信號標(biāo)記。本研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飼糧誘導(dǎo)的肥胖對照組大鼠的各腸段中，OB-Rb、JAK2、p-STAT3以及NPY的表達(dá)量均顯著低于基礎(chǔ)飼糧組，這可能與肥胖大鼠脂肪的增加密切相關(guān)，由于Lep是由脂肪細(xì)胞分泌并感知和調(diào)節(jié)機體自身能量的功能性多肽，隨著體內(nèi)脂肪含量的增加，Lep分泌加速，從而激活JAK/STAT信號通路對脂肪進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。SIF干預(yù)肥胖大鼠后腸道OB-Rb表達(dá)增加，加快了JAK2的活化以及STAT的磷酸化，從而抑制腸道消化液分泌及物質(zhì)吸收，減弱Lep抵抗，由此產(chǎn)生抑食和減重效應(yīng)。SOCS3誘導(dǎo)Lep抵抗的作用已被廣泛研究，現(xiàn)已證實，SOCS3在腦中特異性的缺乏能在一定程度上抑制肥胖[32-34]。本試驗中SOCS3在各腸段表達(dá)不一致，不同劑量間差異不明顯，說明SOCS3作為Lep的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在腸道中抑制JAK/STAT的信號通路作用不顯著，從而在一定程度上減弱了Lep抵抗作用，緩解了肥胖癥狀。NPY作為一種食欲刺激神經(jīng)肽，在食物攝入和能量消耗調(diào)節(jié)中起著重要的作用，其過度表達(dá)會誘導(dǎo)大鼠體重增加[35]。在本試驗中，OB-Rb表達(dá)量的升高并沒有抑制NPY這種促食肽的表達(dá)，其反而呈現(xiàn)劑量依賴性的增加，但并沒有導(dǎo)致體重的增加。究其原因，雖然NPY表達(dá)增加，但作用效果可能不如OB-Rb介導(dǎo)JAK/STAT信號通路對腸道消化吸收的調(diào)節(jié)。然而Ob-Rb是否參與SIF的調(diào)節(jié)作用，OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3以及NPY在腸道是否存在相互作用，還需更細(xì)致和深入的試驗來探尋。

4　結(jié)　論

① SIF可增加腸道OB-Rb的表達(dá)，激發(fā)JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改善能量代謝，減弱肥胖大鼠Lep抵抗?fàn)顟B(tài)。

② SIF對膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠具有減重作用，并在50～450 mg/kg BW范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。

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(責(zé)任編輯菅景穎)

, professor, E-mail： chzhli75@163.com

Effects of Soybean Isoflavone on Signaling Transduction Path of Leptin-Dependent Janus Kinase/Signal Transduction and Activator of Transcription in Intestine of Obese Rats

LI Like1LUO Qihui1,2TANG Xiuying1HUANG Chao1CHEN Xiaolin1LIU Wentao1,2CHEN Zhengli1,2*

(1. Laboratory of Animal Disease Model, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130, China; 2. Engineering and Technology Center for Laboratory Animals,Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

This study was conducted to study the regulatory effect of signaling transduction path of leptin-dependent Janus kinase (JAK)/signal transduction and activator of transcription (STAT) in intestine of obese rats treated with soybean isoflavone (SIF), and to discuss the intervention mechanism of SIF on obese rats. Eighty SD male rats with the age of 5 weeks were randomly divided into basal diet group (12 rats) and high fat diet group (68 rats) after adapted to the environment for 1 week, and the rats in basal diet group and high fat diet group were fed with basal diet and high fat diet, respectively. After feeding 8 weeks, the food-induced obese rat models were successfully established in high fat diet group. Forty obese rats were selected to divide into 4 groups which were SIF interfering low, medium and high dose groups and obesity control group, and each group had 10 rats. The rats in low, medium and high dose groups were given 50, 150 and 450 mg/kg BW SIF, respectively, and the rats in basal diet group and obesity control group were given solvent agent through stomach for 5 weeks. During the experiment, the body weight of rats was measured, and the expression and distribution of obese receptor b (OB-Rb), Janus kinase 2 (JAK2), phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 (p-STAT3), suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) and neuropeptide Y (NPY) were detected by immunohistochemical staining of strept avidin-biotin complex (SABC) method. The results showed as follows: the body weight of basal diet group was extremely significantly lower than that of obesity control group at each period (P<0.01). After 5 weeks of SIF intervention, the body weight of SIF intervention groups was decreased compared with obesity control group and showed a dose-dependence relationship, and the middle and high dose groups were extremely significantly lower than obesity control group (P<0.01). OB-Rb, JAK2, p-STAT3, SOCS3 and NPY of rats of each group all existed in duodenum, jejunum, ileum, colon and rectum. Compared with basal diet group, the expression levels of OB-Rb, JAK2, p-STAT3, SOCS3 and NPY at different intestine segments of rats of obesity control group were significantly decreased (P<0.05). Compared with obesity control group, the expression levels of OB-Rb, JAK2, p-STAT3 and NPY at different intestine segments of rats of SIF intervention groups were obviously increased, and overall showed a dose-dependence relationship. The results suggest that SIF can increase the expression of intestinal OB-Rb, activate JAK, accelerate STAT phosphorylation, improve energy metabolism, attenuate leptin resistance, and then play a role on weight loss of obese rats.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2448-2457]

soy isoflavone; immunohistochemical staining of SABC method; OB-Rb; JAK2; p-STAT3; SOCS3; NPY; obese rat

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.016

2016-02-26

國家科技支撐計劃課題(2014BAI03B01)；國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(2013YQ49085906)；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊項目(2013TD0015)

李立科(1990—)，男，四川成都人，碩士研究生，從事實驗動物疾病模型研究。E-mail： 394580507@qq.com

陳正禮，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： chzhli75@163.com

S811.2

A

1006-267X(2016)08-2448-10