阿霉素誘導(dǎo)大鼠心力衰竭模型中血漿NGF表達(dá)的初步研究*

梁　政，王懷龍，李　曉，李　波，岑永藝，劉珍君，黃石安，陳建英，陳　燦，陳文江

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江 524001；2.中國海洋石油南海西部醫(yī)院，廣東湛江 524000)

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·論著·

阿霉素誘導(dǎo)大鼠心力衰竭模型中血漿NGF表達(dá)的初步研究*

梁政1，王懷龍1，李曉1，李波1，岑永藝2，劉珍君1，黃石安1，陳建英1，陳燦1，陳文江1

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江 524001；2.中國海洋石油南海西部醫(yī)院，廣東湛江 524000)

目的探討阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型中血漿神經(jīng)生長因子(NGF)的表達(dá)情況。方法25只Wistar大鼠隨機(jī)分為心力衰竭組(CHF組，n=15，阿霉素4 mg/kg，腹腔注射,6周)和正常對照組(NC組，n=10)，待造模成功后繼續(xù)觀察6周，在6周和12周測定心功能；每2周測定體質(zhì)量和通過尾靜脈采血測定大鼠血漿NGF表達(dá)。結(jié)果6周后，CHF組大鼠體質(zhì)量較NC組明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，LVEDV和LVESV明顯升高，LVEF明顯下降，NGF表達(dá)量也較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NGF表達(dá)量隨著病程時間延長而逐漸降低(P<0.05)。結(jié)論Wistar大鼠腹腔注射阿霉素可以成功誘導(dǎo)HF，而且NGF可能與HF密切相關(guān)。

心力衰竭；神經(jīng)生長因子；阿霉素；Wistar大鼠

心力衰竭(HF)是一組常見臨床綜合征，其患病率為0.9%(男性0.7%，女性1.0%)，而且住院患者 30 d病死率為5.4%，我國目前HF患者有大約450 萬[1]，由此可見其危害性。HF發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，目前研究主要認(rèn)為與心臟重構(gòu)有關(guān)[2]，而近年來研究顯示交感神經(jīng)重構(gòu)與HF發(fā)生密切相關(guān)，具體機(jī)制主要涉及交感神經(jīng)激活、神經(jīng)萌芽和一些神經(jīng)生長相關(guān)因子[3-5]。神經(jīng)生長因子(NGF)是心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)非常重要的生物活性因子之一，對維持人體正常神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)起重要作用，而且可維持交感神經(jīng)活性、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化等功能[5-8]。近年來有研究顯示NGF與HF關(guān)系密切[9-10]。因此，本研究擬采用Wistar大鼠腹腔注射阿霉素制備HF模型，從而探討NGF與HF的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1動物模型與標(biāo)本采集25只成年雄性清潔級Wistar大鼠，體質(zhì)量為(200±20)g，由廣東省實驗動物中心提供，隨機(jī)分為心力衰竭組(CHF組，n=15)和正常對照組(NC組，n=10)。CHF組給予阿霉素4 mg/kg，腹腔注射，每周1次，共6周，累積總量24 mg/kg，而NC組應(yīng)用生理鹽水以CHF組相同的方法、劑量和時間進(jìn)行注射。確定造模成功后，繼續(xù)喂養(yǎng)6周，以觀察自然病程和其他指標(biāo)變化情況。實驗期間每2周通過尾靜脈采血以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集兩組大鼠0.5 mL靜脈血和測定體質(zhì)量，同時觀察大鼠一般情況，并在6周和12周進(jìn)行超聲測定存活大鼠的心功能。

1.2方法

1.2.1HE染色于實驗周期結(jié)束時，留取大鼠心臟組織，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，HE試劑盒(C0105)由碧云天生物科技有限公司提供，詳細(xì)操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2心臟超聲測定常規(guī)麻醉各組大鼠，固定四肢并采用仰臥位，以彩色超聲診斷儀(SONOS 5500，Hewlett Packard)和HP小動物超聲探頭(15 MHz)在大鼠胸骨旁以二維超聲進(jìn)行心臟形態(tài)和功能檢測，測量指標(biāo)主要有左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDV)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，LVEF =(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100%。

1.2.3ELISA將所獲取的各組大鼠全血進(jìn)行離心(3 000 r/min，24 ℃，10 min)分離血漿，取各組大鼠的血漿，按照ELISA試劑盒說明書(ELISA試劑盒由深圳柏萬森生物有限公司提供)對血漿NGF進(jìn)行檢測，觀察其變化情況，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，最后用酶標(biāo)儀(EPOCH，美國)在 450 nm 波長下測定吸光度(OD 值)，并通過制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大鼠血漿中 NGF 的濃度。

2　結(jié)　果

2.1大鼠基本情況CHF組在實驗觀察期間，尤其是阿霉素腹腔注射4周以后，大鼠出現(xiàn)食欲下降、活動減少、體質(zhì)量減輕和死亡，體質(zhì)量變化情況見表1。CHF組在造模期間死亡4只，在隨后的觀察期間死亡5只，經(jīng)解剖，基本都可見心臟變大、肝臟腫大等現(xiàn)象；而NC組未見老鼠有明顯異常和死亡。

表1　兩組大鼠造模前后體質(zhì)量變化情況

注：與NC組比較，*P<0.05。

注：A、B為阿霉素造模組，C、D為正常對照組。

圖1大鼠HE染色情況

2.2HE染色結(jié)果對造模后大鼠進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，CHF組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂、間隙增寬(圖1A、B)，有的心肌細(xì)胞已經(jīng)壞死、溶解(圖1A箭頭所示)；而對照組心肌細(xì)胞排列基本正常(如圖1C、D)。該結(jié)果符合HF的病理表現(xiàn)。

2.3大鼠心功能測定情況CHF組15只Wistar大鼠經(jīng)過6周阿霉素腹腔注射造模后，存活11只，而NC組10只大鼠全部存活，進(jìn)行心功能測定發(fā)現(xiàn)：CHF組大鼠LVEDV和LVESV 都比NC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而CHF組LVEF(73.95%)則較NC組(92.52%)明顯降低(P<0.01)；在12周時，CHF組大鼠僅存活6只，LVEDV和LVESV 都較6周時未見明顯升高(P>0.05)，然而LVEF則較6周時明顯降低(P<0.01)，而CHF組與NC組比較，心功能明顯下降，LVEF僅為62.60%(P<0.01)，見表2。該結(jié)果結(jié)合上述HE染色表明阿霉素腹腔注射可以成功建立Wistar大鼠心力衰竭模型，而且心功能衰竭會隨著生存時間的延長而加重。

2.4NGF表達(dá)變化情況經(jīng)過尾靜脈采血，然后采用ELISA檢測血漿NGF發(fā)現(xiàn)：CHF組NGF表達(dá)量逐漸降低，在8周時升高，然后又逐漸下降，而NC組整個過程未見明顯升高或者下降；在4周以后，CHF組NGF表達(dá)量明顯較NC組降低(P<0.01)，詳見表3。

表2　兩組大鼠心功能情況

注：與NC組比較，*P<0.05；與6周比較，#P<0.05。

表3　兩組大鼠NGF表達(dá)情況

注：與NC組比較，*P<0.05；與6周和10周比較，#P<0.05。

3　討　論

HF已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，給人類和社會帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，其防治刻不容緩[1]。對于其防治，目前已經(jīng)有較好的臨床措施(如強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)管等)，但目前多局限于HF后的組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)(如β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等的治療)[3-4]?，F(xiàn)有研究表明HF后神經(jīng)重構(gòu)也是HF治療和預(yù)后的關(guān)鍵因素，目前主要發(fā)現(xiàn)NGF、酪氨酸羥化酶、生長相關(guān)蛋白43等可能與神經(jīng)重構(gòu)有關(guān)[6-7]。NGF目前在臨床已經(jīng)有人或鼠重組型運用于滋養(yǎng)神經(jīng)、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞等，主要用于外傷或者卒中后康復(fù)治療[11]。國內(nèi)已經(jīng)有研究者在臨床發(fā)現(xiàn)HF患者血漿NGF表達(dá)會下降，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、α1受體阻斷劑和β受體阻滯劑等可能會改善NGF的表達(dá)[9-10,12]，不過都還是一些小樣本觀察性研究，還需要更深層次研究。另有研究者發(fā)現(xiàn)有氧運動可以改善HF后NGF的表達(dá)[13]。也有研究者通過建立急性心肌梗死模型探討NGF與交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)心肌梗死后NGF表達(dá)也下調(diào)[14-18]。然而關(guān)于HF與NGF具體關(guān)系的研究較少。

本研究通過腹腔注射阿霉素成功建立HF模型，發(fā)現(xiàn)阿霉素腹腔注射4周以后，CHF組大鼠相比于NC組出現(xiàn)食欲下降、活動減少、體質(zhì)量減輕和死亡等情況；并通過HE染色發(fā)現(xiàn)CHF組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂、間隙增寬，并出現(xiàn)心肌細(xì)胞壞死、溶解等情況；通過超聲測定基本心功能發(fā)現(xiàn)CHF組大鼠LVEDV和LVESV 都比NC組明顯升高，而CHF組LVEF則較NC組明顯降低，同時發(fā)現(xiàn)CHF組大鼠心功能衰竭會隨著生存時間的延長而加重；通過對大鼠血漿NGF檢測發(fā)現(xiàn)在HF后大鼠NGF的表達(dá)明顯下降，而且隨著病程延長和病情加重而持續(xù)下降，而在8周時呈現(xiàn)上升趨勢，可能與機(jī)體代償?shù)扔嘘P(guān)，當(dāng)失代償后NGF繼續(xù)下降，說明NGF與HF密切有關(guān)，而其具體機(jī)制可能與交感神經(jīng)重構(gòu)等有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。本研究只是從動物層面發(fā)現(xiàn)HF后NGF表達(dá)下降，未進(jìn)行干預(yù)和治療，有一定局限性，還有待后續(xù)研究確定具體機(jī)制和關(guān)系。

綜上所述，本研究通過采用Wistar大鼠腹腔注射阿霉素可以成功誘導(dǎo)慢性HF動物模型，NGF在阿霉素誘導(dǎo)的HF模型中呈現(xiàn)低表達(dá)，可能與阿霉素誘導(dǎo)的HF發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

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Preliminary study on plasma NGF expression in adriamycin induced rat heart failure model*

LIANG Zheng1,WANG Huailong1,LI Xiao1,LI Bo,1CEN Yongyi2,LIU Zhenjun1,HUANG Shian1,CHENJianying1,CHENCan1,CHENWenjiang1

(1.DepartmentofCardiovascularInternalMedicine,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang,Guangdong524001,China;2.NanhaiWestHospitalofChinaOffshoreOil,Zhanjiang,Guangdong524000,China)

ObjectiveTo investigate plasma NGF expression in adriamycin induced rat heart failure(HF) model.MethodsTwenty-five Wistar rats were randomly divided into the CHF group(n=15,adriamycin 4 mg/kg,by intraperitoneal injection,for 6 weeks) and normal control group (NC group,n=10),after successful model construction,the 6-week observation was continuously conducted.The body mass and plasma NGF expression were detected once per 2 weeks.ResultsAfter 6 weeks later,the body mass in the CHF group was significantly reduced,the difference was statistically significant (P<0.05),LVEDV and LVESV were significantly increased,while LVEF was declined obviously (P<0.05),the NGF expression amount was significantly decreased compared with the control group,the differences were statistically significant (P<0.05);the NGF expression amount was gradually reduced with the time extension of disease course(P<0.05).ConclusionIntraperitoneal injection of adriamycin can successfully induce heart failure model in Wistar rats,moreover NGF may be closely associated with HF.

heart failure;nerve growth factor;adriamycin;Wistar rats

2016-01-29修回日期：2016-05-17)

廣東省湛江市科技計劃資助項目(2014B01082)。

梁政，男，副主任醫(yī)師，主要研究心力衰竭發(fā)病機(jī)制及其防治。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.014

A

1673-4130(2016)15-2086-03