食品中蘇丹紅檢測方法的比較和優(yōu)化

江晨舟 孫潔敏 張馳中 邵明華 / 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司

食品中蘇丹紅檢測方法的比較和優(yōu)化

江晨舟 孫潔敏 張馳中 邵明華 / 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司

采用GB 19681-2005規(guī)定的高效液相色譜法（HPLC）對食品中的蘇丹紅含量進(jìn)行檢測，并對該方法進(jìn)行前處理?xiàng)l件和色譜條件的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化的方法專用SPE小柱有較好的回收率，SPE過程簡單直觀，易于操作，色譜分析條件簡單快速，流動(dòng)相易于配制，回收率穩(wěn)定在95.0%～98.0%，優(yōu)于高效液相色譜法的回收率80%～90%，因此更適合于食品中蘇丹紅含量的檢測。

HPLC；蘇丹紅；食品；光學(xué)誘導(dǎo)異構(gòu)

0　引言

蘇丹紅是一類人工合成的親脂性、偶氮類染料，主要包括蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 四種類型，見圖1。

蘇丹紅染料是分子結(jié)構(gòu)中含有偶氮基（一N=N一）發(fā)色團(tuán)的一類人工合成的脂溶性偶氮染料，主要用于紡織品、橡膠、塑料、油漆等的著色劑［1］。蘇丹紅具有潛在的致癌性、遺傳毒性及致敏性，這與其胺類、萘酚類代謝產(chǎn)物有關(guān)［2］。研究表明，蘇丹紅染料分子可以通過多種途徑接觸到人體，并透過生物膜通過血液循環(huán)分散到全身各組織細(xì)胞，與生物體內(nèi)的大分子（蛋白質(zhì)、DNA等）相結(jié)合，生成致敏、致癌物質(zhì)。因此，一些國家和機(jī)構(gòu)相繼頒布了法律法規(guī)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)令禁止蘇丹紅染料作為食品添加劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。世界癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將其列為第三類可能致癌物質(zhì)［3-4］。

目前，檢測這四種蘇丹紅染料的方法主要有分光光度法［5］、薄層色譜法［6］、電化學(xué)法［7］、酶聯(lián)免疫法［8］、液相色譜法［9］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［10-14］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［15-20］和毛細(xì)管電泳法［21］等。這些方法的靈敏度、選擇性和分析通量存在差異。氣相色譜-質(zhì)譜法儀器設(shè)備較昂貴，并且對操作人員的技術(shù)水平要求較高，難以普及。高效液相色譜儀器價(jià)格相對便宜，操作簡單，一般檢測機(jī)構(gòu)都已普及。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19681-2005［22］規(guī)定了食品中蘇丹紅染料的高效液相色譜測定方法（以下簡稱國標(biāo)法），但在實(shí)驗(yàn)過程中，檢測到蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ分別有兩個(gè)色譜峰，經(jīng)分析是蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的光學(xué)誘導(dǎo)異構(gòu)體，而在國標(biāo)法中并未提及。本實(shí)驗(yàn)在重復(fù)國標(biāo)法的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行優(yōu)化，采用蘇丹紅專用固相萃取柱凈化樣品，利用物理避光法準(zhǔn)確測定不同基質(zhì)中的蘇丹紅。本實(shí)驗(yàn)方法簡稱安譜法。

圖1　蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ結(jié)構(gòu)

1　材料與方法

1.1試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

國標(biāo)法耗材：乙腈、水、正己烷、丙酮、乙醚、甲酸、無水硫酸鈉、氧化鋁層析柱、5%丙酮-正己烷溶液、蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品、蘇丹紅Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品、蘇丹紅Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品、蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品。

安譜法：乙腈、水、正己烷、丙酮、蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品、蘇丹紅Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品、蘇丹紅Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品、蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品、0.45 μm有機(jī)濾膜。

1.2儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用儀器與設(shè)備見表1、表2。

表1　國標(biāo)法儀器列表

表2　安譜法儀器列表

1.3色譜條件

1.3.1 國標(biāo)法色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18 4.6 mm×150 mm，3.5 μm（或相當(dāng)型號色譜柱）；

流動(dòng)相：溶劑A 0.1%甲酸的水溶液∶乙腈=85∶15；溶劑B 0.1%甲酸的乙腈溶液∶丙酮=80∶20；

流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：蘇丹紅Ⅰ 478 nm；蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ520 nm；于蘇丹紅I出峰后切換。進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 安譜法色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18-WP 4.6 mm×150 mm，5 μm；

流動(dòng)相：乙腈∶水= 88∶12；

流速：1 mL/min；

紫外波長：500 nm；

柱溫：35 ℃；

進(jìn)樣量：20 μL。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

1.4.1 國標(biāo)法

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ及蘇丹紅Ⅳ各10.0 mg（按實(shí)際含量折算），用乙醚溶解后再用正己烷定容至250 mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6） mL，用正己烷定容至25 mL。此標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為（0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56） μg/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 安譜法

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ及蘇丹紅Ⅳ各10.0 mg，用丙酮溶解后用乙腈定容至20 mL，制成500 mg/L的溶液，再稀釋至50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.02、0.1、0.2、1.0、4.0） mL，用乙腈定容至10 mL。此標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為（0.1、0.5、1.0、5.0、20.0） mg/L。

1.5樣品處理

1.5.1 國標(biāo)法

1.5.1.1 紅辣椒粉等粉狀樣品

稱取1 g樣品于三角瓶中，加入10 mL正己烷，超聲5 min，過濾，用10 mL正己烷洗滌殘?jiān)鼣?shù)次，至洗出液無色，合并正己烷液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL以下，慢慢加入到氧化鋁層析柱中。為保證層析效果，在柱中保持正己烷液面為2 mm左右時(shí)上樣。在全程的層析過程中不應(yīng)使柱干涸。用正己烷少量多次淋洗濃縮瓶，一并注入層析柱?？刂蒲趸X表層吸附的色素帶寬小于0.5 cm。待樣液完全流出后，視樣品中含油類雜質(zhì)的多少用10 mL正己烷洗柱，直至流出液無色。棄去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60 mL洗脫，收集、濃縮后，用丙酮轉(zhuǎn)移并定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后待測。

1.5.1.2 紅辣椒油、火鍋料、奶油等油狀樣品

稱取0.5 g（準(zhǔn)確至0.001 g）樣品于小燒杯中，加入5 mL正己烷溶解。難溶解的樣品可于正己烷中加溫溶解。按1.5.1.1中“慢慢加入到氧化鋁層析柱……過濾后待測”操作。

1.5.1.3 辣椒醬、番茄沙司等含水量較大的樣品

稱取10 g（準(zhǔn)確至0.01 g）樣品于離心管中，加10 mL水將其分散成糊狀，含增稠劑的樣品多加水。加入30 mL正己烷∶丙酮 = 3∶1，勻漿5 min，3 000 r/min離心10 min， 吸出正己烷層。于下層再加入20 mL×2次正己烷勻漿，離心，合并3次正己烷，加入無水硫酸鈉5 g脫水。過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干并保持5 min，用5 mL正己烷溶解殘?jiān)螅?.5.1.1中“慢慢加入到氧化鋁層析柱……過濾后待測”操作。

1.5.1.4 香腸等肉制品

稱取粉碎樣品10 g（準(zhǔn)確至0.01 g）于三角瓶中，加入60 mL正己烷充分勻漿5 min，濾出清液，再以20 mL×2次正己烷勻漿，過濾。合并3次濾液，加入5 g無水硫酸鈉脫水。過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸至5 mL以下，按1.5.1.1中“慢慢加入到氧化鋁層析柱中……過濾后待測”操作。

1.5.2 安譜法

1.5.2.1 粉狀樣品

實(shí)驗(yàn)室選取市售辣椒粉為代表樣品，稱取1 g樣品（準(zhǔn)確至0.001 g）于50 mL離心管中。加入10 mL正己烷，旋渦混合30 s，超聲5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液至另一個(gè)50 mL離心管中。10 mL正己烷溶解殘?jiān)瑯硬僮饕淮?。合并正己烷液，用氮吹儀濃縮至5 mL以下，等待SPE上樣。

1.5.2.2 油狀樣品

實(shí)驗(yàn)室選取市售辣椒油、食用油、火鍋調(diào)料為代表樣品，稱取0.5 g樣品于50 mL離心管中。加入10 mL正己烷，旋渦混合30 s，超聲5 min，4 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液等待SPE上樣。

1.5.2.3 含水量較多的樣品

實(shí)驗(yàn)室選取市售辣椒醬、方便面醬包、番茄沙司、腐乳為代表樣品，稱取5 g（準(zhǔn)確至0.01 g），加入5 mL水將其分散成糊狀。再加入10 mL正己烷∶丙酮= 3∶1，旋渦混合5 min，超聲5 min， 4 000 r/min離心10 min，吸出正己烷層。10 mL正己烷溶解殘?jiān)瑯硬僮饕淮?。合并正己烷液，加? g無水硫酸鈉，用氮吹儀濃縮至干，用5 mL正己烷溶解后等待SPE上樣。

1.5.2.4 固態(tài)制品

實(shí)驗(yàn)室選取香腸、豆豉、禽蛋作為代表樣品，經(jīng)粉碎機(jī)處理后稱取粉碎樣品1 g（準(zhǔn)確至0.01 g）于50 mL離心管中。加入10 mL正己烷，旋渦混合30 s，超聲5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液至另一個(gè)50 mL離心管中。10 mL正己烷溶解殘?jiān)瑯硬僮饕淮?。合并正己烷液，加? g無水硫酸鈉，用氮吹儀濃縮至干，用5 mL正己烷溶解后等待SPE上樣。

1.6SPE方法

1.6.1 國標(biāo)法

活化平衡：10 mL正己烷；

上樣：5 mL上樣；

淋洗：10 mL至流出液無色；

洗脫：5%丙酮正己烷60 mL；

濃縮定容：濃縮定容至5 mL，過0.45 μm有機(jī)濾膜。

1.6.2 安譜法

活化：5 mL二氯甲烷；

平衡：5 mL正己烷；

上樣：取5 mL上樣，2 mL正己烷潤洗；

淋洗：5 mL正己烷；

洗脫：5 mL二氯甲烷；

濃縮定容：40 ℃氮吹近干，1 mL 0.8%氨水乙腈，過0.22 μm親水PTFE針式濾器。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜圖比較

由圖2和圖4比較可看出，安譜法的色譜圖中沒有出現(xiàn)國標(biāo)法色譜圖中蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的兩個(gè)色譜峰現(xiàn)象。由圖3與圖5比較可看出，以辣椒油為基質(zhì)時(shí)，安譜法測得的峰面值比國標(biāo)法高，這是由于國標(biāo)法中的氧化鋁活性不好控制，吸附或洗脫不完全時(shí)可能會(huì)有一些殘留。

2.2樣品回收率

按照上述基質(zhì)分類的方法進(jìn)行樣品處理，樣品加標(biāo)濃度均為1 μg/mL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜圖，1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)的峰面積為蘇丹紅Ⅰ：0.610 0 mAU ·min；蘇丹紅Ⅱ：0.619 9 mAU·min；蘇丹紅Ⅲ：0.873 9 mAU·min；蘇丹紅Ⅳ：0.749 3 mAU·min。具體樣品處理情況見表3～表10。

圖2　國標(biāo)法蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ1×10-6光照色譜

圖3　國標(biāo)法辣椒粉蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ1×10-6色譜

圖4　安譜法蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ1×10-6光照色譜

圖5　安譜法辣椒油中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ色譜

表3～表10提供了國標(biāo)法和安譜法對這四種蘇丹紅染料各種基質(zhì)的處理情況。結(jié)果表明，采用CNW 蘇丹紅專用SPE小柱和基質(zhì)處理的優(yōu)化方案之后，安譜法的回收率穩(wěn)定在95.0%～98.0%之間，而國標(biāo)法的回收率穩(wěn)定在80%～90%之間，因此安譜法在回收率方面優(yōu)于國標(biāo)法。

表3　國標(biāo)法蘇丹紅Ⅰ

表4　安譜法蘇丹紅Ⅰ

表5　國標(biāo)法蘇丹紅Ⅱ

由表7～表10可看到，辣椒醬中檢測到了蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ。為了判斷其性質(zhì)，將其與蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的標(biāo)準(zhǔn)光譜圖對比，結(jié)果如圖6所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，辣椒醬中的疑似峰與蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)的色譜峰不一致，所以并非蘇丹紅，而是雜質(zhì)峰。

表6　安譜法蘇丹紅Ⅱ

表7　國標(biāo)法蘇丹紅Ⅲ

表8　安譜法蘇丹紅Ⅲ

表9　國標(biāo)法蘇丹紅Ⅳ

表10　安譜法蘇丹Ⅳ紅

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

國標(biāo)法在0.16～2.56 μg/mL內(nèi)以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程如表11所示。

表11　國標(biāo)法蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6　辣椒醬光譜與蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)光譜對比

表12　安譜法蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)曲線

安譜法在0.10～20.00 mg/L內(nèi)以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程如表12所示。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積形成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，其中安譜法檢測樣品的最低濃度比國標(biāo)法低，測定的相關(guān)系數(shù)比國標(biāo)法高，線性關(guān)系更好。

3　結(jié)語

在蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品混合物的檢測中，對GB/T 19681-2005國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的高效液相色譜檢測方法進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，在優(yōu)化前處理方法和色譜條件后分別進(jìn)行對比分析。從實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)：

1）安譜法專用SPE小柱，SPE過程簡單直觀，易于操作。而國標(biāo)法采用氧化鋁層析柱，過程復(fù)雜，操作繁瑣，活性不穩(wěn)定。

2）安譜法配合反相色譜柱，選擇適量丙酮+乙腈作定容溶劑，而國標(biāo)法采用正己烷作定容溶劑。正己烷是正相的，根據(jù)相似相容原理，會(huì)對反相色譜柱造成一定影響。

3）安譜法色譜分析條件簡單快速，流動(dòng)相易于配制，并把國標(biāo)法繁瑣的梯度條件改為恒定條件，選擇更合適的波長，檢測目標(biāo)物質(zhì)出峰良好。

4）安譜法分析研究了光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象，精確分析定量，提高了檢測準(zhǔn)確度。而國標(biāo)法忽略了光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象，準(zhǔn)確度低。

5）國標(biāo)法由于填料活度控制和大體積洗脫液濃縮帶來不確定因素。安譜法改進(jìn)了國標(biāo)法，提高了分析精密度。

6）安譜法檢測限和國標(biāo)法保持一致。

綜上所述，安譜法在國標(biāo)法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，更適合于食品中蘇丹紅含量的檢測。

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計(jì)量動(dòng)態(tài)

上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院第四屆科技節(jié)拉開帷幕

2016年5月19日，上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院第四屆科技節(jié)以“聚焦計(jì)量科技，助力科創(chuàng)中心”為主題，正式拉開帷幕。上海交通大學(xué)常務(wù)副校長林忠欽院士、上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局總工程師陸敏等應(yīng)邀出席活動(dòng)。

會(huì)上，林忠欽以“提升中國制造業(yè)質(zhì)量與品牌戰(zhàn)略”為題作主題報(bào)告，重點(diǎn)闡述了我國實(shí)施制造強(qiáng)國戰(zhàn)略的意義、制造業(yè)質(zhì)量的現(xiàn)狀和發(fā)展目標(biāo)、發(fā)達(dá)國家工業(yè)質(zhì)量發(fā)展經(jīng)驗(yàn)以及我國制造業(yè)質(zhì)量品牌提升三年行動(dòng)計(jì)劃等內(nèi)容。

陸敏對上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院第四屆科技節(jié)開幕表示熱烈祝賀，并指出，上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院多年來秉持和發(fā)揚(yáng)“善于思考、勇于創(chuàng)新、敢于擔(dān)當(dāng)”的科研精神，緊密圍繞計(jì)量檢測新技術(shù)和新領(lǐng)域，依托優(yōu)勢研究方向，積極組建科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，在“十二五”期間共獲省部級以上獎(jiǎng)項(xiàng)21項(xiàng)，其中上海市科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)5項(xiàng)，取得了出色的成績。他希望上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院以增強(qiáng)計(jì)量科技創(chuàng)新能力、積極探索落實(shí)科技成果轉(zhuǎn)化為己任，抓住改革創(chuàng)新先機(jī)，勇于探索、精準(zhǔn)發(fā)力，推進(jìn)上?？苿?chuàng)中心建設(shè)。

會(huì)議宣讀了上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院獲得2015年度上海市科技進(jìn)步獎(jiǎng)、國家質(zhì)檢總局科技興檢獎(jiǎng)等多個(gè)獎(jiǎng)項(xiàng)的獲獎(jiǎng)名單，并對獲獎(jiǎng)?wù)哌M(jìn)行了表彰。

上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院科技節(jié)活動(dòng)至今已舉辦至第四屆，繼主題報(bào)告暨頒獎(jiǎng)儀式后還將舉辦科技創(chuàng)新論壇、服務(wù)中小企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化講座、科技創(chuàng)新成果展、跨世紀(jì)宣傳等系列活動(dòng)。

（本刊通訊員）

Comparison and optimization of detection methods for sudan red in foods

Jiang Chenzhou， Sun Jiemin， Zhang Chizhong，Shao Minghua
（ANPEL Scientifc Instrument （Shanghai） Co.，Ltd.）

The high performance liquid chromatography（HPLC） stipulated in GB 19681-2005 was adopted to detect sudan red in foods. The detection method was optimized in pre-treatment conditions and chromatographic conditions. Compared with the HPLC， the experimental results showed that the dedicated SPE cartridges had good recovery， SPE process was simple and intuitive， easy to operate， chromatographic conditions were simple and rapid， the mobile phase was easy to prepare， the recoveries was 95.0%-98.0%， which was superior to the recovery of HPLC 80%-90%， so the optimized detection method is more suitable for detecting sudan red in foods.

HPLC； sudan red； food； optically induced isomerization