利用RNA干擾技術(shù)沉默稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因

李　嬌，杜　娟，李尚偉

(1.貴州大學(xué) 昆蟲研究所，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗實，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 昆蟲資源開發(fā)利用特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

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·研究報告·

利用RNA干擾技術(shù)沉默稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因

李嬌，杜娟，李尚偉*

(1.貴州大學(xué) 昆蟲研究所，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗實，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 昆蟲資源開發(fā)利用特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)是一種主要的水稻害蟲，幾丁質(zhì)合成酶是昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)合成通路中的一個關(guān)鍵酶，在昆蟲生長發(fā)育中具有重要作用，是控制害蟲的理想靶標。本文采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，以稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因(CmCHSA)為靶標，設(shè)計兩個靶位點CmCHSA-I和CmCHSA-II，在體外分別合成其雙鏈RNA(dsRNA)，用顯微注射法導(dǎo)入3齡幼蟲體內(nèi)，然后通過表型觀察和熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測干擾效應(yīng)。結(jié)果表明，注射兩種dsRNA后縱卷葉螟對水稻的取食明顯下降，生長發(fā)育阻滯，蟲體變小變黑和畸形，有的出現(xiàn)死亡。RT-qPCR表明，注射CmCHSA-I和CmCHSA-II兩種dsRNA在 96 h后，CmCHSA的表達量相比對照分別下降了59%和64%。注射CmCHSA-I和 CmCHSA-II 兩種dsRNA 7 d后，稻縱卷葉螟的死亡率分別為80%和83.33%，與對照組相比，分別增加了66.67%和70%。本研究用注射法RNAi技術(shù)成功實現(xiàn)了對稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因的沉默，為利用該技術(shù)研究昆蟲基因的功能，以及通過轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)防治稻縱卷葉螟奠定了基礎(chǔ)。

RNA干擾；稻縱卷葉螟；幾丁質(zhì)合成酶A基因；雙鏈RNA

水稻(Oryzasativa)是人類的一種主要糧食作物，世界上有一半以上的人口以稻米為主食。我國是世界上最大的大米生產(chǎn)國和消費國，有65%以上的人口以大米為主食。因此，水稻高產(chǎn)豐收對我國糧食安全至關(guān)重要。然而，蟲害則是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一。稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)屬于鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，是對水稻危害最為嚴重的主要害蟲之一[1-2]。它是一種典型的遷飛性害蟲，在國內(nèi)外均有廣泛的分布[3]。其幼蟲主要危害水稻，取食水稻葉肉，僅留表皮，形成白色條斑，影響光合作用，造成水稻千粒重降低，秕谷增加，一般可造成減產(chǎn)2-3成，嚴重達5成以上[4,5]。目前，稻縱卷葉螟的防治主要有噴灑化學(xué)農(nóng)藥殺蟲劑和釋放天敵赤眼蜂兩種，但大面積的使用化學(xué)農(nóng)藥不僅造成農(nóng)藥殘留和殺傷天敵，還導(dǎo)致稻縱卷葉螟產(chǎn)生抗藥性；釋放赤眼蜂進行生物防治不僅需要大量的天敵，還費時費力，不利于長期穩(wěn)定地控制該害蟲。因此，急需探索一條安全、環(huán)保、高效的生物防控途徑。

幾丁質(zhì)合成酶(chitin synthase)是幾丁質(zhì)合成通路中的一個關(guān)鍵酶，其主要生理功能是催化UDP-N-乙酰氨基葡糖形成幾丁質(zhì)多聚物，幾丁質(zhì)又是昆蟲外骨骼(表皮)和中腸圍食膜的重要成分，其合成與降解調(diào)控昆蟲的蛻皮和生長發(fā)育[6]。昆蟲中含有2種類型的幾丁質(zhì)合成酶基因——幾丁質(zhì)合成酶基因A(CHSA)和B(CHSB)，其中，CHSA主要負責表皮和氣管幾丁質(zhì)的合成[7]。在植物和高等動物中不存在CHSA基因，同時鑒于它在昆蟲生長發(fā)育中的重要性，常常作為一個理想的殺蟲劑作用靶標。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象?？琢铎砙8]利用RNAi技術(shù)沉默家蠶(Bombyxmori)幾丁質(zhì)合成酶A基因(BmCHSA)后，家蠶的生長發(fā)育受到抑制，表現(xiàn)出個體變小、半蛻皮和不蛻皮等三種發(fā)育異?，F(xiàn)象。田宏剛[9]用表達了靶向甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)SeCHSAdsRNA的細菌飼喂甜菜夜蛾幼蟲，在持續(xù)喂食7 d后，發(fā)現(xiàn)靶基因SeCHSA的mRNA表達水平被抑制，且幼蟲的生長發(fā)育受到明顯抑制并產(chǎn)生了蛻皮障礙等死亡表型。因此，沉默幾丁質(zhì)合成酶基因，能夠抑制昆蟲的生長發(fā)育，最終達到防治害蟲的目的。

RNAi已成為研究基因功能和害蟲生物防治的強有力工具。雙鏈RNA或小干擾RNA(siRNA)分子導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)的方式有注射法、飼喂法和轉(zhuǎn)基因法等，其中最常用的是顯微注射法。在茄二十八星瓢蟲(Epilachnavigintioctopunctata)中，通過顯微注射RNAi技術(shù)對與翅形成的相關(guān)基因vestigial和scalloped進行干擾，可以導(dǎo)致成蟲出現(xiàn)飛行缺失型[10]。Tang等[11]利用顯微注射向甜菜夜蛾幼蟲注射靶向兩個重要儲存蛋白基因hexamerin1和storageprotein1的dsRNA后發(fā)現(xiàn)，注射組的死亡率明顯高于對照組。目前顯微注射dsRNA法已經(jīng)在很多鱗翅目昆蟲中建立了比較成熟的體系，如在斜紋夜蛾Spodopteralitura[12]、煙草天蛾Manducasexta[13]和家蠶Bombyxmori[14]等。本研究采用RNAi技術(shù)，在體外合成兩種靶向CmCHSA基因的dsRNA后，通過顯微注射將其導(dǎo)入稻縱卷葉螟的3齡幼蟲體內(nèi)，定時觀察稻縱卷葉螟對水稻的取食情況、蟲體表型和基因表達水平的變化，成功建立一套成熟的RNAi技術(shù)體系，為進一步明確該基因在稻縱卷葉螟生長發(fā)育過程中的重要作用提供理論依據(jù)，為利用RNAi防治稻縱卷葉螟提供實踐基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

本實驗供試昆蟲為本實驗室人工飼的養(yǎng)稻縱卷葉螟3齡幼蟲，飼養(yǎng)條件為26±1℃，相對濕度70%-80%，光周期14L∶10D，寄主植物為水稻。

TRIzol(Invitrogen)試劑、Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit和GeneJET RNA Purification Kit購自美國Thermo Fisher公司；大腸桿菌EscherichiacoliJM109感受態(tài)細胞、DL 2000 DNA marker、PrimeScript RT-PCR Kit及LA Taq DNA聚合酶均購于大連TaKaRa公司；pGEM-T Easy載體購于美國Promega公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix和C1000 Thermal Cycler購自美國Bio-Rad公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；顯微注射器、PCR耗材、離心管及其他常規(guī)試劑和耗材均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。引物合成及PCR產(chǎn)物測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1靶位點設(shè)計

根據(jù)CmCHSA基因的開放閱讀框(ORF)，選擇干擾序列，確定靶標區(qū)域，經(jīng)Blast 比對后與其他基因應(yīng)具有較低的同源性，此步驟旨在減低沉默目的基因mRNA過程中脫靶沉默其他非目的基因的概率。采用3個在線RNAi寡核苷酸靶位點設(shè)計工具(http://siDirect2.RNAi.jp/；http://biotools.idtdna.com/Scitools/Applications/RNAi/RNAi.aspx/;http:

//optirna.unl.edu/)尋找具有較多Dicer酶切位點的靶標序列。最終選擇了以下兩個片段，下劃線部分表示引物序列：

1.2.2合成dsRNA的引物設(shè)計

利用Primer 6.0設(shè)計針對上述兩條片段用于合成dsRNA的特異性引物，在每條引物的5′端加上一段20 bp的T7啟動子序列，目的是以PCR產(chǎn)物作為模板體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子能形成dsRNA，引物信息見表1。根據(jù)CmCHSA基因的ORF序列設(shè)計定量PCR引物CmCHSAq-F 和CmCHSAq-R，以稻縱卷葉螟看家基因CmActin為內(nèi)參基因(GenBank登錄號: JN029806)設(shè)計引物CmActin-F和CmActin-R(表1)，用于CmCHSA的mRNA表達水平測定。

表1　稻縱卷葉螟CmCHSA的雙鏈RNA合成和定量PCR引物

注：表中引物下劃線部分表示T7啟動子序列。

1.2.3總RNA提取和cDNA合成

取2頭饑餓處理的3齡稻縱卷葉螟，放在研缽中，在液氮中充分研磨后，迅速轉(zhuǎn)入1.5 mL的RNase-free 離心管中，按照TRIzol試劑盒(Invitrogen)使用說明提取總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用NanoDrop 2000測定RNA的純度和濃度。cDNA的合成按照PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa)試劑盒說明書進行操作，合成的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4高濃度模板的制備

以稻縱卷葉螟的cDNA 為模板，采用表1中的引物分別對靶位點CmCHSA-I和CmCHSA-II進行反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)擴增，反應(yīng)體系為50 μL： cDNA模板 3 μL；10 × LA PCR buffer 5 μL；dNTP mixture (2.5 mM each)8 μL；20 μM的上、下游引物各1 μL；LA Taq DNA polymerase 0.5 μL；ddH2O 31.5 μL。CmCHSA-I 的PCR反應(yīng)條件為：95℃ 1 min； 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，共 33個循環(huán)；72℃ 延伸 10 min，4℃保存。CmCHSA-II的 PCR反應(yīng)條件為：95℃ 1 min； 94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，共 33個循環(huán)；72℃ 延伸 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omega)回收純化后，將兩個回收產(chǎn)物分別連接到pGEM-T Easy載體上，經(jīng)藍白斑篩選，挑出重組子，進行PCR和測序驗證。

將測序驗證正確的克隆菌擴大培養(yǎng)，用康為世紀高純度質(zhì)粒提試劑盒(PurePlasmid Mini Kit)進行質(zhì)粒提取。以提取的質(zhì)粒DNA為模板，進行二次PCR擴增，反應(yīng)體系為25 μL： 質(zhì)粒DNA模板 1.5 μL；10 × LA PCR buffer 2.5 μL；dNTP mixture (2.5 mM each) 4 μL；20 μM的上、下游引物各0.5 μL；LA Taq DNA polymerase 0.25 μL；ddH2O 15.75 μL。CmCHSA-I的 PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min； 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 70 s，共 36個循環(huán)；72℃ 延伸 10 min，4℃保存。CmCHSA-II的 PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min； 94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共 36個循環(huán)；72℃ 延伸 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳，回收純化，確保所獲得的DNA濃度不小于300 ng/μL，以滿足后續(xù)dsRNA合成的濃度要求。

1.2.5dsRNA的合成

分別以上述的高濃度DNA為模板，按照Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo Fisher)試劑盒說明書合成dsRNA。體外轉(zhuǎn)錄體系：5 × TranscriptAid reaction buffer 4 μL；ATP/CTP/GTP/UTP各2 μL；DNA模板(兩端帶T7)4 μL；Transcript aid enzyme mix 2 μL，加Nuclease-free ddH2O補足至20 μL。在PCR儀中37℃反應(yīng)5 h后，分別加入2 μL DNase I和RNase A于PCR儀中孵育15 min去除冗余的DNA及單鏈RNA，再分別加入2 μL EDTA終止反應(yīng)。合成的dsRNA經(jīng)Gene JET RNA Purification Kit(Thermo Fisher)試劑盒純化后，各取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測其大小和完整度；使用NanoDrop 2000測定其濃度和純度。

1.2.6顯微注射

選擇同一批次發(fā)育良好的稻縱卷葉螟3齡幼蟲，用微量注射器進行注射。注射時雙手輕輕捏住蟲體，注射位置為蟲體8-10腹節(jié)處，每頭蟲注射量為0.5 μL，dsRNA濃度約3 ng/μL。以注射0.02 M PBS(pH 7.2)和不注射的稻縱卷葉螟為對照，每組設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)注射30頭蟲。注射完成后將蟲放置于直管中用水稻葉片飼養(yǎng)，直管放入人工氣候箱中，飼養(yǎng)條件為溫度26±1℃，RH 70%-80%，光周期14L∶10D。每隔12 h，觀察幼蟲取食、表型及存活情況。

1.2.7定量PCR檢測沉默效應(yīng)

注射dsRNA后的96 h，分別收集2頭存活的個體，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以稻縱卷葉螟看家基因CmActin為內(nèi)參基因，在C1000 PCR儀(Bio-Rad)上進行熒光定量PCR(RT-qPCR)，檢測CmCHSA的表達水平，以空白組作為對照。反應(yīng)體系為20 μL：iTaq universal SYBR Green supermix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，共進行40個循環(huán)，用溶解曲線來確定擴增片段的特異性。所有實驗進行3次重復(fù)。

1.2.8死亡率與校正死亡率

在注射CmCHSA的兩種dsRNA溶液(CmCHSA-I 和CmCHSA-II dsRNAs)以及PBS 7 d后，分別統(tǒng)計直管中稻縱卷葉螟的死亡情況，并計算其校正死亡率。死亡率計算公式為：死亡率(%)=死亡蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100%；校正死亡率計算公式為：校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)×100%。

1.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用2-ΔΔCt法分析CmCHSA基因mRNA在實驗組和對照組的相對表達量。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0軟件中方差分析(ANOVA)的Duncan氏新復(fù)極差檢驗，顯著性檢驗水平P<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1稻縱卷葉螟幼蟲總RNA的提取

用TRIzol(Invitrogen)提取稻縱卷葉螟的總RNA，電泳檢測結(jié)果顯示28S和18S這兩條帶清晰且明亮，沒有出現(xiàn)拖尾和彌散帶現(xiàn)象(圖1)，表明所提取RNA的完整度較好，沒有發(fā)生降解。紫外分光光度計測定其A260/A280為1.96，說明提取的總RNA質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。

2.2靶位點的克隆驗證

以稻縱卷葉螟的cDNA 為模板，分別對CmCHSA-I和CmCHSA-II兩個靶位點進行RT-PCR擴增，結(jié)果顯示所得片段CmCHSA-I和CmCHSA-II的大小分別為500 bp和438 bp (圖1)，與預(yù)期相符?？寺y序后，通過DNAMAN 6.0軟件進行比對分析，確認測序結(jié)果分別與CmCHSA-I和CmCHSA-II的基因序列完全一致，證明PCR體系可以正確擴增合成dsRNA所需的片段。

圖1　稻縱卷葉螟總RNA提取及靶位點的RT-PCR電泳圖

Fig.1Electrophoretogram of total RNA and RT-PCR oftargetsitesfromC.medinalis

M: DL2000 DNA marker；1: 總RNA；2: CmCHSA-I；3: CmCHSA-II

2.3高濃度模板的獲得

以含有靶位點CmCHSA-I和CmCHSA-II的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得的DNA片段大小分別為500 bp和438 bp (圖2)。切膠回收后，紫外分光光度檢測結(jié)果顯示CmCHSA-I和CmCHSA-II的濃度分別為2.2 μg/μL和2.3 μg/μL，所獲得的DNA可作為體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA的模板。

2.4dsRNA的獲得

以回收得到的高濃度DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄，合成的dsRNA經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，所獲得的dsRNA產(chǎn)物條帶單一，與Marker對比后大小符合，分別為500 bp和438 bp (圖3)。經(jīng)NanoDrop 2000測定，dsRNA的A260/A280分別為1.93和1.92，濃度分別為2.62 μg/μL和2.76 μg/μL，均在3.0 μg/μL左右。

圖2　稻縱卷葉螟靶位點CmCHSA-I和

M: DL2000 DNA marker；1: CmCHSA-I質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；2: CmCHSA-II質(zhì)粒PCR產(chǎn)物

圖3　稻縱卷葉螟靶位點CmCHSA-I和CmCHSA-II

Fig.3The synthesized dsRNAs of CmCHSA-I and CmCHSA-II fromC.medinalis throughinvitrotranscription

M: DL2000 DNA marker；1: 靶位點CmCHSA-I dsRNA; 2: 靶位點CmCHSA-II dsRNA

2.5取食情況觀察

在注射CmCHSA-I和CmCHSA-II dsRNAs以及PBS 24 h、48 h和96 h后，空白對照和PBS對照中水稻葉片上被稻縱卷葉螟取食的斑明顯多于實驗組(圖4)。兩個對照組之間在水稻葉片的取食變化上沒有明顯的差異，且隨著時間的推移，其對水稻的取食情況越來越嚴重；兩個實驗組中，稻縱卷葉螟對水稻的取食情況隨著注射時間的推移沒有明顯的變化。這表明注射dsRNA后，稻縱卷葉螟的生命活動相較于對照降低了。

圖4　注射dsRNA后不同時間段稻縱卷葉螟 對水稻的取食情況

2.6注射dsRNA對稻縱卷葉螟表型的影響

注射CmCHSA的dsRNA溶液48 h和96 h后，稻縱卷葉螟幼蟲的生長發(fā)育明顯滯后于對照，蛻皮受阻，蟲體變小變黑，有的甚至出現(xiàn)死亡情況；而PBS對照和空白對照中蟲體表型無明顯變化，生長發(fā)育情況良好(圖5A和5B)。繼續(xù)飼養(yǎng)至蟲體化蛹，觀察發(fā)現(xiàn)，相較于兩個對照組，實驗組的蛹變小變黑(圖5C)；6 d后，對照組的蛹羽化為成蟲，留下蛹殼，而實驗組的蛹幾乎不羽化，最后出現(xiàn)縮水、干癟和死亡等情況(圖5D)。與對照組羽化后的成蟲相比，注射CmCHSA-I dsRNA實驗組羽化后的成蟲出現(xiàn)翅展不平、觸角彎曲等畸形蟲態(tài)；注射CmCHSA-II dsRNA實驗組，沒有羽化的成蟲(圖5E)。兩個注射dsRNA的實驗組之間，稻縱卷葉螟在表型上沒有明顯差異。

2.7RNA干擾效應(yīng)檢測

RT-qPCR檢測結(jié)果表明，注射dsRNA后，CmCHSA的表達水平顯著下降(圖6)。注射CmCHSA-I dsRNA 96 h后，CmCHSA的表達量相比空白對照下降了59%；注射CmCHSA-II dsRNA 96 h后，CmCHSA的表達量相比空白對照下降了64%。CmCHSA的表達量在2個實驗組之間及在2個對照組之間沒有顯著差異。結(jié)果表明注射CmCHSA基因的dsRNA對該基因具有明顯的沉默效應(yīng)。

圖5　注射dsRNA后稻縱卷葉螟的表型變化

A：注射dsRNA 48 h后稻縱卷葉螟的表型；B：注射dsRNA 96 h后稻縱卷葉螟的表型；C：注射dsRNA后稻縱卷葉螟蛹的表型；D：注射dsRNA 6 d后稻縱卷葉螟對照組(1和2)的蛹殼和實驗組(3和4)的干癟蛹；E：注射dsRNA后稻縱卷葉螟成蟲的表型

1: 空白對照；2: 注射PBS對照；3: 注射CmCHSA-I dsRNA；4: 注射CmCHSA-II dsRNA

圖6　注射dsRNA后CmCHSA的相對表達量Fig. 6　Relative expression level ofCmCHSA in C.medinalis after injection of dsRNA

圖中數(shù)值為平均值±標準差，柱形圖上的不同字母表示基因表達顯著差異(P<0.05，方差分析中的Duncan新復(fù)極差法)。

2.8死亡率與校正死亡率

在注射PBS溶液、CmCHSA-I和CmCHSA-II dsRNAs 7 d后，稻縱卷葉螟的死亡率分別為16.67%、80%和83.33%，相較于對空白照組，分別增加了3.34%、66.67%和70%；各組的校正死亡率分別為3.85%、76.92%和80.77% (表2)。結(jié)果表明 RNA干擾效應(yīng)相當明顯，注射CmCHSA基因的dsRNA對稻縱卷葉螟產(chǎn)生嚴重的致死效應(yīng)。

表2　注射dsRNA 7 d后稻縱卷葉螟死亡率及校正死亡率

注：同一列中的不同字母表示差異顯著。

3　結(jié)論與討論

體外注射RNAi是通過在體外人工合成雙鏈RNA，利用顯微注射使其在細胞內(nèi)特異性降解其同源mRNA，從而使靶基因沉默[15]。近年來，在利用RNAi技術(shù)研究昆蟲基因功能方面取得了很大的成功。Arakane等在體外合成赤擬谷盜兩個幾丁質(zhì)合成酶基因TcCHS1A和TcCHS1B的dsRNA，通過體外顯微注射發(fā)現(xiàn)，注射TcCHS1A的dsRNA能夠干擾赤擬谷盜從幼蟲-幼蟲，幼蟲-蛹，蛹-成蟲的蛻皮過程，導(dǎo)致蟲體無法蛻皮；而注射TcCHS1B的dsRNA則對其蛻皮沒有影響，但是可以引起取食量減少從而使蟲體的體型顯著減小[16]，甚至對其繁殖和卵的孵化都有影響。陳曉菲等[17]對甜菜夜蛾注射幾丁質(zhì)合成酶基因SeCHSA的dsRNA后，SeCHSA基因的表達被抑制，昆蟲的生長發(fā)育受到影響，蟲體變黑變小，無法完成蛻皮，即使能夠蛻皮，蟲體也比正常的小，無法繼續(xù)生長至化蛹。在飛蝗幾丁質(zhì)合成酶基因LmCHS1功能研究中，研究者利用體外注射的方法對東亞飛蝗2齡幼蟲注射LmCHS1的dsRNA后發(fā)現(xiàn)，飛蝗出現(xiàn)蛻皮時間延長、蛻皮后生長發(fā)育緩慢、不能完成蛻皮、蟲體變小變黑、畸形等現(xiàn)象；且注射組蟲體還表現(xiàn)出取食量明顯下降，不能滿足生長發(fā)育而死亡等現(xiàn)象，死亡率達到95%，同時目標基因mRNA的表達水平也顯著下降而不影響非靶標基因的表達[18]。這些研究結(jié)果表明，注射靶向昆蟲幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA后，昆蟲出現(xiàn)蛻皮障礙，蟲體變小，畸形，甚至死亡等現(xiàn)象，且降低幾丁質(zhì)合成酶基因的mRNA表達水平。從這些研究中可以推導(dǎo)出，幾丁質(zhì)合成酶基因是昆蟲生長發(fā)育所必須的基因。通過RNAi來研究基因的功能，一般是檢測靶標基因的沉默水平和分析相應(yīng)表型，然而并非每個基因的沉默都能導(dǎo)致可見的表型，因此必須根據(jù)所研究基因的功能進行具體分析[19]。

本研究中，CmCHSA基因被沉默后，仍有一部分幾丁質(zhì)被合成，這與前人的研究是一致的。余志濤等[20]研究中華稻蝗(Oxyachinensis)幾丁質(zhì)合成酶1(OcCHS1) 基因功能時發(fā)現(xiàn)，干擾該基因后仍有一部分幾丁質(zhì)被合成。已有文獻報道注射SeCHSA基因dsRNA后，對該基因的干擾效果不是100%有效，在干擾后同樣有少量幾丁質(zhì)仍在合成[17]，類似的情況也出現(xiàn)在果蠅中[21]。這可能是因為蟲體中仍有部分CmCHSA翻譯成蛋白質(zhì)，催化合成少量的幾丁質(zhì)；也可能是CmCHSA酶蛋白在注射dsRNA前就已經(jīng)在表皮細胞中有一定量的合成，即使抑制了CmCHSA的表達，原來已經(jīng)存在的幾丁質(zhì)合成酶蛋白仍然可以合成少量的幾丁質(zhì)。本研究只是沉默了CmCHSA而沒有沉默CmCHSB，如果同時沉默這2種類型的CmCHS，可能RNA干擾的效果會更好。另外，本實驗室對稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成通路上的第1個酶海藻糖酶基因(CmTre1)進行過RNA干擾[22]，下一步我們考慮同時沉默CmTre和CmCHS，推測幾丁質(zhì)的合成將會被極大地抑制。

利用RNAi技術(shù)防治害蟲是生物防治的新策略，具有極大的潛力。Mao等[23]在煙草和擬南芥中表達了靶向棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)細胞色素P450基因CYP6AE14的dsRNA，結(jié)果表明棉鈴蟲取食表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物后，誘導(dǎo)RNA干擾效應(yīng)。Baum等[24]用轉(zhuǎn)基因RNAi方法控制鞘翅目害蟲根螢葉甲(Diabroticavirgiferavirgifera)，極大地推動了轉(zhuǎn)基因RNAi作物抗蟲的研究進程。Zha等[25]把褐飛虱(Nilaparvatalugens)中腸里高表達的3個基因NlHT1、Nlcar和Nltry轉(zhuǎn)入水稻，在水稻中表達它們的dsRNA，褐飛虱取食后，這3個基因有效地被沉默，但沒有觀察到死亡表型。注射RNAi很難用于田間進行害蟲防控，而轉(zhuǎn)基因RNAi可以實現(xiàn)這個目標。實現(xiàn)RNAi介導(dǎo)的植物控制害蟲，篩選合適的靶標基因是成功的關(guān)鍵。因此，可以用注射RNAi方法進行靶標基因篩選，然后用轉(zhuǎn)基因RNAi實現(xiàn)田間害蟲防治。轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)防治害蟲具有下列優(yōu)勢：特異性高，精準抗蟲；轉(zhuǎn)入的靶標基因序列在作物和人畜中無高度序列相似性，對人畜安全；RNA分子不穩(wěn)定易降解，沒有殘留污染問題；害蟲不會產(chǎn)生抗性。因此，轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)抗蟲更高效更安全。在注射RNAi的基礎(chǔ)上，下一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻中同時表達CmTre和CmCHS的dsRNA，使稻縱卷葉螟取食這些轉(zhuǎn)基因水稻時攝入這些dsRNA，引起RNA干擾效應(yīng)，從而引起稻縱卷葉螟生長發(fā)育障礙或死亡，實現(xiàn)對該害蟲的綠色防控。

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Using RNA interference technique to silence chitin synthase A Gene in the rice leaf folder, Cnaphalocrocis medinalis (Lepidoptera: Pyralidae)

LIJiao,DUJuan,LIShang-wei*

(1.ProvincialKeyLaboratoryforAgriculturalPestManagementofMountainousRegion,InstituteofEntomology,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.SpecialKeyLaboratoryofInsectResourceDevelopmentandUtilization,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The rice leaf folder,Cnaphalocrocismedinalis(Lepidoptera: Pyralidae) is a chief pest of rice. Chitin synthase is a key enzyme in the pathway of insect chitin synthesis and plays an important role in insect growth and development. Thus, it is believed that this enzyme is an ideal target for pest control. In this study, we designed two target sites (CmCHSA-I and CmCHSA-II) specific tochitinsynthaseA(CmCHSA) inC.medinalisfor RNA interference (RNAi). CmCHSA-I and CmCHSA-II double-stranded RNAs (dsRNAs) were synthesizedinvitroand were separately introduced into the 3rdinstar larvae through microinjection. RNAi effects were detected by phenotype observation and real-time quantitative PCR (RT-qPCR). After injection of dsRNA, the larvae developed loss of appetite, growth retardation, and malformation; some died. RT-qPCR showed that at the 96thh after injection of CmCHSA-I and CmCHSA-II dsRNAs, the mRNA expression ofCmCHSAdecreased by 59% and 64%, respectively, in comparison with the control. At the 7thd after injection of CmCHSA-I and CmCHSA-II dsRNAs, the larval mortality rates were 80% and 83.33%, respectively, increased by 66.67% and 70%, compared to the control.CmCHSAwas successfully silenced using RNAi by injection, which will lay the foundation for elucidating the function of insect genes as well as for controllingC.medinalisby transgenic RNAi.

RNA interference;Cnaphalocrocismedinalis;chitinsynthaseA; double-stranded RNA

1008-0457(2016)03-0010-08國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.03.002

2016-04-14；修回日期：2016-05-22

國家自然科學(xué)基金項目“利用RNAi技術(shù)防治稻縱卷葉螟的研究”(31360443)；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊項目“貴州省節(jié)肢動物資源開發(fā)利用科技創(chuàng)新人才團隊”(黔科合人才團隊[2014]4001號)。

李尚偉(1965-)，博士，副教授，主要研究方向：分子生物學(xué)與生物技術(shù)；E-mail: swlii@163.com。

Q966

A