一株陸生耐鹽珊瑚球菌次生代謝產(chǎn)物的研究

黃　艷,　朱紅惠

1.廣東省微生物研究所, 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省微生物菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070;2.佛山市海天(高明)調(diào)味食品股份有限公司, 廣東 佛山 528511

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一株陸生耐鹽珊瑚球菌次生代謝產(chǎn)物的研究

黃艷1,2,朱紅惠1*

1.廣東省微生物研究所, 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省微生物菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070;2.佛山市海天(高明)調(diào)味食品股份有限公司, 廣東 佛山 528511

研究了陸生耐鹽珊瑚球菌(Coralloccus)5X1發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取后的化學(xué)成分,以期得到有活性的先導(dǎo)化合物。采用硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、高效液相色譜等方法進(jìn)行分離純化,通過理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)分析鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，從陸生耐鹽珊瑚球菌5X1的乙酸乙酯萃取物中分離得到3個(gè)化合物,分別鑒定為環(huán)(酪氨酸-脯氨酸)、環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)和乙?；揭野贰＿@3種化合物均為首次從陸生耐鹽珊瑚球菌5X1中分離得到。

耐鹽珊瑚球菌；次生代謝產(chǎn)物；環(huán)二肽

目前，對(duì)常規(guī)環(huán)境粘細(xì)菌的研究較多，特殊生境粘細(xì)菌的研究較少。隨著粘細(xì)菌研究的不斷深入，1998年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)海洋嗜鹽和耐鹽粘細(xì)菌以來，海洋粘細(xì)菌(marine myxobacteria)逐步被研究者們認(rèn)可并密切關(guān)注，對(duì)不同生境下的粘細(xì)菌研究力度不斷加強(qiáng)[1]，特別是特殊生境下的粘細(xì)菌研究。Reichenbach[2]在1992年的研究報(bào)道中指出：陸生粘細(xì)菌不能在含鹽量為1%的環(huán)境下生長(zhǎng)，使陸生環(huán)境下耐鹽粘細(xì)菌的研究不被重視，且是否存在遠(yuǎn)離海洋的陸生耐鹽粘細(xì)菌一直飽受爭(zhēng)議。近50年來，被開發(fā)作新的抗生素產(chǎn)生菌的只有藍(lán)細(xì)菌和粘細(xì)菌，粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了100余種全新結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物和 600多種新的結(jié)構(gòu)衍生物，成為繼放線菌后的第二大抗生素產(chǎn)生菌[3]。粘細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物研究主要以堆囊菌屬(Sorangium)和粘球菌屬(Myxococcus)為主，對(duì)于占目前粘細(xì)菌分離比例約為23.1%的珊瑚球菌屬(Corallococcus)的次生代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道寥寥無幾[4]。鞠培殿[5]對(duì)Corallococcuscoralloides085B04的研究得到了幾個(gè)結(jié)構(gòu)新穎并具有良好的抗腫瘤活性的新化合物。此粘細(xì)菌并非特殊生境粘細(xì)菌，同樣表現(xiàn)出次生代謝產(chǎn)物多樣性。粘細(xì)菌是一類具有社會(huì)性行為的細(xì)菌類群，擁有龐大的基因組，大小從5M～14.78Mbp不等，大基因組賦予粘細(xì)菌廣泛的環(huán)境適應(yīng)性和天然產(chǎn)物多樣性。作為生命存在的形式之一，微生物為了適應(yīng)極端環(huán)境的生存條件，在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了獨(dú)特的防御機(jī)制，因此能夠產(chǎn)生與常規(guī)環(huán)境微生物不同的次生代謝產(chǎn)物[6]。

本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事粘細(xì)菌的研究工作，從新疆鹽堿地環(huán)境分離得到一株陸生耐鹽粘細(xì)菌[7]，能夠在含2.5%的NaCl環(huán)境下生存。鑒于粘細(xì)菌具備天然產(chǎn)物多樣性，且該菌株具備耐鹽性，本文以該陸生耐鹽粘細(xì)菌為研究對(duì)象，對(duì)其發(fā)酵條件中的鹽濃度、次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以期拓寬特殊生境粘細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物的研究領(lǐng)域。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器與試劑Bruker公司核磁共振波譜儀(500 MHz AVANCE Ⅲ型)，Waters公司質(zhì)譜分析儀(Acquity UPLC-Q-Tof Micro)，Thermo Finngan公司氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Trace DSQ)，武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司大容量旋轉(zhuǎn)式普通搖床(PZ1000B)，上海亞榮生化儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000型)。青島海洋化工廠柱層析用硅膠(100～200目、200～300目)，Merck公司高效薄層硅膠板(Silica gel 60 F254)，月旭科技HPLC制備柱(Welch)：21.2 mm×250 mm，10-Micron，三秦科技Flash Chromatographic Cdumns，Sepa Flash:40～63 μm Silica Gel。色譜純甲醇(NCNW)，其他溶劑及試劑購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，均為分析純。

1.1.2菌種陸生耐鹽粘細(xì)菌，編號(hào)5X1由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得。

1.1.3培養(yǎng)基：CY培養(yǎng)基：Tryptone 3.0 g，Yeast Extact 1.0 g，CaCl2·2H2O 1.0 g，加水定溶至1 L，pH 7.2。

1.2方法

1.2.1確定發(fā)酵最適含鹽度陸生耐鹽粘細(xì)菌的培養(yǎng)，以CY培養(yǎng)基作為菌株生長(zhǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上，添加不同濃度的NaCl(0%，0.5%，1%，1.5%，2%)，每個(gè)處理3個(gè)平行。用分光光度計(jì)OD600的吸收值測(cè)量粘細(xì)菌菌體密度，震蕩搖勻后測(cè)量以確保菌懸液均一。此外，采用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液后的初膏得率和離心后干菌體得率進(jìn)一步選擇最佳發(fā)酵鹽濃度。將不同含鹽量的發(fā)酵液各處理分別合并、離心，收集菌體，低溫烘干，測(cè)干菌體得率；離心后的上清用等體積的乙酸乙酯萃取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，稱量測(cè)得發(fā)酵液初膏得率。

1.2.2確定發(fā)酵最適溫度在上述粘細(xì)菌發(fā)酵最適含鹽度的基礎(chǔ)上，盡可能確保相同接種量，分別在30℃、33℃、35℃、37℃條件下培養(yǎng)，觀察菌體生長(zhǎng)情況，測(cè)量各溫度下菌懸液的OD600吸收值。

1.2.3種子培養(yǎng)在最適含鹽度和最適溫度條件下，在CY培養(yǎng)基中接入菌體，震蕩培養(yǎng)3 d,作為種子液。

1.2.4發(fā)酵陸生耐鹽珊瑚球菌的培養(yǎng)：將加入最適鹽含量的CY液體培養(yǎng)基分裝，500 mL三角瓶中裝200 mL，1 000 mL三角瓶中裝400 mL，取適量種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在最適溫度下震蕩培養(yǎng)7 d。

1.2.5提取分離將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min 離心，將菌體及上清分離，上清用等體積的乙酸乙酯萃取3次，濃縮乙酸乙酯相，得到乙酸乙酯萃取的粗提物。經(jīng)過制備型硅膠柱粗分，再經(jīng)高壓制備型C18柱分離。

1.2.6粘細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定采用CTAB法抽提粘細(xì)菌總DNA；用細(xì)菌通用引物27F和1492R對(duì)粘細(xì)菌菌株總DNA進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增[8,9]，PCR產(chǎn)物送到上海英駿生物公司廣州分公司測(cè)序。將所得序列在EzTaxon(http://www.eztaxon.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比，使用Mega 4.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹以確定其歸屬。

2　結(jié)果與分析

2.1最適發(fā)酵鹽濃度的確定

如圖1所示，通過菌懸液吸光值的測(cè)定、初膏得率和干菌體得率的數(shù)據(jù)測(cè)定，得出發(fā)酵液OD600吸收值1%NaCl達(dá)到最大值(圖1A)，初膏得率2%NaCl時(shí)達(dá)到最大值(圖1B)，干菌體得率在1%NaCl達(dá)到最大值(圖1C)，綜合來看，最終確定1%為最佳NaCl濃度。

圖1　不同濃度的氯化鈉對(duì)5X1生長(zhǎng)的影響Fig.1　Effect of different NaCl concentration on the growth of 5X1.A：發(fā)酵液OD600吸收值；B：發(fā)酵浸膏得率；C:干菌體得率

2.2最適發(fā)酵溫度的確定

陸生耐鹽珊瑚球菌在不同溫度條件下培養(yǎng)，菌懸液OD600吸收值有一定的差異。在不同時(shí)間段發(fā)酵液的培養(yǎng)狀態(tài)不同，如表1所示。將陸生耐鹽珊瑚球菌在不同溫度下培養(yǎng)3 d后，在OD600下測(cè)定吸光度值如圖2所示，33℃培養(yǎng)條件下，OD600吸收值最大，與肉眼觀察結(jié)果相一致，說明33℃最適合菌體生長(zhǎng)。因而，確定陸生耐鹽珊瑚球菌發(fā)酵的最佳培養(yǎng)溫度為33℃。

2.3化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)中壓制備色譜的快速制備型硅膠柱進(jìn)行粗分離，制備液相分離條件見表2，對(duì)其中的四號(hào)段進(jìn)行HPLC分析，再由高壓制備色譜的C18柱分離得到2個(gè)環(huán)二肽，均為已知化合物。化合物Ⅰ，白色粉末狀樣品(甲醇),碘熏蒸后顯黃色，印三酮表現(xiàn)為負(fù)反應(yīng)，用6 mol/L鹽酸水解后呈紅色，呈陽(yáng)性反應(yīng)[8]，化合物Ⅰ、Ⅱ的核磁共振圖譜分析數(shù)據(jù)(圖3)與文獻(xiàn)[9]中的分析數(shù)據(jù)基本一致，化合物Ⅲ：無色油狀樣品，易溶于甲醇，與文獻(xiàn)[10]中的分析數(shù)據(jù)基本一致。根據(jù)NMR波譜數(shù)據(jù)，及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定為環(huán)(酪氨酸-脯氨酸)cyclo-(Tyr-Pro)，環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)cyclo-(phe-Pro)，乙酰基苯乙胺，3個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)見圖4。

圖2　不同溫度下菌體第3天的生長(zhǎng)情況Fig.2　Effect of different temperatures on the growth of 5X1 on the 3rd day.

發(fā)酵溫度發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液狀態(tài)描述30℃48～60h云霧狀,發(fā)酵液呈淡黃色>60h球狀菌體,發(fā)酵液顏色加深33℃24h云霧狀,發(fā)酵液呈淡黃色36～48h球狀菌體,發(fā)酵液呈深黃色35℃48～60h云霧狀,發(fā)酵液呈淡黃色>60h球狀菌體,發(fā)酵液顏色加深37℃>60h少量菌體,發(fā)酵液色淺>96h少量菌體,不成球狀,發(fā)酵液呈淡黃色

2.45X1菌株鑒定結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源序列對(duì)比分析后可見，粘細(xì)菌的16S rDNA序列與CorallococcusmacrosporesDSM 14697T同源性最為相近，但又顯示與粘球菌屬具有較近的親緣關(guān)系。這主要是因?yàn)?007年Corallococcus才由粘球菌屬分離出來。根據(jù)該菌株形態(tài)特征和分子生物學(xué)分析結(jié)果，初步鑒定該粘細(xì)菌為Corallococcussp.。

表2　化合物的分離純化條件

圖3　3種化合物在HPLC分析圖譜Fig.3　HPLC chromatography of three compounds.A:化合物Ⅰ;B:化合物Ⅱ：C:化合物Ⅲ

圖4　3種化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.4　The structure of three compounds.

圖5　菌株5X1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5　Phylogenetic tree of strain 5X1.

3　討論

本文對(duì)特殊生境下陸生耐鹽粘細(xì)菌5X1的最佳發(fā)酵條件和發(fā)酵液經(jīng)由乙酸乙酯萃取后的化學(xué)成分進(jìn)行研究，目前共鑒定出2個(gè)環(huán)二肽類化合物和乙?；揭野?，為粘細(xì)菌珊瑚球菌屬中首次分離得到。微生物的次生代謝產(chǎn)物的形成與培養(yǎng)基成分具也有一定相關(guān)性。本試驗(yàn)中3種化合物的分離純化條件是粘細(xì)菌5X1在添加1%NaCl的 CY培養(yǎng)基上，33℃條件下液態(tài)發(fā)酵后，經(jīng)乙酸乙酯萃取進(jìn)一步分離純化得到的。經(jīng)過分子生物學(xué)初步鑒定粘細(xì)菌5X1為珊瑚球菌屬。但陸生耐鹽珊瑚球菌5X1的次生代謝產(chǎn)物絕不限于上述3種化合物，其他組分由于純度、含量等問題未能夠進(jìn)一步完成化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，后期仍需深入研究。

近年來對(duì)微生物次生代謝產(chǎn)物的研究表明，環(huán)二肽類在多種微生物中均有分離獲得，并顯現(xiàn)出多種生物活性[11]。隨著研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)環(huán)二肽作為重要的信號(hào)分子在信息傳遞方面扮演著重要的角色。本文中分離得到的2種環(huán)二肽具有抑菌活性[12],還具有誘導(dǎo)生物發(fā)光和色素產(chǎn)生的活性[13]，這可能與該珊瑚球菌培養(yǎng)過程中形成的鮮艷的橙色有關(guān)。此外，已報(bào)道這2種環(huán)二肽在信號(hào)傳遞過程中具有重要的作用[14]，這2個(gè)環(huán)二肽首次在陸生耐鹽粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于粘細(xì)菌子實(shí)體的形成時(shí)期細(xì)胞聚集等方面的研究具有重要意義，同時(shí)，環(huán)(酪氨酸-脯氨酸)和環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)除在海洋生物中共同發(fā)現(xiàn)外，還存在于共生生物中。這對(duì)粘細(xì)菌群感效應(yīng)的研究也有一定的參考價(jià)值。

系統(tǒng)發(fā)育比較分析顯示，海洋粘細(xì)菌序列與陸地粘細(xì)菌顯著不同,并在高分類水平(科)表現(xiàn)出明顯的種群地理分布特征[15]。本試驗(yàn)中分離得到的環(huán)二肽曾被共同分離于海洋細(xì)菌[16,17]，林永成[18]和王書錦[19]認(rèn)為海洋細(xì)菌具有產(chǎn)生環(huán)肽類化合物的傾向，乙?；揭野芬捕喾蛛x自海洋生物，如軟珊瑚、紅樹林植物土壤的微生物。環(huán)(酪氨酸-脯氨酸)和環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)和乙?；揭野饭餐嘁娪诤Ｑ笊锎x產(chǎn)物中。但海洋粘細(xì)菌與陸生粘細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育方面的顯著不同表現(xiàn)出種群地理分布差異性，陸生耐鹽珊瑚球菌5X1卻表現(xiàn)出一定的耐鹽性，這可能是由于上述環(huán)二肽和乙?；揭野吩谛盘?hào)傳遞中的影響有關(guān)。是否具備生成以上3種代謝產(chǎn)物的微生物具備一定的耐鹽性？此問題還需進(jìn)一步展開基因組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育組學(xué)的研究，以尋找陸生耐鹽粘細(xì)菌、海洋粘細(xì)菌與普通陸生非耐鹽粘細(xì)菌的進(jìn)化關(guān)系。

特殊生境陸生耐鹽粘細(xì)菌的研究為粘細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物的研究打開了新的篇章，本文證實(shí)了遠(yuǎn)離海洋的陸生粘細(xì)菌具備耐鹽性，該生境下的粘細(xì)菌值得深入研究。

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Study of the Secondary Metabolism from Salt-tolerantCoralloccusmacrosporus

HUANG Yan1,2, ZHU Hong-hui1*

1.StateKeyLaboratoryofAppliedMicrobiologySouthernChina;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialCultureCollectionandApplication;GuangdongOpenLaboratoryofAppliedMicrobiology,GuangdongInstituteofMicrobiology,Guangzhou510070,China;2.Foshan Haitian (Gaoming) Flavouring & Food Co., LTD., Guangdong Foshan 528511, China

Inordertoisolateandidentifytheactivatedleadcompound,westudiedthechemicalconstituentsfromsalt-tolerantCoralloccus 5X1thatextractedbyethylacetate.Thecompoundswereisolatedbysilicagelcolumn,Sepha-dexLH-20columnchromatographyandHPLCtechniques.Andthesecompoundswereidentifiedbythephysico-chemicalpropertiesandspectralanalysis.Theresultsshowedthattherewerethreecompoundsisolatedfromtheethylacetateextractsofsalt-tolerantCoralloccus 5X1.Theywereidentifiedascyclo(Tyr-Pro),cyclo(Phe-Pro)andN-(2-phenylethyl)-acetamide.AllofthecompoundswereisolatedfromCoralloccusforthefirsttime.

salt-tolerantCoralloccus;secondarymetabolism;cyclo-dipeptide

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.09

2016-03-16; 接受日期：2016-04-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170009；31470141)；廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012B050700009)資助。

黃艷，工程師，研發(fā)方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵和過程控制。E-mail:huang.yan14@qq.com。*通信作者：朱紅惠，研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源的挖掘、保藏及應(yīng)用。E-mail:zhuhh@gdim.cn