瘋草內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis次級代謝產(chǎn)物分析

薛瑞旭，權(quán)海云，任禎慧，路　浩，趙寶玉

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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瘋草內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis次級代謝產(chǎn)物分析

薛瑞旭，權(quán)海云，任禎慧，路浩，趙寶玉*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

摘要：為闡明瘋草內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)組成，為其生物活性研究和開發(fā)利用提供依據(jù)，以本實(shí)驗(yàn)室保存的瘋草內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis為研究菌株，采用察氏液體培養(yǎng)基對該菌發(fā)酵培養(yǎng)30 d，收集菌絲體和發(fā)酵液，按照植物化學(xué)成分傳統(tǒng)預(yù)試方法進(jìn)行預(yù)試。在此基礎(chǔ)上用不同極性有機(jī)溶劑梯度萃取得到菌絲體和發(fā)酵液石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相，經(jīng)薄層色譜檢測及氣相檢測方法對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步分析。系統(tǒng)預(yù)試表明，Undifilum oxytropis發(fā)酵產(chǎn)物中含有生物堿、蛋白質(zhì)、酚類與鞣質(zhì)、黃酮類、醌類、揮發(fā)油和油脂等物質(zhì)；薄層色譜檢測發(fā)現(xiàn)，Undifilum oxytropis發(fā)酵產(chǎn)物中至少含有5種化合物，且菌絲體和發(fā)酵液正丁醇相均有苦馬豆素及其類似物存在；氣相色譜分析Undifilum oxytropis發(fā)酵液中苦馬豆素含量為5.17×10-3g/L。瘋草內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis發(fā)酵產(chǎn)物含有苦馬豆素等多種次級代謝產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：Undifilum oxytropis；苦馬豆素；次級代謝產(chǎn)物；內(nèi)生真菌；瘋草

瘋草(locoweed)是含苦馬豆素(swainsonine，SW)并可引起動物典型瘋草中毒神經(jīng)癥狀和病理學(xué)變化的棘豆屬(Oxytropis)和黃芪屬(Astragalus)有毒植物的統(tǒng)稱[1]。動物采食后會引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病 “瘋草病(Localism)”或“綿羊猝狙(Peastruck)”。早在1984年，Tulsiani D R等[2]首次證明瘋草的毒性物質(zhì)主要是苦馬豆素。毒理學(xué)研究表明，苦馬豆素可抑制哺乳動物細(xì)胞內(nèi)溶酶體α-甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ的活性，引起細(xì)胞內(nèi)低聚糖代謝和糖蛋白合成障礙，導(dǎo)致細(xì)胞空泡變性和組織器官功能紊亂。在過度放牧的退化草地，瘋草因其抗逆性強(qiáng)形成優(yōu)勢種群，成為世界范圍內(nèi)制約草地畜牧業(yè)健康發(fā)展的最嚴(yán)重有毒植物。正當(dāng)人們苦惱該如何遏制瘋草肆虐時(shí)，1985年Hino等意外發(fā)現(xiàn)苦馬豆素有抗腫瘤活性，而且在免疫調(diào)節(jié)等方面也有一定的優(yōu)勢，從此引起眾多學(xué)者對其藥用價(jià)值的關(guān)注。大量研究表明，苦馬豆素不僅能抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)殺滅腫瘤細(xì)胞的能力，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床應(yīng)用階段[3-6]。

目前，苦馬豆素純品因植物提取周期長、效率低和人工合成工藝復(fù)雜、純化難度大等原因，導(dǎo)致苦馬豆素價(jià)格極其昂貴，高達(dá)1 400元/mg，嚴(yán)重制約著苦馬豆素抗癌活性研究的深入。2003年Braun K等[7]從瘋草植物中分離到Undifilumoxytropis，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該菌能夠產(chǎn)生苦馬豆素，且感染濃度與宿主植物中苦馬豆素濃度高度相關(guān)。國內(nèi)學(xué)者也從甘肅棘豆、冰川棘豆、小花棘豆等7種瘋草類有毒植物中分離到該菌，且通過氣相色譜檢測發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)苦馬豆素；此外，國內(nèi)外學(xué)者也從豆類絲核菌(Rhizoctonialeguminicola)及金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到苦馬豆素。研究證明豆類絲核菌自然干燥菌絲體中苦馬豆素含量達(dá)到12.3 mg/g～29.9 mg/g[8]，金龜子綠僵菌干燥菌絲體和發(fā)酵液中苦馬豆素含量分別為2.26 mg/g和11.21 mg/L[9]。這些系列研究為進(jìn)一步拓寬苦馬豆素的來源，特別是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)成苦馬豆素為一種可能。

因此，本試驗(yàn)在課題組前期瘋草內(nèi)生真菌多樣性及其產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌篩選研究的基礎(chǔ)上，利用本實(shí)驗(yàn)室從甘肅棘豆中分離鑒定的瘋草內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis為研究對象，通過對其發(fā)酵液和菌絲體次級代謝產(chǎn)物化學(xué)成分的初步分析，闡明瘋草內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis次級代謝產(chǎn)物的種類，以期為今后Undifilumoxytropis發(fā)酵生產(chǎn)苦馬豆素工藝優(yōu)化及其次級代謝產(chǎn)物活性研究提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株Undifilumoxytropis菌株由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心菌種保藏專利號為CICC2493)。

1.1.2主要試劑苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供(植物提取，氣相標(biāo)定純度98%)；PDA培養(yǎng)基和改良察氏發(fā)酵培養(yǎng)基，Czapek’s公司產(chǎn)品；吡啶(AR)，國藥集團(tuán)產(chǎn)品；BSTFA+TMCS硅烷化試劑，百靈威科技有限公司產(chǎn)品；硅膠GF254，青島海洋化工產(chǎn)品；其他常規(guī)有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器GC-14C氣相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；威瑪龍色譜數(shù)據(jù)工作站；AT.SE-54型毛細(xì)管色譜柱30 m×0.25 mm，中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所色譜技術(shù)研究開發(fā)中心提供；BL6100電子天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；Lab Tech旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京萊伯泰科儀器有限公司產(chǎn)品；ZWY-2102C雙層恒溫?fù)u床，上海智誠產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城工貿(mào)公司產(chǎn)品；HPS-250 生化培養(yǎng)箱，東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；ZF-2三用紫外儀，上海市安亭電子儀器廠生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1Undifilumoxytropis的活化及發(fā)酵培養(yǎng)將保藏菌株Undifilumoxytropis采用“尖端挑取法”接種至PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7 d，再將5 mm菌餅接至Czapek’s[10]液體培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，條件為室溫(25℃)、轉(zhuǎn)速為150 r/min，時(shí)間為30 d。發(fā)酵完成后，減壓抽濾分離菌絲體和發(fā)酵液。發(fā)酵液減壓濃縮成浸膏；菌絲體45℃烘干后研缽研磨至粉末狀，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Undifilumoxytropis發(fā)酵產(chǎn)物化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試制備Undifilumoxytropis發(fā)酵產(chǎn)物(菌絲體和發(fā)酵液混合物)醇提液、水提液及石油醚提取液，用常規(guī)試管預(yù)試驗(yàn)方法初步檢測所含化學(xué)成分種類。

1.2.3Undifilumoxytropis發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分段萃取菌絲體粉末用10倍量工業(yè)酒精超聲提取3 h，收集上清，重復(fù)3次后合并上清液，減壓濃縮至浸膏。發(fā)酵液和菌絲體浸膏分別采用適量甲醇加熱溶解，置4℃過夜，抽濾后得上清，重復(fù)3次后合并醇提液。將醇提物中醇揮干后加水分散，按照傳統(tǒng)植物化學(xué)成分預(yù)試方法從極性由低到高依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行分段萃取，重復(fù)操作直至相鄰兩次上清顏色無明顯差別，減壓濃縮分別得到菌絲體和發(fā)酵液石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相。

1.2.4Undifilumoxytropis各萃取相薄層色譜檢測分別取菌絲體和發(fā)酵液石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相浸膏少許，用適量甲醇溶解，毛細(xì)管點(diǎn)樣于GF254薄層硅膠板上，上行法展開，待溶劑前沿距薄層板上端1 cm處取出，揮干展開劑，先在254 nm紫外光下觀察有無熒光，再用顯色劑顯色，記錄各斑點(diǎn)顏色及Rf值。

1.2.5Undifilumoxytropis發(fā)酵液正丁醇萃取相苦馬豆素氣相色譜(GC)檢測

1.2.5.1苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制具體過程同吳晨晨等[11]。

1.2.5.2樣品前處理與苦馬豆素含量測定取發(fā)酵液正丁醇相浸膏0.048 7 g用吡啶超聲提取30 min，共提取3次，每次20 μL，合并上清后離心，得到吡啶上清液約60 μL；取其中50 μL上清液加入20 μL TMCS混勻，60℃反應(yīng)30 min后2 μL進(jìn)樣，色譜條件同1.2.5.1。將測定結(jié)果帶入苦馬豆素質(zhì)量濃度-峰面積線性回歸方程，計(jì)算出吡啶溶液中苦馬豆素的質(zhì)量濃度(ρ)，再根據(jù)以下公式(x=ρ(g/L)×V吡啶(L)/V總發(fā)酵液(L)計(jì)算出Undifilumoxytropis發(fā)酵液中苦馬豆素含量x(g/L)。

2　結(jié)果

2.1Undifilum oxytropis發(fā)酵產(chǎn)物系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果

通過系統(tǒng)預(yù)試初步確定Undifilumoxytropis發(fā)酵產(chǎn)物中主要含有生物堿、蛋白質(zhì)、酚類與鞣質(zhì)、黃酮類、醌類、揮發(fā)油、油脂等物質(zhì)，不含有皂苷、強(qiáng)心苷、有機(jī)酸等物質(zhì)，結(jié)果見表1。

2.2Undifilum oxytropis發(fā)酵產(chǎn)物各萃取相薄層色譜檢測結(jié)果

Undifilumoxytropis菌絲體各萃取相檢測結(jié)果見表2。石油醚相50 mL/L硫酸乙醇顯色出現(xiàn)4個(gè)紫色斑點(diǎn)，表明至少含有4種物質(zhì)；氯仿相50 mL/L硫酸乙醇顯色出現(xiàn)3個(gè)紫色斑點(diǎn)，表明至少含有3種物質(zhì)；乙酸乙酯相50 mL/L硫酸乙醇顯色出現(xiàn)1個(gè)紫色斑點(diǎn)，在相同位置改良碘化鉍鉀顯色呈橙紅色，表明至少含有1種生物堿；正丁醇相50 mL/L硫酸乙醇顯色出現(xiàn)2個(gè)深棕色斑點(diǎn)，Ehrlich’s 試劑顯色出現(xiàn)2個(gè)紫紅色斑點(diǎn)，表明至少含有3種物質(zhì)。在同一展開條件下，Rf值及斑點(diǎn)顏色均無顯著差異的化合物可能是同種或者同類物質(zhì)，更為重要的是本次試驗(yàn)菌絲體正丁醇相Ehrlich’s顯色呈陽性，表明菌絲體中的確有苦馬豆素及其類似物存在(圖1)。

表1　Undifilum oxytropis發(fā)酵液和菌絲體化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果

Undifilumoxytropis發(fā)酵液各萃取相檢測結(jié)果見表3。石油醚相50 mL/L硫酸乙醇顯色出現(xiàn)2個(gè)斑點(diǎn)，表明至少含有2種物質(zhì)；氯仿相5%硫酸乙醇顯色出現(xiàn)2個(gè)墨綠色斑點(diǎn)，表明至少含有2種物質(zhì)；乙酸乙酯相50 mL/L硫酸乙醇顯色出現(xiàn)1個(gè)紫色斑點(diǎn)，在相同位置改良碘化鉍鉀顯色呈橙紅色，表明至少含有1種生物堿；正丁醇相50 mL/L硫酸乙醇顯色出現(xiàn)2個(gè)深棕色斑點(diǎn)，Ehrlich’s 試劑顯色出現(xiàn)3個(gè)紫紅色斑點(diǎn)，表明至少含有4種物質(zhì)。在同一展開條件下，Rf值及斑點(diǎn)顏色均無顯著差異的化合物可能是同種或者同類物質(zhì)，本次試驗(yàn)發(fā)酵液正丁醇相Ehrlich’s顯色出現(xiàn)3個(gè)陽性斑點(diǎn)，表明發(fā)酵液中的確有苦馬豆素及其類似物存在(圖1)。

2.3Undifilum oxytropis發(fā)酵液正丁醇萃取相苦馬豆素氣象色譜檢測結(jié)果

2.3.1苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制通過系列質(zhì)量濃度梯度苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品的GC分析，發(fā)現(xiàn)苦馬豆素出峰時(shí)間穩(wěn)定在4.13附近，對苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(x)、峰面積(y)進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程：y=25 474x(R2=0.996)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

表2　Undifilum oxytropis菌絲體各萃取相TLC檢測結(jié)果

表3　Undifilum oxytropis發(fā)酵液各萃取相TLC檢測結(jié)果

1.苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品； 2.菌絲體正丁醇相； 3.發(fā)酵液正丁醇相

1.SW standard； 2.Butanol phase of mycelium； 3.Butanol phase of broth

圖1Undifilumoxytropis菌絲體和發(fā)酵液

正丁醇相TLC檢測色譜圖

Fig.1TLC results ofUndifilumoxytropismycelium and broth butanol phase

圖2　苦馬豆素質(zhì)量濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2Undifilumoxytropis發(fā)酵液正丁醇相GC分析由圖3和圖4可知，苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣品中苦馬豆素的出峰時(shí)間都為4.13，由此可以準(zhǔn)確證實(shí)Undifilumoxytropis發(fā)酵液正丁醇相中確實(shí)含有苦馬豆素。由2.3.1得出的苦馬豆素質(zhì)量濃度-峰面積線性回歸方程，計(jì)算出吡啶溶液中苦馬豆素的質(zhì)量濃度(ρ)為4.55 g/L，進(jìn)而得出發(fā)酵液正丁醇中苦馬豆素含量(x)為5.17×10-3g/L。

3　討論

截至目前，多種抗腫瘤物質(zhì)如紫杉醇、喜樹堿、長春新堿等藥物已被人們廣泛利用，但副作用的存在也迫使科學(xué)家積極尋求毒性較小的替代藥物。苦馬豆素的問世給醫(yī)學(xué)界帶來了希望，已知苦馬豆素具有多種生物活性，且其抗腫瘤I和IB期試驗(yàn)已完成[12-13]，目前正進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)。加拿大Inflazyme和日本Astellas公司分別研制出“鹽酸苦馬豆素”和免疫調(diào)節(jié)劑苦馬豆素在多個(gè)國家授權(quán)許可。國內(nèi)“棘豆扶正膠囊”的使用也對270例重癥癌癥患者臨床治療起到了較好的療效。目前，該生物堿苦馬豆素可通過人工合成[14-17]、植物提取[18-21]及生物合成[22-24]獲得，然而人工合成通路復(fù)雜且收率低，植物提取率較低且草場破壞率較高，而生物合成由于發(fā)酵工程的迅速發(fā)展成為了目前生物活性物質(zhì)獲取的主流方式。

圖3　苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品GC色譜圖

圖4　Undifilum oxytropis發(fā)酵液正丁醇相GC色譜圖

在本試驗(yàn)中，系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果顯示發(fā)酵產(chǎn)物中含有多種活性物質(zhì)，這與張宇等[25]的結(jié)論有一定差異，一方面可能培養(yǎng)基中有機(jī)成分的不同對代謝物存在促進(jìn)或抑制作用，甚至引發(fā)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，另一方面是發(fā)酵時(shí)間及菌株所處狀態(tài)不同也會對代謝產(chǎn)物有影響[26]。另外，提取中物質(zhì)損耗導(dǎo)致低于物質(zhì)最低檢測限也會造成結(jié)果差異。除一般化學(xué)成分探索外，苦馬豆素生物合成一直都是個(gè)謎，2010年，Mukherjee S等[27]成功構(gòu)建了Undifilumoxytropis原生質(zhì)體及非瞬性轉(zhuǎn)化體系。隨后他們將該菌中酵母氨酸還原酶基因序列中斷后苦馬豆素水平有所上升，證實(shí)該序列參與苦馬豆素代謝[28]。國內(nèi)張蕾蕾等[29-30]也對此進(jìn)行了初步的探索。本試驗(yàn)TLC分析發(fā)現(xiàn)Undifilumoxytropis發(fā)酵產(chǎn)物中有多種化合物存在，而且Rf值及斑點(diǎn)顏色綜合對比后發(fā)現(xiàn)有些化合物同時(shí)存在于菌絲體和發(fā)酵液中。更重要的是菌絲體和發(fā)酵液正丁醇相中均有苦馬豆素存在，且發(fā)酵液中苦馬豆素顯色斑點(diǎn)較深，這可能源于苦馬豆素極性大，極易溶于水，菌絲體中合成后溶于發(fā)酵液而形成的。同時(shí)在發(fā)酵液中還存在苦馬豆素類似物，這與之前瘋草類植物提取物TLC檢測結(jié)果有相似之處[31]，由此推斷這些苦馬豆素類似物可能參與了苦馬豆素生物合成，為苦馬豆素是真菌源生物堿提供了理論支持，但該菌中苦馬豆素生物合成通路研究還需進(jìn)一步深入開展。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Undifilumoxytropis發(fā)酵產(chǎn)物中主要含有生物堿、蛋白質(zhì)、酚類與鞣質(zhì)、黃酮類、醌類、揮發(fā)油、油脂等物質(zhì)，而且發(fā)酵液和菌絲體中均有苦馬豆素及其類似物，GC測定Undifilumoxytropis發(fā)酵液中苦馬豆素含量為5.17×10-3g/L，是瘋草類有毒植物中苦馬豆素含量的幾倍。因此，對Undifilumoxytropis進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化將有望確定該菌高產(chǎn)苦馬豆素的最佳培養(yǎng)條件，進(jìn)而為大批量發(fā)酵生產(chǎn)苦馬豆素提供理論基礎(chǔ)。

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動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,37(7):71-75ProgressinVeterinaryMedicine

收稿日期：2016-02-13

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部“十二五”公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203062)

作者簡介：薛瑞旭(1991-)，女，山西呂梁人，碩士研究生，主要從事瘋草內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物研究。*通訊作者

中圖分類號:S856.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0064-07

Analysis of Secondary Metabolites ofUndifilumOxytropisfrom Locoweeds

XUE Rui-xü,QUAN Hai-yun,REN Zhen-hui,LU Hao,ZHAO Bao-yu

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

Abstract:To clarify chemical composition of secondary metabolites and provide evidence for biological activity studies and application of Undifilum oxytropis from locoweeds,experimental strain preserved in our lab was fermented about 30 d by Czapek’s fermentation; Collected mycelium and fermentation broth were analyzed by system pre-test; on this basis,petroleum ethe,chloroform,ethyl acetate and butanol phase of mycelium and broth were obtained by organic solvents gradient extraction,then TLC testing and GC testing were conducted.System pre-test concluded that fermentative culture contains alkaloids,proteins,phenols,tannins,flavonoids,quinones,volatile oil and grease.Fermentation system of Undifilum oxytropis contains at least 5 compounds by TLC testing.SW and its analogues indwell exist in butanol phase of mycelium and broth.GC testing drawed that the content of SW in fermentation broth of Undifilum oxytropis was 5.17×10-3g/L.SW and other useful secondary metabolites exist in mycelium and fermentation broth of Undifilum oxytropis.

Key words:Undifilum oxytropis; swainsonine; secondary metabolite; fungal endophyte; locoweed