鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性及作用機(jī)制研究

洪　軍，胡建業(yè)，韓　莎，張　俠，孔　麗，白玉珍，王　陶

(河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山 467036)

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鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性及作用機(jī)制研究

洪軍*，胡建業(yè)，韓莎，張俠，孔麗，白玉珍，王陶

(河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山 467036)

摘要：為探討鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑殺作用，采用最小抑菌濃度、AB染料、掃描電鏡、流式細(xì)胞儀和瓊脂糖凝膠電泳等方法研究鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的抗菌活性、殺菌率、胞內(nèi)紫外物質(zhì)泄露、膜負(fù)電荷數(shù)、外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)基因組DNA的影響。結(jié)果表明，鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的抗菌活性較其他細(xì)菌弱；2倍最低殺菌濃度(MBC)鱟素能在短時(shí)間內(nèi)迅速殺死嗜水氣單胞菌并導(dǎo)致胞內(nèi)生物大分子泄漏；掃描電鏡發(fā)現(xiàn)1倍MBC鱟素能導(dǎo)致輕微的壁膜破損及一些胞內(nèi)物質(zhì)滲出和粘連；流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，1倍MBC鱟素能破壞細(xì)胞膜的完整性；AB染料測(cè)定表明鱟素處理后能改變膜負(fù)電荷數(shù)；瓊脂糖凝膠電泳表明，鱟素能夠與嗜水氣單胞菌的基因組DNA發(fā)生作用，并呈濃度依賴關(guān)系，濃度越高對(duì)細(xì)菌基因組DNA損傷越大。鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌活性弱，只有高濃度時(shí)才能短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)泄露、膜負(fù)電荷數(shù)發(fā)生改變及基因組DNA損傷。關(guān)鍵詞：鱟素；嗜水氣單胞菌；生物學(xué)活性；抗菌機(jī)制

鱟素(tachyplesin I)是從中國鱟血細(xì)胞的酸性提取物中分離出來的一種具有典型環(huán)狀β-折疊結(jié)構(gòu)的陽離子抗菌肽[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鱟素具有廣譜抗菌活性，可抑殺細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲和藻類，還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的作用。目前已證實(shí)鱟素具有多個(gè)作用靶點(diǎn)，如細(xì)胞壁膜、脂多糖、胞內(nèi)二級(jí)作用靶點(diǎn)，并通過協(xié)同機(jī)制發(fā)揮作用[2-4]。作為最具潛力的抗生素的替代品之一，鱟素已作為抗菌藥物、飼料添加劑等應(yīng)用于醫(yī)藥和養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域[5-6]。

嗜水氣單胞菌是一種常見的魚類致病菌，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害很大，也是典型的人-獸-魚共患病病原菌。目前對(duì)該菌的控制主要依賴抗生素、化學(xué)藥物以及疫苗。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌藥物的長期使用或?yàn)E用所引起的病原菌耐藥性問題嚴(yán)重，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。喹諾酮類藥物作為一種廣譜高效的抗菌藥物，目前已廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物的疾病治療[7]。但是在治療魚病中發(fā)現(xiàn)喹諾酮類藥物的用量呈逐年增長的趨勢(shì)。針對(duì)抗生素藥物施用后會(huì)產(chǎn)生藥物殘留的問題[8]，國內(nèi)外對(duì)抗菌肽的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)[9-10]。因鱟素分子量小，不易產(chǎn)生藥物殘留，是一種綠色環(huán)保型抗菌藥物，鱟素能否抑制或殺滅嗜水氣單胞菌用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本研究擬通過鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的抑殺作用研究，旨在為該菌引起的暴發(fā)性出血性魚病的防控提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌種嗜水氣單胞菌XS91-4-1為中國科學(xué)院水生生物研究所李愛華研究員分離保藏菌株；銅綠假單胞菌CCTCC2620購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；嗜水氣單胞菌GIM1.172和大腸埃希菌ATCC25922購于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2藥物鱟素由吉爾生化(上海)有限公司合成，純度為95%以上；鹽酸左氧氟沙星由康普藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3培養(yǎng)基TSA培養(yǎng)基是培養(yǎng)嗜水氣單胞菌的專用培養(yǎng)基，其他菌株用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.4主要試劑DNA提取試劑盒、DL 10 000,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；AB染料,Sigma公司產(chǎn)品；瓊脂糖,北京賽百奧科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1鱟素的抗菌活性測(cè)定采用微量肉湯稀釋法測(cè)定鱟素的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)，此方法參照文獻(xiàn)[4]方法。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定鱟素的MIC，在無菌的96孔平板中制備好菌液與鱟素的混合物后，恒溫?fù)u床培養(yǎng)20 h，用DG5033A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm下對(duì)平板進(jìn)行掃描，鱟素的MIC值確定按照低于50%對(duì)照孔(11孔)生長以上的最小質(zhì)量濃度計(jì)算鱟素的MIC值。從未見渾濁的孔中取3個(gè)對(duì)照，每次20 μL，涂布到LB瓊脂平板上，適宜溫度培養(yǎng)20 h，確定MBC。1.2.2鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的殺菌率測(cè)定取過夜培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌菌液，用新鮮的TSA培養(yǎng)基調(diào)整菌液密度為1×108CFU/mL，鱟素處理后終濃度為160 μg/mL，對(duì)照組用培養(yǎng)基替代。在28 ℃分別培養(yǎng)30、60、90、120 min后，根據(jù)菌液濃度分別稀釋到適宜比例，然后取100 μL稀釋后的菌液涂于固本培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)算存活的菌落數(shù)。細(xì)菌成活率%=(鱟素處理后的存活細(xì)胞數(shù)/未加鱟素的存活細(xì)胞數(shù))×100。

1.2.3鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的紫外吸收泄漏檢測(cè)取過夜培養(yǎng)12 h的嗜水氣單胞菌菌液(約為1×109CFU/mL)，用0.1 mol/L(pH 7.4)磷酸鹽緩沖液稀釋為1×107CFU/mL。用終濃度為160 μg/mL鱟素的菌懸液于28 ℃分別孵育30、60、90、120、150、180 min，相同條件下以未加鱟素的菌懸液為對(duì)照。處理后樣品分別經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液于紫外分光光度計(jì)260 nm波長測(cè)定其吸光值。

1.2.4鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌外部形態(tài)的影響將待測(cè)細(xì)菌接種固體瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，取單個(gè)菌落，用無菌生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整細(xì)菌濃度為1.5×108CFU/mL。取不同梯度濃度的鱟素(0、1 MBC)對(duì)菌液輕輕混均后，置恒溫?fù)u床上(150 r/min)孵育30 min。每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)。取上述處理的菌液，室溫下4 000 r/min離心5 min，收集菌體。然后加入適量0.1 mol/L的PBS緩沖液洗滌菌體兩次，4 000 r/min離心3 min收集菌體，加入1 mL戊二醛(40 mL/L)固定液，混勻菌體，于4 ℃固定過夜。1.2.5鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的膜損傷的影響接種過夜培養(yǎng)細(xì)菌至新鮮培養(yǎng)基,搖床培養(yǎng)1 h ～2 h，當(dāng)OD 600 nm=0.4左右時(shí)，分別加入終濃度為0和80 mg/L鱟素，28℃孵育60 min。離心收集菌體，PBS洗滌兩遍后重懸菌液，加入30 mmol PI/L染色液，冰上孵育10 min，5 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用無菌PBS緩沖溶液洗滌2次去除過量的PI。

每份懸液檢測(cè)1×104～3×104個(gè)細(xì)胞，采用488 nm激光激發(fā)，PI標(biāo)記細(xì)胞在635 nm發(fā)射紅色熒光在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。數(shù)據(jù)采集后用Cell Quest Pro軟件進(jìn)行分析[11]。

1.2.6鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的膜電荷數(shù)檢測(cè)

1.2.6.1AB染料標(biāo)準(zhǔn)線的制作參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行，稱取AB 標(biāo)準(zhǔn)品 4.300 mg，用雙蒸水配成0.250 mg/mL的溶液，并等倍稀釋成0.125、0.063、0.030、0.015、0.008 mg/mL 系列濃度梯度的溶液。在測(cè)定OD 650 nm對(duì)吸光度-濃度(OD-C)作圖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6.2細(xì)菌膜電荷數(shù)檢測(cè)收集培養(yǎng)好的嗜水氣單胞菌，用PBS 緩沖液洗滌細(xì)菌3 次，5 000 r/min離心10 min，再次用PBS懸浮細(xì)菌，使細(xì)菌的濃度為2.7×108CFU/mL。試驗(yàn)設(shè)3 組，分別為終濃度為40 μg/mL 、80 μg/mL 鱟素組和PBS 空白對(duì)照組，同時(shí)以不同濃度的鹽酸左氧氟沙星作陽性對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，28 ℃溫孵30 min，2 000 r/min離心3 min，棄上清，PBS 反復(fù)洗滌3 次，去除殘余藥物，加入PBS制成細(xì)菌懸液 0.5 mL。懸液中分別加入 0.77 mg/mL AB溶液 0.5 mL，混勻，37 ℃溫孵30 min，2 000 r/min離心30 min，在酶標(biāo)儀下檢測(cè)其OD 650 nm值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算出各樣本中殘余AB 濃度，然后根據(jù)公式OD 結(jié)合=OD 初-OD 殘余計(jì)算出與細(xì)菌結(jié)合的AB量。1.2.7鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的基因組DNA的影響細(xì)菌基因組的提取參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行，測(cè)定嗜水氣單胞菌的基因組OD 260 nm/OD 280 nm≥1.90，純度符合試驗(yàn)要求。

基因組DNA和鱟素均溶于0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)緩沖液中，保持恒定濃度的細(xì)菌基因組DNA (25 μg/mL)，與不同終濃度的鱟素(10、20、40、80、160、320 μg/mL)在37℃避光孵育60 min后，進(jìn)行8 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V，電流50 mA，電泳時(shí)間約90 min。

2　結(jié)果

2.1鱟素的抗菌活性測(cè)定

通過微量MH肉湯稀釋法測(cè)定鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌和綠膿桿菌等的MIC和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定的MBC見表1。

由表1可知，鱟素和鹽酸左氧氟沙星對(duì)于不同細(xì)菌的MIC和MBC有一定的差別。與其他革蘭陰性菌(銅綠假單胞菌和大腸埃希菌)相比，鱟素對(duì)于嗜水氣單胞菌GIM1.172的抑菌活性較弱。對(duì)于魚類致病性嗜水氣單胞菌XS91-4-1在40 μg/mL鱟素時(shí)可抑制嗜水氣單胞菌菌體的生長。

后續(xù)試驗(yàn)均采用嗜水氣單胞菌XS91-4-1菌株。

表1　鱟素和鹽酸左氧氟沙星對(duì)嗜水氣單胞菌等菌株的抗菌活性

2.2鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌存活率的影響

鱟素作用嗜水氣單胞菌后，存活率可以從宏觀上反映鱟素的殺菌情況。參考表1的數(shù)據(jù)，本試驗(yàn)以160 μg/mL鱟素處理嗜水氣單胞菌，其存活率情況如圖1。

圖1　160 μg/mL鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌作用

從圖1可知，160 μg/mL鱟素處理嗜水氣單胞菌后，在30 min內(nèi)，菌體生長基本正常，成活率為93.01%，30 min后菌體生長明顯受到抑制，成活率逐漸下降，90 min后成活率為7.0%左右。表明鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的殺菌作用與時(shí)間相關(guān)，在加入鱟素的30 min～90 min之間，是菌體急劇被殺死的時(shí)間段。

2.3鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的紫外吸收泄漏檢測(cè)

依據(jù)鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的殺菌率測(cè)定，以160 μg/mL鱟素處理嗜水氣單胞菌，其胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)泄漏的情況如圖2。

由圖2可知，經(jīng)160 μg/mL的鱟素處理嗜水氣單胞菌后，在0～180 min內(nèi)胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)發(fā)生明顯的泄漏，0～60 min之間，泄漏量大致呈直線上升，在60 min時(shí)泄漏量接近最大值，60 min～90 min內(nèi)泄漏量開始降低，直至此后90 min～120 min內(nèi)泄漏量一直處于平緩的狀態(tài)。未加鱟素的對(duì)照組，幾乎沒有紫外吸收物質(zhì)的泄漏，證明細(xì)胞壁膜完整。從本試驗(yàn)結(jié)果可以觀察到鱟素引起嗜水氣單胞菌胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)泄露的數(shù)量，受作用時(shí)間的影響。鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌作用后，在短時(shí)間內(nèi)能引起胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)泄漏的急劇發(fā)生，隨著時(shí)間的延長泄漏量趨于平穩(wěn)。 此結(jié)果也與殺菌率測(cè)定結(jié)果相一致。

圖2　鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌紫外吸收物質(zhì)泄漏的影響

2.4鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌外部結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步闡明鱟素對(duì)細(xì)菌表面形態(tài)的影響，用80 μg/mL鱟素孵育嗜水氣單胞菌30 min后進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，1MBC濃度鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的細(xì)胞壁膜破壞不明顯，僅個(gè)別的細(xì)菌表面看到有內(nèi)容物滲出(圖3)。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響

PI不能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞膜不完整時(shí)，PI進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)遺傳物DNA和RNA特異性結(jié)合，通常被作為細(xì)胞死亡的熒光染料標(biāo)記。采用488 nm激光激發(fā)，PI標(biāo)記細(xì)胞在635 nm發(fā)射紅色熒光。當(dāng)細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的PI增多，熒光強(qiáng)度就增強(qiáng)，根據(jù)發(fā)出熒光的強(qiáng)弱來判斷其通透性大小。

如圖4所示，80 μg/mL鱟素處理嗜水氣單胞菌 60 min后，PI穿透細(xì)胞膜的百分比為52.7%。此結(jié)果表明鱟素能導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性破壞，有一半的細(xì)胞膜破損。這也與掃描電鏡結(jié)果一致。

2.6鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的膜電荷數(shù)影響

AB染料標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：y=9.372 1x-0.003 2，R2=0.997 2。AB是一種陽離子染料，能與細(xì)胞壁膜上的負(fù)電荷結(jié)合。嗜水氣單胞菌在不同濃度鹽酸左氧氟沙星和鱟素處理后，細(xì)胞膜的電荷數(shù)發(fā)生變化，由圖5所示。在40 μg/mL鱟素處理時(shí)，膜上結(jié)合陽離子比較多，隨著濃度的增高，結(jié)合陽離子濃度減少，可能因?yàn)樵谝欢舛葍?nèi)鱟素陽離子與細(xì)胞膜上陰離子結(jié)合后，通過靜電引力的作用膜上去極化，鱟素進(jìn)入機(jī)體殺死部分細(xì)胞，使膜上負(fù)電荷減少。

A.對(duì)照組(10 000×)；B.處理組(8 000×)

A.對(duì)照組；B.處理組

圖5　鱟素(A)、鹽酸左氧氟沙星(B)對(duì)嗜水氣單胞菌的膜電荷數(shù)影響

而對(duì)于鹽酸左氧氟沙星來說，處理嗜水氣單胞菌后，能結(jié)合到細(xì)胞壁膜上的陽離子物質(zhì)有減少的趨勢(shì)。

2.7鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌基因組DNA的影響

為了觀察鱟素與嗜水氣單胞菌體外基因組DNA的相互作用，結(jié)果見圖6。與泳道1對(duì)照組的DNA遷移率相比，2～7泳道的DNA遷移率逐漸減慢，可見嗜水氣單胞菌基因組DNA的遷移率隨加入鱟素濃度的增大而減小，而10 μg/mL～80 μg/mL濃度的鱟素對(duì)體外嗜水氣單胞菌基因組DNA作用60 min后，對(duì)基因組DNA無明顯阻滯現(xiàn)象，這可能是鱟素的濃度太低，達(dá)不到對(duì)基因組DNA的影響，但當(dāng)鱟素濃度大于等于160 μg/mL時(shí)， 6、7泳道對(duì)基因組DNA條帶有明顯的阻滯現(xiàn)象，基因組DNA滯留到點(diǎn)樣孔，僅有少部分條件出現(xiàn)，濃度越高，現(xiàn)象越明顯。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000;1.對(duì)照組；2～7.10、20、40、80、160、320 μg/mL鱟素

M.DNA Marker DL10 000;1.Control group; 2-7.10,20,40,80,160,320 μg/mL tachyplesin

圖6不同濃度鱟素與基因組DNA作用60 min后的電泳圖

Fig.6The gel electrophoresis of different concentrations of tachyplesin I on genomic DNA for 60 min

3　討論

關(guān)于抗菌肽殺菌機(jī)制的研究報(bào)道較多，但不同抗菌肽的作用機(jī)制差別較大，有些抗菌肽，細(xì)胞膜并不是唯一的作用靶點(diǎn)，還存在胞內(nèi)二級(jí)作用靶點(diǎn)如胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)、DNA、RNA等。目前報(bào)道表明鱟素殺菌也存在胞內(nèi)二級(jí)作用靶點(diǎn)。

本研究中，觀察到鱟素作用嗜水氣單胞菌后能導(dǎo)致菌體的胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)DNA等生物大分子的外泄。這可能是當(dāng)鱟素進(jìn)入菌體內(nèi)，破壞細(xì)胞內(nèi)大分子的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致胞內(nèi)離子的外泄，DNA和RNA等核酸物質(zhì)的泄漏，這一現(xiàn)象也被掃描電鏡和流式細(xì)胞儀的結(jié)果證實(shí)，在以往的文獻(xiàn)報(bào)道中也有關(guān)于鱟素能導(dǎo)致其他細(xì)菌的胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)的泄露。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)鱟素能夠使基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳中遷移率變慢，高濃度時(shí)導(dǎo)致DNA斷裂。這也與較多關(guān)于鱟素的作用機(jī)制報(bào)道一致。關(guān)于鱟素殺菌機(jī)制的研究中，鱟素對(duì)大腸埃希菌主要通過作用于細(xì)胞質(zhì)膜，能使細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)物質(zhì)外泄，高濃度時(shí)能與胞內(nèi)DNA和RNA發(fā)生結(jié)合，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的破壞而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[4,13]。金元寶等[11]表明鱟素能對(duì)普通變形桿菌產(chǎn)生抑殺作用，其抑菌機(jī)制與破壞細(xì)菌壁膜的通透性有關(guān)。這些研究能為鱟素對(duì)細(xì)菌的抑殺作用提供補(bǔ)充說明，也能更全面說明鱟素的廣譜抗菌活性。鱟素作為一種抗菌肽，具有廣譜抗菌活性，且細(xì)菌不易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，通過對(duì)嗜水氣單胞菌研究有助于抗菌肽應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖中。

總之，鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌的作用也主要通過與細(xì)胞膜上負(fù)電荷發(fā)生作用，并能損壞細(xì)胞膜，引起胞內(nèi)物質(zhì)泄露及基因組DNA損傷，但與已報(bào)道的鱟素對(duì)其他細(xì)菌抑殺作用相比，鱟素對(duì)其作用不敏感。通過本研究能為鱟素對(duì)嗜水氣單胞菌感染引起的疾病的預(yù)防和治療提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

[1]Nakamura T,Furunaka H,Miyata T,et al.Tachyplesin,a class of antimicrobial peptide from the hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleustridentatus) isolation and chemical structure[J].J Biol Chem,1988,263(32):16709-16713.

[2]Xie H W,Dai J G,Guo Y,et al.Investigation on multieffect and synergistic antibacterial mechanism of tachyplesin against bacteria [J].Chem Bioengin,2008,25:50-53.

[3]Kushibiki T,Kamiya M,Aizawa T,et al.Interaction between tachyplesin I,an antimicrobial peptide derived from horseshoe crab,and lipopolysaccharide [J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics,2014,1844(3):527-534.

[4]Hong J,Guan W T,Jin G,et al.Mechanism of tachyplesin I injury to bacterial membranes and intracellular enzymes,determined by laser confocal scanning microscopy and flow cytometry[J].Microbiol Res,2015,170:69-77.

[5]Gao Y,Zhao H L,Feng X,et al.Expression of recombinant human lysozyme -tachyplesin I (hLYZ-TP I) in pichia pastoris and analysis of antibacterial activity [J].Biomed Environ Sci,2013,26(4):319-322.

[6]韓東,馮新,韓文瑜,等.基因工程鱟素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用及對(duì)小鼠感染的治療[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33(8):1240-1246.

[7]蘇振霞,肖輝,陳列歡,等.動(dòng)物專用喹諾酮類藥物對(duì)嗜水氣單胞菌體外抑菌作用的研究[J].海洋科學(xué),2011,35(7):37-39.

[8]韓飛,張曼,張周,等.阿維菌素在魚類體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及殘留檢測(cè)概況[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(8):107-111.

[9]張慶華,王青,尚田田,等.新型血紅蛋白抗菌肽抑菌活性及溶血性研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(9):54-57.

[10]Hassan M,Kjos M,Nes I F,et al.Natural antimicrobial peptides from bacteria:characteristics and potential applications to fight against antibiotic resistance [J].J Appl Microbiol,2012,113(4):723-736.

[11]Ananta E,Heinz V,Knorr D.Assessment of high pressure-induced damage onLactobacillusrhamnosusGG by flow cytometry[J].Food Microbiol,2004,21:567-77.

[12]金元寶,王英,劉莉萍,等.鱟素I 對(duì)普通變形桿菌的作用研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2014(5):190-196.

[13]洪軍,胡建業(yè),王福梅,等.鱟源抗菌肽對(duì)大腸桿菌基因組DNA和RNA作用的分子機(jī)制[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2013,15(1):71-75.

動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,37(7):44-48ProgressinVeterinaryMedicine

收稿日期：2015-05-16

基金項(xiàng)目：河南城建學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2012JBS002);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31540060)

作者簡介：洪軍(1977-)，女，河南寧陵人，副教授，博士，主要從事多肽的作用機(jī)理研究。*通訊作者

中圖分類號(hào):S941.42;Q74

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0038-06

Study on Antibacterial Activity and Action Mechanism of Tachyplesin I againstAeromonashydrophila

HONG Jun,HU Jian-ye,HAN Sha,ZHANG Xia,KONG Li,BAI Yu-zhen,WANG Tao

(CollegeofLifeScienceandEngineering,HenanUniversityofUrbanConstruction,Pingdingshan,Henan,467036,China)

Abstract:The antimicrobial role of tachyplesin I on Aeromonas hydrophila was investigated.The effects of tachyplesin on the antimicrobial activity,the sterilization rate,intracellular UV substance leakage,membrane negative charge number,external morphological structure and intracellular genomic DNA of Aeromonas hydrophila were determined by minimum inhibitory concentration,AB dye,scanning electron microscope,flow cytometry and agarose gel electrophoresis methods.Compared with other bacteria,the antimicrobial activity of tachyplesin for Aeromonas hydrophila was relatively weaker.2MBC tachyplesin could killed rapidly Aeromonas hydrophila and lead to large biological molecule leakage in a short period of time.The result of scanning electron microscopy showed that 1MBC tachyplesin could lead to membrane damage slightly and cellular content outflow.Flow cytometry results showed that 1 MBC tachyplesin can damage the integrity of cell membrane.Tachyplesin could change the membrane negative charge number through AB dye determination.Tachyplesin had effect on the genomic DNA of Aeromonas hydrophila in a concentration-dependent manner by agarose gel electrophoresis determination.Tachyplesin had weak antibacterial activity on Aeromonas hydrophila,and only high concentrations can make membrane negative charge number change,intracellular UV substance leakage and genomic DNA damage in a short time.

Key words:Tachyplesin I; Aeromonas hydrophila; biological activity; antibacterial mechanism