綿羊腦炎單增李斯特菌生物膜形成及相關基因的檢測

鄔　琴，閆圓圓，王　振，梁淋淵，鄭婷婷，孔科委，王熙楚，周　霞

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000)

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綿羊腦炎單增李斯特菌生物膜形成及相關基因的檢測

鄔琴，閆圓圓，王振，梁淋淵，鄭婷婷，孔科委，王熙楚，周霞*

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000)

摘要：為了檢測綿羊腦炎李斯特菌生物膜形成情況并確定生物膜形成相關基因在該菌中的分布情況，采用結晶紫染色結合測定OD值的方法觀察羊腦炎李斯特菌生物膜在不同時間段形成情況,并應用分子生物學方法檢測生物膜形成相關基因(flaA、recA、relA、prfA、yneA、agrA、luxS、degU、motB、sigB、hpt)在該菌中的分布情況。結果表明，在37 ℃，綿羊腦炎李斯特菌生物膜在2 h～8 h的OD值與0 h和對照組對比差異顯著(P<0.05)， 9 h～48 h OD值呈平穩(wěn)趨勢，與對照組比較差異顯著(P<0.05)。2 h開始生物膜初具形態(tài)，呈現(xiàn)散落的網(wǎng)格結構，2 h～6 h矩陣網(wǎng)格結構明顯，6 h～8 h形成高度有序的網(wǎng)格結構，9 h～48 h依然具備生物膜網(wǎng)狀結構特征，但個別網(wǎng)狀結構脫落。11種生物膜相關基因在綿羊腦炎李斯特菌中的檢測結果為陽性，測序結果與GenBank公布的相應序列同源性為87.22%～99.29%。結果表明2 h～6 h生物膜進入黏附期和生長期，6 h～8 h進入成熟穩(wěn)定階段，9 h～48 h逐漸進入播散期；LM90攜帶11種與生物膜形成相關的基因。

關鍵詞：綿羊腦炎李斯特菌；生物膜；膜相關基因

李斯特菌病(Listeriosis)是由單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)引起的一種具有重要公共衛(wèi)生意義的動物源性和食源性人畜共患病，該病發(fā)病率低,但病死率高。在獸醫(yī)臨床中可引起綿羊的“轉圈病”。細菌生物膜(bacterial biofilm,BBF)是指細菌為了適應生存環(huán)境，包裹于細胞外多聚物基質中的黏附于非生物或生物表面的微生物群落[1-2]。胞外多糖是細菌生物膜的主要組成部分和結構支架，可為細菌生長提供營養(yǎng)，并對細菌的黏附、聚集、成膜等發(fā)揮重要作用，亦可增強細菌對宿主免疫系統(tǒng)和外界環(huán)境的抵抗力[3-4]。近年來，隨著對細菌耐藥機制的研究，發(fā)現(xiàn)微生物生物膜與細菌的耐藥性密切相關。以生物膜形式存在的細菌，對抗生素的抗性會提高10倍～1 000倍，是造成當前細菌感染加重的主要原因之一[5-6]。研究表明不同來源單增李斯特菌也能不同程度形成生物膜，且與該細菌的生存能力、致病性密切相關。根據(jù)國內外的研究，在細菌引發(fā)感染過程中有眾多的基因參與生物膜的形成，起始黏附階段和生物膜成熟形成階段的生物膜形成量均受到特定的相關基因轉錄和表達的控制，其中主要有flaA、recA、relA、prfA、yneA、agrA、luxS、degU、motB、sigB及hpt[7]。然而不同來源菌株攜帶相關基因情況也不同。

本研究以從發(fā)生腦炎綿羊大腦中分離得到的單核細胞增生李斯特菌90(LM90)為研究對象，采用結晶紫染色法定量和定性檢測分離株生物膜形成特點，其次應用分子生物學方法檢測生物膜形成相關基因在LM90中的分布情況，分析醫(yī)學臨床和獸醫(yī)臨床LM分離株相應基因片段的同源性，為動物來源單核細胞增生李斯特菌生物膜形成及致病性研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株單核細胞增生李斯特菌LM90菌株為石河子大學動物科技學院預防獸醫(yī)學實驗室從發(fā)生“轉圈病”綿羊大腦分離鑒定并保存。

1.1.2主要儀器和試劑超凈工作臺，上海博訊實業(yè)公司產(chǎn)品；酶標儀，美國BioTek公司產(chǎn)品；PCR儀，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，上海光學儀器公司產(chǎn)品；96孔細胞培養(yǎng)板、BHI培養(yǎng)基、結晶紫及2×TaqPCR Master Mix等相關試劑均，廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1LM90生物被膜的制備采用96孔板進行細菌培養(yǎng)，試驗組取20 μL菌液加入180 μL BHI培養(yǎng)基中，對照組加200 μL的BHI培養(yǎng)基，在37 ℃溫箱中分別培養(yǎng)2、4、6、8、9、12、24、36、48 h。1.2.2生物被膜及吸光值的測定在不同培養(yǎng)時段，棄去培養(yǎng)基并用PBS沖洗，60℃的烘箱中烘干1 h后每個孔加入50 μL結晶紫染色15 min，洗滌后加入200 μL的乙醇-丙酮脫色，測595 nm處的OD值，3個平行樣，記錄平均值，并進行單因素方差分析。1.2.3生物被膜形態(tài)結構觀察在不同時間段培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗后溫箱中烘干，用10 g/L的結晶紫染色15 min后，沖洗后烘干并在倒置顯微鏡觀察LM90在2、4、6、8、9、12、24、36、48 h內生物膜結構并采集圖像。

1.2.4LM90生物被膜形成相關基因的檢測及分析11種基因(flaA、recA、relA、prfA、yneA、agrA、luxS、degU、motB、sigB和hpt)引物參照文獻[7]由北京華諾科技有限公司合成。PCR反應程序：預變性94℃ 5 min；94℃ 1 min，復性溫度根據(jù)引物的Tm值確定，1 min，延伸72℃時間根據(jù)條帶大小確定(30 s～80 s)，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收電泳產(chǎn)物并送北京華諾科技公司測序，結果用DNA Star 14.0軟件分析。

2　結果

2.1LM90在不同時間段形成生物被膜OD值測定結果

試驗組0 h～8 h的OD值逐漸升高,與0 h和對照組比較，差異顯著(P<0.05)；9 h～48 h的OD值不再大幅度增加，之后呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，與對照組比較，差異顯著(P<0.05)(圖1)。

圖1　LM90在不同培養(yǎng)時間內生物被膜形成情況

2.2LM90形成生物被膜形態(tài)的顯微鏡觀察結果

2 h開始LM90生物膜初具形態(tài)，可見菌體呈現(xiàn)散落的網(wǎng)格結構，有繼續(xù)生長成網(wǎng)格狀的趨勢(圖2A)；4 h可見大量的菌體附著在表面，并且菌體呈現(xiàn)連續(xù)的網(wǎng)狀結構，網(wǎng)格結構更加明顯(圖2B)；6 h見更為清晰的矩陣網(wǎng)格結構(圖2C)，8 h可見高度有序的矩陣網(wǎng)格結構(圖2D)；9 h～48 h可見零星散落的網(wǎng)狀結構,個別地方脫落，但依然具備生物膜網(wǎng)狀結構特征(圖2E、圖2F、圖2G、圖2H)。這些結果表明，生物膜在2 h就開始初步形成，此時處于浮游狀態(tài)細菌初始黏附期，2 h～6 h黏附細菌逐漸增厚堆積進入黏附期和生長期，逐漸生成較為封閉的矩陣網(wǎng)格結構，6 h～8 h生物膜基本處于成熟穩(wěn)定期，生成較為完整的三維網(wǎng)格結構，9 h～48 h生物膜的完整性大大降低，此時細菌從生物膜或載體表面釋放散播，生物膜處于播散期。

A.2 h；B.4 h；C.6 h；D.8 h；E.9 h；F.12 h；G.24 h；H.36 h；I.48 h

2.3生物膜形成相關基因檢測結果

擴增LM90 11個基因flaA(864 bp)、recA(1 047 bp)、relA(2 217 bp)、prfA(1 077 bp)、yneA(330 bp)、agrA(729 bp)、luxS(468 bp)、degU(687 bp)、motB(828 bp)、sigB(780 bp)、hpt(1 386 bp),結果均擴增到了相應的基因片段(圖3)。

2.411個基因序列測定及同源性分析結果

LM90生物膜形成相關的11種基因擴增片段

進行測序和分析，與GenBank公布的分離株Listeriamonocytogenesserotype 4b str.LL195等菌株的相應序列之間的同源性在87.22%～99.29%。部分結果見圖4。

M．DNA標準 DL 2 000； 1～5.motB、sigB、prfA、degU、yneX; 6～11.luxS、flaA、relA、recA、hpt、agrA為基因PCR擴增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000；1-5.PCR products of motB，sigB，prfA，degU，yneX genes; 6-11.PCR products of luxS，flaA，relA，recA，hpt genes

圖3LM90 11種基因PCR擴增結果

Fig.3PCR amplified rusults of 11 genes from LM90

HF558398.1、FR733646.1、FR733645.1和FR73362.2為GenBank公布的不同來源LM luxS和sigB基因的相應序列

3　討論

李斯特菌為短小的革蘭陽性無芽胞兼性厭氧桿菌，近十幾年,國內外李斯特菌病呈流行趨勢,它是一種具重要公共衛(wèi)生意義的動物源性和食源性人畜共患病，危害很大[8]。近年來，隨著對細菌感染所致的一些慢性和頑固性疾病的深入研究,發(fā)現(xiàn)生物膜是導致這些細菌性疾病久治不愈和反復發(fā)作的主要原因。細菌形成生物膜后,具生物膜細胞間有著嚴密的化學信號傳導交流信息，有著致密的三維立體空間結構，能逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，并對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[9-11]。生物膜形成的過程可分為幾個關鍵階段，浮游狀態(tài)細菌的可逆黏附期，細菌生長繁殖逐漸增厚堆積的不可逆生長期；在經(jīng)歷不可逆黏附階段后進入成熟期，最終從生物膜或載體表面釋放出來播散并定植到新的其他表面物質的播散期[7]。本研究采用結晶紫染色法結合倒置顯微鏡對生物膜的結構特點進行觀察，結果表明，在2 h浮游的細菌生長繁殖并開始黏附聚集在載體表面，這一過程為細菌起始黏附階段；2 h～6 h細菌在營養(yǎng)充足的條件下OD值逐漸增加意味著細菌大量生長繁殖，黏附細菌逐漸增厚堆積在載體表面，逐漸生成較為封閉的矩陣網(wǎng)狀結構，隨著時間的推移逐漸進入黏附期和生長期；6 h～8 h細菌形成高度有組織的網(wǎng)格結構,此時生物膜基本處于成熟穩(wěn)定階段；9 h～48 h生物膜的完整性下降，而且此時的OD值不再大幅度增加，呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，9 h后成熟生物膜通過蔓延、部分脫落等方式進行擴展,從生物膜中脫落或釋放出來的細菌又可在物體表面形成新的生物膜，該過程有利于生物膜的繁殖及群落的自我重建。然而在固定培養(yǎng)基中因為營養(yǎng)物質被大量消耗，很難再形成較為完整的生物膜結構，所以OD值呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢,處于生物膜的播散期。本研究結果也顯示細菌生物膜結構隨著時間的推移逐漸形成高度有組織網(wǎng)狀的結構，最后趨于穩(wěn)定狀態(tài)，這與李燕杰等[7,12]研究結果類似。國外研究報道，在生物膜形成階段中，參與生物膜早期形成、晚期成熟與播散階段的基因主要包括flaA、motB、sigB、degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA、relA、hpt及prfA 等基因[7]。本研究結果表明，與李斯特菌生物膜形成相關的11個基因flaA、recA、relA、prfA、yneA、agrA、luxS、degU、motB、sigB及hpt,皆存在于綿羊腦炎李斯特菌LM90中，但這些基因在LM90生物膜形成中的詳細作用還需進一步研究。

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收稿日期：2016-01-02

基金項目：石河子大學“大學生研究訓練計劃”(SRP2015215)；國家自然科學基金項目(31160507)

作者簡介：鄔琴(1993-)，女，新疆富蘊人，本科生在讀，動物醫(yī)學專業(yè)。*通訊作者

中圖分類號:S852.615

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0013-04

Detection on Biofilm Formation and Biofilm-associated Genes ofListeriamonocytogenesInducting Encephalitis in Sheep

WU Qin,YAN Yuan-yuan,WANG Zhen，LIANG Lin-yuan,ZHENG Ting-ting,KONG Ke-wei,WANG Xi-chu,ZHOU Xia

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi，Xinjiang， 832000,China)

Abstract:In orderto detect the biofilm formation and distribution of biofilm-associated genes of Listeria monocytogenes inducting encephalitis in sheep,the methods of crystal violet staining and OD value determination were used to observe the biofilm formation in different period of time and detect distribution of biofilm-associated genes(flaA，recA，relA，prfA，yneA，agrA，luxS，degU，motB，sigB，hpt) by molecular biological ways.The results showed that at 37 ℃,compared with the control group and 0 h,the biofilm OD in 2 h-8 h is significantly different (P<0.05),meanwhile,OD values in 9 h-48 h showing a stable trend is also significantly different(P<0.05).The biofilm began to be formed,showing lattice structure in the first 2 h,being more obvious for 2 h-6 h,forming highly ordered lattice structure for 6 h-8 h,maintaining the lattice structure characteristics while the individual mesh structure fell off during 9 h-48 h.11 biofilm-associated genes were positive in the detection，both sequence in this test and the homology published in Genbank are 87.22%-99.29%.The results showed that in 2 h-6 h the biofilm started the first step of attachment and development,in 6 h-8 h being the second one of maturation,and in 9 h-48 h being the next step of detachment,where LM90 carried 11 biofilm-associated genes.

Key words:Listeria monocytogenes inducting encephalitis in sheep; biofilm; biofilm-associated gene