2012年-2014年閩西地區(qū)PRRSV流行株ORF5基因遺傳變異分析

黃春芳，劉建奎，龔麗珍，楊炳輝，曾建平，陳安妮，陳小燕

(福建省龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364000)

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2012年-2014年閩西地區(qū)PRRSV流行株ORF5基因遺傳變異分析

黃春芳，劉建奎*，龔麗珍，楊炳輝，曾建平，陳安妮，陳小燕

(福建省龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364000)

摘要：為了研究2012年-2014年閩西地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物學(xué)特性和變異規(guī)律，對(duì)分離自閩西多個(gè)地區(qū)25份疑似PRRS病料的10個(gè)PRRSV分離株，應(yīng)用RT-PCR對(duì)其中ORF5基因進(jìn)行擴(kuò)增及序列分析，從而了解閩西地區(qū)PRRSV的遺傳變異性。結(jié)果表明，10個(gè)毒株均為美洲型PRRSV，9株P(guān)RRSV ORF5基因全長(zhǎng)為603 bp(FJ05為600 bp)，10個(gè)毒株ORF5基因之間的核苷酸同源性為88.4%～99.3%；與VR-2332、MLV和CH-1a毒株的核苷酸同源性為88.3%～98.8%，與我國(guó)高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性為88.9%～99.0%，與歐洲型毒株代表毒株LV的同源性為63.8%～65.0%。ORF5基因推導(dǎo)氨基酸序列變異主要發(fā)生在9-40位和58-62位，10株P(guān)RRSV ORF5氨基酸同源性為88.5%～99.5%；與VR-2332、MLV和CH-1a的氨基酸同源性為87.5%～98.5%，與我國(guó)高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性為88.0%～ 99.5%，與歐洲型毒株代表毒株LV的同源性為56.6%～59.2%。遺傳進(jìn)化樹(shù)表明，閩西地區(qū)PRRSV可以分為疫苗株(1株，10%)、中等毒力PRRSV(1株，10%)和HP-PRRSV(8株，80%)3個(gè)亞群，其中以HP-PRRSV為主，表明閩西地區(qū)PRRSV流行毒株呈現(xiàn)遺傳變異多樣性。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；ORF5基因； 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；遺傳變異

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)引起的一種高度傳染性疾病，該病于1987年在美國(guó)首次暴發(fā),其特點(diǎn)是發(fā)病豬群具有繁殖障礙和呼吸道癥狀[1-3]。我國(guó)于1996年首次分離到PRRSV，從而證實(shí)了PRRS在中國(guó)存在。2006年在中國(guó)南方暴發(fā)的“豬高熱病”，其主要病原就是PRRSV變異株(HP-PRRSV)，給中國(guó)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，PRRS已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，呈世界性分布[4]。

PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，大小約15 kb，有10個(gè)開(kāi)放閱讀框 (ORF1a、1b、2a、2b、3、4、5、5a、6和7) ，ORF1(ORF1a 和ORF1b)，約占病毒基因組的80%，編碼PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2～5、ORF5a和ORF6～ORF7基因編碼PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白GP2～GP5、ORF5a、M 及N[5-6]。研究表明，現(xiàn)有的疫苗尚不能完全有效地預(yù)防所有或大部分PRRSV流行毒株，這與病毒的高變異性、豬個(gè)體免疫反應(yīng)的差異性等多方面因素有關(guān)。ORF5編碼的是囊膜糖蛋白GP5，是PRRSV主要的免疫原性蛋白，是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，也是PRRSV結(jié)構(gòu)基因中變異最大的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。GP5蛋白具有較好的免疫原性，激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫[7-9]。因此，GP5蛋白在PRRSV的致病性、預(yù)防與控制等方面具有重要意義，針對(duì)其研究可為PRRS的防控提供理論基礎(chǔ)。

研究表明，ORF5基因極易發(fā)生變異，不同國(guó)家和地區(qū)PRRSV的ORF5基因同源性差異較大。由于 PRRSV毒株間存在一定的抗原差異性，從而使PRRSV疫苗在不同型之間的保護(hù)力很不理想，這也是目前PRRSV疫苗研發(fā)的一個(gè)難點(diǎn)[10]。龍巖市位于福建省西部，是福建省生豬主要生產(chǎn)區(qū)，年出欄生豬數(shù)量占全省第一。由于近年來(lái)PRRS給閩西地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，因此本文研究閩西地區(qū)PRRSV ORF5基因克隆及序列分析，遺傳變異特征和生物學(xué)特性，為今后該地區(qū)預(yù)防和控制PRRS提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來(lái)源及細(xì)胞2012年-2014年在閩西地區(qū)新羅區(qū)、永定縣、武平縣和連城縣等縣(區(qū))無(wú)菌采集25份疑似PRRSV感染的豬肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結(jié)等組織樣品。Marc-145細(xì)胞由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3PCR 引物參照文獻(xiàn)[9]針對(duì)PRRSV ORF5兩側(cè)保守序列設(shè)計(jì)引物P1:5′-CTGAGACCATGAGG-TGGGCAACT-3′; P2 :5′-CATCACTGGCGTGTAGGTAATAGAAAAC-3′，擴(kuò)增片段大小為750 bp。

1.2方法

1.2.1病毒分離鑒定將無(wú)菌采集的豬肺臟、腎臟、脾臟和淋巴結(jié)2 g～3 g以1∶5的比例加入無(wú)血清的DMEM研磨，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌，接種于已經(jīng)長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞，37 ℃ 吸附1 h，棄去接種液，PBS洗3次，加入DMEM維持液，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d～5 d，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)出現(xiàn)80%左右時(shí)收毒，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2RT-PCR擴(kuò)增利用RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，按照Takara試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

應(yīng)用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PRRSV ORF5擴(kuò)增體系為25 μL：10×PCR buffer (Mg2+)2.5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL，上、下游引物 (20 mmol/L) 各0.5 μL，cDNA 2 μL，ExTaqDNA聚合酶0.25 μL，用滅菌去離子水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3目的基因的序列分析將回收純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。提取轉(zhuǎn)化后的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并將鑒定均為陽(yáng)性的重組菌株送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Mega 6.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2　結(jié)果

2.1病毒的分離培養(yǎng)

將處理的病料接種于生長(zhǎng)良好的Marc-145細(xì)胞，4 d～5 d出現(xiàn)典型的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞聚集成叢，變圓、脫落，共分離到10株P(guān)RRSV，病毒分離率為40%。

2.2PCR結(jié)果

10個(gè)PRRSV毒株經(jīng)PT-PCR擴(kuò)增后，通過(guò)凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增片段約在750 bp處，與預(yù)期大小相符(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～10.FJ01～FJ10；11.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-10.FJ01-FJ10；11.Negative control

圖1PRRSV ORF5基因片段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCR results of ORF5 gene of PRRSV by RT-PCR

2.3目的基因的序列測(cè)定與分析

2.3.1核苷酸的同源性分析將獲得的10個(gè)PRRSV分離株的ORF5基因與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的ORF5核苷酸序列進(jìn)行比較，其中VR-2332為美洲型標(biāo)準(zhǔn)株，RespPRRS MLV為疫苗株，LV為歐洲型PRRSV，CH-1a、HB-1(sh)2002、HB-2(sh)2002、JXA1、WUH1、HUB1和HUN4等均為國(guó)內(nèi)代表株。核苷酸序列比較結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，所分離的10個(gè)毒株ORF5基因之間的核苷酸同源性為88.4%～99.3%，與美洲標(biāo)準(zhǔn)株VR-2332和MLV的核苷酸堿基同源性為88.3%～98.8%，與中國(guó)經(jīng)典毒株CH-1a的同源性為91.9%～94.7%，與我國(guó)高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性為88.9%～99.0%，與歐洲型毒株代表毒株LV的同源性為63.8%～65.0%。

2.3.2氨基酸同源性分析9個(gè)PRRSV分離株的ORF5基因全長(zhǎng)為603 bp，編碼200個(gè)氨基酸，F(xiàn)J05 ORF5基因全長(zhǎng)為600 bp，編碼199個(gè)氨基酸，將10個(gè)PRRSV分離株的ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外已知的ORF5氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，10個(gè)毒株ORF5基因之間的氨基酸同源性為88.5%～99.5%，與美洲標(biāo)準(zhǔn)株VR-2332和MLV的氨基酸同源性為87.5%～98.5%，與中國(guó)經(jīng)典毒株CH-1a的同源性為91%～93.0%，與我國(guó)高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性為88.0%～99.5%，與歐洲型毒株代表毒株LV的同源性為56.6%～59.2%。

圖3　10株分離毒株與國(guó)內(nèi)外分離毒株ORF5推導(dǎo)氨基酸序列的同源性比較

2.4ORF5基因推導(dǎo)氨基酸的變異分析

用DNA Star軟件對(duì)10個(gè)PRRSV毒株ORF5基因的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，10個(gè)PRRSV分離株ORF5基因推導(dǎo)氨基酸序列的變異主要發(fā)生在9-40 位和58-62位，其他位點(diǎn)相對(duì)比較保守，僅有個(gè)別氨基酸替換。在GP5 N端30-51 aa有4個(gè)～6個(gè)N糖基化位點(diǎn)，分別位于30、33、34、35、41和51，在閩西地區(qū)分離的10個(gè)PRRSV毒株中30、33、41、51位N糖基化位點(diǎn)均未發(fā)生改變。Ostrowski M等[11]和Wang X等[12]研究表明，37SHF/LQLIYNL45是中和表位，9個(gè)分離毒株存在F/L39→I39的突變。R13、R151位點(diǎn)與病毒毒力密切相關(guān),10株P(guān)RRSV中FJ01在R13的位點(diǎn)發(fā)生了變異從由R變成了G[13]。FJ03在R151位點(diǎn)發(fā)生了變異，與HB-1sh/2002發(fā)生了相同的變異由R變成了K，F(xiàn)J01在R151位點(diǎn)也發(fā)生了變異，與RespPRRS MLV發(fā)生了相同的變異由R變成了G。疫苗株(MLV)的137 aa為A、野毒株137 aa[12]，表明FJ01可能為疫苗株，其余9株是野毒株。

2.5遺傳進(jìn)化樹(shù)

為了進(jìn)一步分析閩西地區(qū)流行毒株與其他毒株在遺傳進(jìn)化上的關(guān)系，將這10個(gè)PRRSV毒株與國(guó)外已發(fā)表的毒株VR-2332、RespPRRS MLV以及國(guó)內(nèi)CH-1a、HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002、JXA1、WUH1、HUB1、HUN4和JXwn06等代表毒株構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，由圖5可知，10個(gè)毒株與VR-2332為代表的美洲毒株群處于同一個(gè)大分支，親緣關(guān)系較近，與LV為代表的歐洲型毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，由此可知本研究的10個(gè)PRRSV均為美洲毒株。10個(gè)美洲毒株群分為3個(gè)亞群，以FJ-02為代表的8個(gè)分離株與HP-PRRSV代表毒株(JXA1、WuH1、HuN4等)位于同一大分支中，親緣關(guān)系較近，表明這8株P(guān)RRSV為HP-PRRSV。FJ-01分離株與VR-2332、RespPRRS MLV的親緣關(guān)系較近，處于同一亞群，可能為疫苗株。FJ-03與HB-1sh/2002位于一分支中，親緣關(guān)系較近。

圖4　ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列變異分析

圖5　PRRSV ORF5氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)

3　討論

研究表明，在免疫壓力和環(huán)境作用下，PRRSV ORF5基因極易發(fā)生變異，導(dǎo)致不同國(guó)家和地區(qū)PRRSV ORF5基因抗原差異較大。囊膜糖蛋白GP5由ORF5基因編碼，是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在病毒感染動(dòng)物機(jī)體方面具有非常重要的作用[13]。

本研究的10個(gè)PRRSV ORF5之間的核苷酸同源性為88.4%～99.3%，與美洲標(biāo)準(zhǔn)株VR-2332和MLV的核苷酸堿基同源性為88.3%～98.8%，與中國(guó)經(jīng)典毒株CH-1a的同源性為91.9%～94.7%，與我國(guó)高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性為88.9%～99.0%，與歐洲型毒株代表毒株LV的同源性為63.8～65.0%。10個(gè)毒株之間的氨基酸同源性為88.5%～99.5%，與美洲標(biāo)準(zhǔn)株VR-2332和MLV的氨基酸同源性為87.5%～98.5%，與中國(guó)經(jīng)典毒株CH-1a的同源性為91%～93.0%，與我國(guó)高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性為88.0%～99.5%，與歐洲型毒株代表毒株LV的同源性為56.6～59.2%。從中可知在閩西地區(qū)流行的是美洲型毒株。從氨基酸的同源性比較中還可以得出10個(gè)毒株中只有FJ01 1株與疫苗株(MLV)的同源性較高，且在遺傳進(jìn)化樹(shù)中處于同一亞群，疫苗株(MLV)的137 aa為A、野毒株137 aa主要是S，在氨基酸變異中只有FJ01毒株的137 aa為A，表明FJ01可能為疫苗株，其余9株137 aa是S，表明其是野毒株。另外，從遺傳進(jìn)化樹(shù)中可以看出毒株FJ03與HB-1sh/2002親緣關(guān)系較近，處于同一分支，HB-1sh/2002毒力比中國(guó)經(jīng)典毒株CH-1a高，但比以JXA1為代表的高致病性毒株的毒力弱[14-15]，推測(cè)FJ03可能是經(jīng)典毒株向高致病性毒株進(jìn)化的中等毒力毒株，其余8株P(guān)RRSV與JXA1為代表的高致病性毒株處于同一分支，表明閩西地區(qū)PRRSV以HP-PRRSV為主，因此豬場(chǎng)可以選擇HP-PRRSV疫苗進(jìn)行免疫，以減少經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)閩西地區(qū)PRRSV分離株的遺傳關(guān)系存在交叉，但沒(méi)有明顯的地域特征，可能與帶毒豬或種豬的流動(dòng)傳播有關(guān)，因此豬場(chǎng)在引進(jìn)種豬時(shí)應(yīng)采取嚴(yán)格的檢疫及生物安全措施。

美洲型PRRSV GP5蛋白中存在一個(gè)中和抗原表位(37-45 aa)和2個(gè)非中和抗原表位(27-30 aa、180-197 aa)[10-11]。本研究中的10株P(guān)RRSV與JXA1、HUN4等HP-PRRSV的GP5蛋白相比，在這些中和抗原表位和非中和抗原表位均發(fā)生了點(diǎn)突變，這些氨基酸的突變可能會(huì)使PRRSV產(chǎn)生免疫逃避，從而導(dǎo)致免疫失敗。在GP5 N端30-51 aa有4個(gè)～6個(gè)N糖基化位點(diǎn)，研究表明，GP5糖基化會(huì)影響中和抗體的產(chǎn)生[11]。通過(guò)對(duì)閩西地區(qū)PRRSV GP5蛋白氨基酸進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析，結(jié)果表明閩西地區(qū)分離的10株P(guān)RRSV中存在4個(gè)～6個(gè)N糖基化糖基化位點(diǎn)，即N30、N33、N34、N35、N41和N51。這些糖基化位點(diǎn)位于中和抗原表位附近，糖基化位點(diǎn)遮蓋中和抗原表位，從而導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法及時(shí)產(chǎn)生中和抗體。另外，閩西地區(qū)PRRSV GP5存在N糖基化糖基化位點(diǎn)增多的現(xiàn)象，這可能會(huì)導(dǎo)致PRRSV毒力增強(qiáng)。研究表明，GP5蛋白與PRRSV的感染密切相關(guān)，PRRSV的感染能力及誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生受糖基化修飾的影響，閩西地區(qū)PRRSV存在N糖基化糖基化位點(diǎn)增多的現(xiàn)象，這是否會(huì)導(dǎo)致PRRSV毒力增強(qiáng)需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，閩西地區(qū)主要流行的是高致病性PRRSV(8/10)，同時(shí)也存在中等毒力毒株(1/10)與疫苗株(1/10)，這給豬場(chǎng)防控PRRS帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。由于PRRS疫苗的有效性在很大程度上取決于野毒株與疫苗株是否具有抗原交叉性，為有效地控制PRRS，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病的分子流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測(cè)及病原變異規(guī)律的研究工作，為我國(guó)研發(fā)更具針對(duì)性、安全、高效的疫苗提供科學(xué)依據(jù)。

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收稿日期：2015-12-09

基金項(xiàng)目：福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃訓(xùn)練項(xiàng)目(201511312057)；省屬高?？蒲姓n題 (JK2015049)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016J01168)；福建省科技重大專項(xiàng)(2014NZ0002-3)

作者簡(jiǎn)介：黃春芳(1994-)，男，福建泉州人，學(xué)士，主要從事分子病原學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類號(hào):S852.659.6；Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0007-06

Genetic Variation of ORF5 Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Isolates from Western Fujian in 2012-2014

HUANG Chun-fang,LIU Jian-kui,GONG Li-zhen,YANG Bin-hui,ZENG Jian-ping,CHEN An-ni,CHEN Xiao-yan

(FujianProvincialKeyLaboratoryforthePreventionandControlofAnimalInfectiousDiseasesandBiotechnology,FujianEngineeringResearchCenterforSwineDiseaseControlandPrevention,CollegeofLifeSciences，LongyanUniversity,Longyan,Fujian,364000,China)

Abstract:The result showed that 10 PRRSV isolates belonged to the North American genotype, the lengths of the nine ORF5 sequences were 603 nucleotides (FJ05 is 600 nucleotides). Ten isolates displayed a nucleotide identity ranging from 88.4% to 99.3% among themselves, they shared 88.3%-98.8% homology with VR2332, MLV and CH-1a; 88.9%-99.0% with JXA1, WUH1 and HUN4, and they shared only 63.8-65.0% with LV. High variable occurred at positions of 9-40 aa and 58-62 aa of GP5. Amino acid sequence alignments revealed that 10 isolates shared 88.5%-99.5% among themselves, they shared 87.5%-98.5% homology with VR-2332, MLV and CH-1a, 88.0%-99.5% with JXA1, WUH1 and HUN4, however, they shared only 56.6-59.2% with LV. The phylogenetic tree analysis showed that 10 isolates are divided into three subgroups, 8 strains (8/10, 80%) belonged to subgroup Ⅰ, which are closely related to the JXA1 strain. The FJ01 strain (1/10, 10%) belonged to subgroup Ⅱ, which is closely related to the VR-2332, FJ03 strain (1/10, 10%) belong to subgroup Ⅲ, which is closely related to the HB-1sh/2002 (the intersubgenotype). These results showed that PRRSV have been shown to undergo remarkable genetic diversity.

Key words:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; ORF5 gene; RT-PCR; genetic variation