霜霉病高效生防菌株BCJB01發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

王貽蓮，謝雪迎，扈進冬，陳凱，楊合同，李紀順

(山東省科學院生物研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014)

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【農業(yè)微生物】

霜霉病高效生防菌株BCJB01發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

王貽蓮，謝雪迎，扈進冬，陳凱，楊合同，李紀順*

(山東省科學院生物研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014)

摘要：為提高霜霉病高效生防菌株Bacillus cereus BCJB01的發(fā)酵水平，通過正交試驗、綜合優(yōu)選及糖分流加試驗，優(yōu)化BCJB01的發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)化出的培養(yǎng)基配方的質量分數為：玉米粉2.00%、豆粕粉1.00%、四水氯化錳0.003 0%、十二水磷酸氫二鈉0.30%、二水磷酸二氫鈉0.15%、七水硫酸鎂0.035%、氯化鈣0.10%和酵母提取物0.30%，接菌后6～12 h流加質量分數0.2%糖。本研究優(yōu)化的培養(yǎng)基配方在接種量為3%(V/V)，轉速為180 r /min，溫度為 30 ℃的搖床振蕩培養(yǎng)至66 h時，芽孢率近90%，菌體數量達100×108cfu/mL以上。

關鍵詞：蠟樣芽孢桿菌；霜霉??；發(fā)酵培養(yǎng)基；正交設計；綜合優(yōu)選

霜霉病是作物上普遍發(fā)生的一種世界性病害，常見的有瓜類霜霉病和葡萄霜霉病。瓜類霜霉病不僅侵染甜瓜和黃瓜，還對葫蘆科的西瓜、南瓜、絲瓜及蛇瓜等12 種瓜類作物造成危害[1]。葡萄霜霉病是葡萄的重要病害，嚴重影響葡萄生長及果實產量，給葡萄產業(yè)造成重大的經濟損失[2-3]。

化學防控一直是控制霜霉病的主要措施，多數果蔬產區(qū)需要多次、大量施用化學藥劑才能成功防控其危害[4]，同時易引起抗藥性增強、病害再猖撅及殘留加重等問題。瓜果蔬菜是直接食用的，不能用高毒、高殘留農藥，因此，生物防治成為防控果蔬霜霉病害的首選措施。近年來，利用拮抗微生物被認為是有效控制植物病害的重要途徑[5]。多種生防菌，如木霉(Trichodermaspp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、磚紅微桿菌(Microbacteriumtestaceum)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)以及蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)[6-11]等對霜霉病有抑制作用。作者在霜霉病害生物防治研究中篩選到1 株可有效防治葡萄和黃瓜霜霉病的生防菌株，經鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，命名為BCJB01，菌種保存號為CGMCCNO.10477(已申請專利)。為提高霜霉病高效生防菌株BCJB01的發(fā)酵水平，本文以玉米粉和豆粕粉為主要原料，通過正交試驗對BCJB01菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了初級優(yōu)化，將初級優(yōu)化出的培養(yǎng)基組合添加酵母提取物進行綜合優(yōu)選，并流加糖分，提高生防菌的發(fā)酵水平，以期為其工業(yè)化生產及推廣應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1供試菌株

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus) BCJB01菌株，系本試驗室保存菌種，菌種保存號CGMCCNO.10477。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1普通培養(yǎng)基

蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，pH =7.2；固體培養(yǎng)基添加0.8%的瓊脂，以上均為質量分數。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

正交試驗：以玉米粉和豆粕粉為主要原料，輔以四水氯化錳、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、七水硫酸鎂及氯化鈣，共7個因素，分別設置3種不同的水平，進行正交試驗條件優(yōu)化，正交試驗采用L18(37)設計(表1)。

培養(yǎng)基綜合優(yōu)化：在正交優(yōu)選的培養(yǎng)基配方中添加質量分數0.30%酵母提取物，并將其在160、180和200 r /min的轉速條件下進行綜合比較。

糖分流加試驗：以綜合優(yōu)選培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為基礎，分別測定在接種時及接種后6、12和24 h流加糖不同接種時間對BCJB01菌體數量的影響。

表1　發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗因素和水平設計(%)

1.3培養(yǎng)方法

將斜面活化的BCJB01菌株接種到50 mL 普通培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)10 h 后，以3%(V/V)的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中(空氣液體比為10∶1)，160、180和200 r /min，30 ℃搖瓶振蕩培養(yǎng)，至48 h或66 h停止培養(yǎng)。

1.4菌體及芽孢測定方法

菌體數量采用血球計數板計數，每處理重復測定3次。芽孢形成率用結晶紫染液染色后于顯微鏡下觀察計數。

2　結果與分析

2.1正交試驗

正交試驗結果見表2。由表2可知，正交優(yōu)選配方為A2B1C2D3E2F3G2，即質量分數為玉米粉2.00%、豆粕粉1.00%、二水磷酸二氫鈉0.15%、十二水磷酸氫二鈉0.30%、氯化鈣0.10%、七水硫酸鎂0.035%和四水氯化錳0.003 0%。

表2　正交試驗實驗結果

2.2培養(yǎng)基綜合優(yōu)選

培養(yǎng)基綜合優(yōu)選試驗結果見表3。由表3可知，不同轉速條件下，添加酵母提取物的P2配方發(fā)酵液菌體數量均有提高。其中轉速為180 r /min的情況下，P2配方發(fā)酵液菌體數量最高，為52.60 ×108cfu/mL，是P1配方的1.52倍。同時，芽孢率為92%。表明添加質量分數0.30%的酵母提取物可有效提高發(fā)酵液菌體數量，轉速為180 r /min的培養(yǎng)條件有利于BCJB01產生芽孢。

表3　培養(yǎng)基綜合優(yōu)選試驗結果

2.3流加糖對BCJB01菌體數量及芽孢形成的影響

以綜合優(yōu)選培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為基礎，分別測定流加糖不同接種時間對BCJB01菌體數量的影響。流加糖對BCJB01菌體數量的影響結果見表4。由表4可知，在接菌后6～24 h流加糖均能提高BCJB01菌體數量，其中接菌后6 h流加糖菌體數量增加最多，是未流加糖配方的1.95倍。結合芽孢形成率來看，接菌后6～12 h流加糖有利于BCJB01菌體數量的增加，對芽孢的形成與脫落影響不大。

表4　流加糖對BCJB01菌體數量及芽孢脫落的影響

3　討論

近年來，蠟樣芽孢桿菌作為生防菌已有一些研究報道，研究人員發(fā)現其對黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)、竹白紋羽病(Rosellinianecatrix)、松材線蟲病(Bursaphelenchusspp.)、小麥全蝕病(Gaeumannomycesgraminisvar．tritici(Ggt))和紋枯病(Rhizoctoniacerealis)均有抑制作用[12-17]，但用于防治霜霉病的研究還鮮見報道。徐遲默等[18]2015年報道，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)通過分泌抗生素對荔枝霜霉病(Peronophytholitchii)產生抑制。本研究中的蠟樣芽孢桿菌BCJB01對霜霉病的抑制機理與其不同，它具有降解霜霉病游動孢子的作用，直接切斷了病原菌的有效傳染源(未發(fā)表資料)。因此，蠟樣芽孢桿菌BCJB01具有良好的生防應用價值。

生防菌株的發(fā)酵水平是其應用的基礎。在實際生產中，芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方通常有玉米粉、葡萄糖、豆餅粉、魚粉以及其他一些微量元素[19]。本研究發(fā)現，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比，對BCJB01發(fā)酵后菌體含量有很大的影響。其中，添加酵母提取物及發(fā)酵過程中流加糖均可顯著提高BCJB01發(fā)酵液的菌體數量，添加酵母提取物是不添加的1.52倍，流加糖是未流加糖的1.95倍。最終篩選出BCJB01的培養(yǎng)基配方的質量分數為：玉米粉2.00%，豆粕粉1.00%，四水氯化錳0.003 0%，十二水磷酸氫二鈉0.30%，二水磷酸二氫鈉0.15%，七水硫酸鎂0.035%，酵母提取物0.30%和氯化鈣0.10%，同時在接菌后6～12 h流加0.2%糖，菌體數量達100×108cfu/mL以上。

有效活菌數是衡量微生物菌劑品質的重要指標[20]，芽孢是有效活菌數的重要組成部分，抗逆性強，可耐受多種環(huán)境傷害，是制備微生物菌劑的理想形態(tài)。霜霉病高效生防菌株BCJB01若要實現產業(yè)化生產，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化既要考慮菌體數量，還要考慮芽孢生成率。本文發(fā)現流加糖能提高BCJB01的菌體數量，但卻影響它的芽孢形成率，流加糖的時間十分關鍵，接菌后6～12 h流加糖既有利于BCJB01菌體數量的增加，又對芽孢脫落影響不大，芽孢形成率接近90%。

霜霉病高效生防菌株BCJB01優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，發(fā)酵液菌體數量較優(yōu)化前有了顯著提高，菌體數量達100×108cfu/mL以上。本研究是在實驗室搖瓶發(fā)酵條件下進行的，若要實現產業(yè)化生產，還需在發(fā)酵罐條件下進行發(fā)酵及后處理工藝參數的優(yōu)化試驗，同時要進行相關劑型的研究開發(fā)，后續(xù)工作正在進行中。

參考文獻：

[1]楊柳燕,徐永陽,徐志紅,等. 甜瓜霜霉病研究進展[J].中國瓜菜, 2011, 24(3): 38-43.

[2]李寶燕,王英姿,劉學卿,等.3 種殺菌劑對葡萄霜霉病菌的毒力測定和田間藥效試驗[J].江蘇農業(yè)科學,2014,42(1):98-99.[3]李寶燕,王培松,王英姿.葡萄霜霉病的生物藥劑防治[J].農藥,2014,53(11): 853-855.

[4]秦文韜. 葡萄霜霉病菌快速分子檢測方法研究[D].北京：中國農業(yè)科學院.2013.

[5]劉婧,馬匯泉,董瑾,等.蠟樣芽孢桿菌B-02菌株培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].山東農業(yè)科學,2008(7):54-57.

[6]PERAZZOLLIM, MORETTOM, FONTANA P, et al. Downy mildew resistance induced byTrichodermaharzianumT39 in susceptible grapevines partially mimics transcriptional changes of resistant genotypes [J]. BMC Genomics 2012, 13:660.

[7]岳憲化,胡夫防,段麗峰,等.哈茨木霉菌防治葡萄霜霉病試驗[J].中國果樹,2014(2):54-56.

[8]陳浩,胡梁斌,唐春平,等.枯草芽胞桿菌B-FS01對葡萄霜霉病的防治效果[J].植物保護,2011,37(6):194-197.

[9]郭繼平,馬光,朱會霞,等. 葡萄霜霉病拮抗細菌N6的分離、篩選及鑒定[J].湖北農業(yè)科學,2014,53(17):4063-4065.

[10]扈進冬,吳遠征,李紀順,等.拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2及其制劑對葡萄霜霉病的防效測定[J].山東科學,2014,27(3):30-33.

[11]臧超群,趙奎華,劉長遠,等.生防菌株SY286 對葡萄霜霉病菌的抑菌效果[J].沈陽農業(yè)大學學報,2014,45(2): 221-224.[12]朱玥妍,劉姣,杜春梅.芽孢桿菌生物防治植物病害研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2012,40(34):16635-16638.

[13]唐容容,楊文革,胡永紅,等.蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病的效果及機理研究[J].湖北農業(yè)科學,2013,52(8):1817-1820.

[14]朱天輝,李姝江,韓珊,等.雜交竹白紋羽病生防菌的篩選與應用[J].四川林業(yè)科技,2013,34(6):8-12.

[15]彭雙,閆淑珍,陳雙林.具殺線蟲活性植物內生細菌的篩選和活性產物[J].微生物學報,2011,51(3):368-376.

[16]王剛, 劉鳳英,王淼,等.內生細菌B3-7的運動性參與其在小麥根系的內生定殖和對小麥全蝕病的生物防治[J].植物病理學報, 2011, 41(5):526-533.

[17]黃秋斌,張穎,劉鳳英,等.蠟樣芽孢桿菌B3-7在大田小麥根部的定殖動態(tài)及其對小麥紋枯病的防治效果[J].生態(tài)學報,2014,34(10): 2559-2566.

[18]徐遲默,謝龍蓮,曾筱芬,等.荔枝霜霉病生物防治研究進展[J].南方農業(yè)學報,2015,46(1):72-78.

[19]張文芝,王云鵬,劉紅霞,等.蠟質芽孢桿菌AR156 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].微生物學通報,2010,37(6):803-810.[20]梁昌聰,郭立佳,劉磊,等.響應面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌 C101 發(fā)酵培養(yǎng)基[J].生物技術通報,2014 (8) :169-174.

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.04.007

收稿日期：2016-04-27

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃(2015GNC113002)；山東省科學院-棗莊市產業(yè)技術研發(fā)聯合基金(201503)；公益性行業(yè)( 農業(yè)) 科研專項(201203035)

作者簡介：王貽蓮(1978-)，女，副研究員，研究方向為應用微生物。Email：yilianwang@ 163.com *通信作者。 Email：yewu2@sdas.org

中圖分類號：Q939.95

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026(2016)04-0030-05

Optimization of fermentative medium for highly effective biocontrol strainBacilluscereusBCJB01 against downy mildew

WANG Yi-lian,XIE Xue-ying,HU Jin-dong,CHEN Kai,YANG He-Tong,LI Ji-shun*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶To improve fermentation level of Bacillus cereus BCJB01, a highly efficient biocontrol strain against downy mildew, we optimized its fermentative medium through orthogonal test, comprehensive optimization and sugar feeding tests. Mass fraction of the optimized medium formula are 2.00% corn meal,1.00% soybean powder, 0.0030% manganese chloride tetrahydrate, 0.30% twelve aqueous disodium hydrogen phosphate, 0.15% sodium dihydrogen phosphate dihydrate, 0.035% magnesium sulfate heptahydrate, 0.10% calcium chloride, 0.30% yeast extract, 0.2%sugar added at 6～12 h after inoculation. It can produce more than 100×108 cfu/mL cells and its spore rate is 90%, when the cultivation conditions are 3%(V/V) inoculum size, 180 r / min rotation velocity, 30 ℃ shaky cultivation till 66 hours.

Key words∶Bacillus cereus;downy mildew;fermentative medium;orthogonal design; comprehensive optimization