高壓氧對腦外傷外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的影響①

劉楊，丁政，唐朝正，周蘇鍵，盧曉欣，彭慧平

高壓氧對腦外傷外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的影響①

劉楊1，丁政1，唐朝正1，周蘇鍵2，盧曉欣2，彭慧平1

目的探討高壓氧治療對腦外傷大鼠外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）歸巢的影響。方法采用Ficoll密度梯度離心法分離、培養(yǎng)BMSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對第三代BMSCs表面標(biāo)志CD29、CD90、CD45、CD11b進(jìn)行鑒定，細(xì)胞膜熒光探針CM-DiI對BMSCs進(jìn)行示蹤處理。36只Sprague-Dawley大鼠分為假手術(shù)組（A組，n=6）、模型組（B組，n=6）、BMSCs移植組（C組，n=12）、高壓氧+BMSCs組（D組，n=12），分別于移植后1 d、3 d取腦組織標(biāo)本，冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察示蹤后BMSCs歸巢的數(shù)量和部位；Western blotting檢測基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）及其受體CXCR4的蛋白表達(dá)。結(jié)果受傷側(cè)大腦半球，尤其是受損腦組織周圍，熒光標(biāo)記BMSCs更為集中；同一時(shí)間點(diǎn)D組BMSCs歸巢數(shù)量明顯高于C組（P＜0.01）；C、D組3 d時(shí)BMSCs歸巢數(shù)量均明顯高于1 d時(shí)（P＜0.01）。D組SDF-1、CXCR4的蛋白表達(dá)水平高于C組（P＜0.05）。結(jié)論高壓氧治療可以促進(jìn)外源性BMSCs歸巢至大鼠受損腦組織，其作用與SDF-1/CXCR4信號軸的表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)。

腦外傷；高壓氧；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；歸巢；大鼠

［本文著錄格式］劉楊，丁政，唐朝正，等.高壓氧對腦外傷外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的影響［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:769-773.

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腦外傷（traumatic brain injury，TBI）是一種由于創(chuàng)傷所致的腦部損傷，也是目前世界范圍內(nèi)一個(gè)重要的公共衛(wèi)生和社會經(jīng)濟(jì)問題［1］。它與糖尿病、高血壓病等已被世界衛(wèi)生組織列入21世紀(jì)流行病譜。腦外傷有著極高的死亡率和致殘率，全世界每年有5700萬人發(fā)生腦外傷，其中1000萬人因腦外傷而死亡或住院，同時(shí)腦外傷也是導(dǎo)致全世界45歲以下人群死亡和殘疾的最主要因素［2-3］。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類早期未分化的成體干細(xì)胞，具有定向遷移到炎癥或損傷區(qū)域的特性［4］。其取材來源于成年的骨髓組織，因而不涉及道德和倫理方面的問題，目前已獲批準(zhǔn)作為干細(xì)胞治療藥物試用于臨床。研究表明，BMSCs在抑制炎癥反應(yīng)、參與免疫調(diào)節(jié)、恢復(fù)血腦屏障的完整性、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等方面具有重要作用。然而，BMSCs在體內(nèi)含量僅占骨髓內(nèi)單核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.01%，需要進(jìn)行體外擴(kuò)增和移植。采取有效手段提高歸巢效率成為BMSCs發(fā)揮治療作用的前提［5-6］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧治療通過促進(jìn)內(nèi)源性BMSCs歸巢至受損腦組織，從而加快腦外傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)［7］。還有大量基礎(chǔ)研究證實(shí)，高壓氧治療可增加受損區(qū)域歸巢因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1 （stromal cell-derived factor 1，SDF-1）及其受體CXCR4的表達(dá)水平。本研究探討高壓氧治療對腦外傷大鼠外源性BMSCs歸巢的影響及其機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與材料

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠：南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科。熒光顯微鏡：OLYMPUS公司。CO2培養(yǎng)箱、BCA蛋白定量試劑盒、全波長酶標(biāo)儀：THERMO公司。超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備廠。CYQ-32高壓氧艙：煙臺冰輪高壓氧艙有限公司。淋巴細(xì)胞分離液：天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。DMSO：SIGMA公司。L-DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素混合溶液、0.25%胰蛋白酶：HYCLONE公司。胎牛血清：GIBCO公司。CM-DiI：LIFE TECHNOLOGIES公司。PE或FITC標(biāo)記兔抗大鼠CD29、CD90、CD45、CD11b單克隆抗體及其同型對照抗體，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀：BD公司。β-actin抗體：北京全式金生物技術(shù)公司。CXCR4抗體、SDF-1抗體：ABCAM公司。SDS-PAGE制膠試劑：碧云天生物技術(shù)研究所。PVDF膜：MILLIPORE公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離和培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死大鼠，體質(zhì)量（100±20）g，75%酒精浸泡10 min，轉(zhuǎn)移到清潔工作臺。無菌條件下取雙側(cè)后肢股骨和脛骨，鈍性分離骨表面肌肉組織，用止血鉗分別咬開脛骨和股骨兩端，注射器抽取L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗股骨和脛骨骨髓腔至骨發(fā)白。Ficoll密度梯度離心法分離BMSCs，倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基5 ml（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素），移液器反復(fù)吹打離心管，至管底無沉淀，細(xì)胞均勻分布。接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶（原代細(xì)胞，記為P0），置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后半量換液，去掉懸浮細(xì)胞，以后每3天全量換液1次，倒置相差顯微鏡觀察BMSCs生長情況（細(xì)胞形態(tài)、貼壁及融合情況）。

1.2.2BMSCs鑒定

培養(yǎng)箱中取出第3代BMSCs（P3），移液器吸出完全培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，胰酶混合液消化2～3 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化；1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌3次，制成1×106/ml單細(xì)胞懸液；分別加入CD29-PE、CD90-FITC、CD45-PE、CD11b-PE單克隆抗體及其同型對照抗體各5 μl，室溫避光孵育30 min；1000 r/min離心5 min，PBS沖洗2次去除未標(biāo)記成分，加入PBS 1 ml重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測（每次計(jì)數(shù)10，000個(gè)細(xì)胞）。

1.2.3BMSCs示蹤

取P3代BMSCs，按說明書操作流程用熒光染料CM-DiI對BMSCs細(xì)胞膜進(jìn)行示蹤處理。每1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液加入CM-DiI標(biāo)記液5 μl，吹打制成細(xì)胞懸液。培養(yǎng)箱孵育30 min，1000 r/min離心5 min，棄上清；PBS洗2次。取少量細(xì)胞爬片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4動物模型制備及分組

36只大鼠體質(zhì)量（250±40）g，分為假手術(shù)組（A組，n=6）、模型組（B組，n=6）、BMSCs移植組（C組，n=12）和高壓氧+BMSCs組（D組，n=12）。

動物術(shù)前禁食8 h，禁水2 h。腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，以角膜反射和翻正反射消失確定為麻醉成功。常規(guī)去毛消毒，固定于腦立體定位儀上，沿正中線切開皮膚，在冠狀縫后2.0 mm，矢狀線右側(cè)1.5 mm處用顱骨鉆鉆開直徑約5 mm骨窗，保持硬腦膜完整。將自由落體打擊器固定于骨窗處，20 g下?lián)翦N從40 cm高自由墜落沖擊撞桿頭，造成大鼠右側(cè)頂葉中度腦挫裂傷。局部壓迫止血，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。造模過程中和動物蘇醒期間注意保暖。造模后籠中飼養(yǎng)，提供充足的水和食物，自由活動。

A組只切開皮膚、打開骨窗、骨蠟封閉并縫合頭皮，不行打擊。

造模后24 h，BMSCs移植前行神經(jīng)功能缺損評分（Neurological Severity Scores，NSS）。

1.2.5BMSCs移植

C組和D組造模后24 h，尾靜脈注射示蹤處理后的BMSCs（1×106，200 μl），分別于移植后1 d、3 d提取腦組織標(biāo)本。

1.2.6高壓氧干預(yù)

D組在BMSCs移植后6 h內(nèi)置高壓氧艙，純氧洗艙5 min，勻速加壓15 min至0.2 MPa（2.0 ATA），穩(wěn)壓50 min，保持通風(fēng)（流速5 L/min），避免CO2積聚。艙內(nèi)氧濃度控制在90%以上。勻速減壓20 min至常壓出艙。每天1次。

1.2.7熒光顯微鏡觀察

不同干預(yù)后大鼠以10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，生理鹽水200～300 ml快速心臟灌流，預(yù)冷的4%多聚甲醛緩慢灌流固定腦組織。取出腦組織，4%多聚甲醛中過夜，10%、30%蔗糖逐級脫水，冰凍切片機(jī)切片，厚6 μm，每只動物隨機(jī)切取5張，滴加抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察示蹤后BMSCs歸巢的數(shù)量和部位。

1.2.8Western blotting

稱取冷凍腦組織約20 mg，每10 mg腦組織加入蛋白混合裂解液200 μl（含RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑），玻棒勻漿，冰上裂解15 min，4℃ 13000 r/min離心20 min，收集上清液至EP管，-80℃保存。

按說明書應(yīng)用BCA蛋白定量法在酶標(biāo)儀上測定所提蛋白的濃度，SDS-PAGE制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜置5%牛血清白蛋白（BSA）中，室溫封閉1 h；根據(jù)Marker標(biāo)記切取相應(yīng)分子量大小的PVDF膜，加入一抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；PBS洗膜3次，每次5 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光法，于暗室中顯影和定影。Quantity One軟件測量其灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1BMSCs培養(yǎng)及鑒定

骨髓中分離出的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)12 h后開始貼壁生長；BMSCs呈圓形或紡錘形，與成纖維細(xì)胞外觀相似。經(jīng)過換液和傳代，BMSCs純度不斷提高，P3代BMSCs大小、形態(tài)及排列趨于一致，呈長梭形旋渦狀、放射狀生長。流式細(xì)胞儀測定，CD29陽性率95.8%、CD90陽性率99.3%、CD11b陽性率1.0%、CD45陽性率1.3%。CD29、CD90陽性表達(dá)高，CD11b、CD45陽性表達(dá)低，BMSCs純度較高。

2.2NSS

與A組相比，B組、C組和D組NSS評分明顯升高（P＜0.01），B組、C組和D組之間無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

表1　各組大鼠NSS評分

2.3BMSCs歸巢

雙側(cè)大腦半球均可觀察到示蹤處理后的BMSCs，受傷側(cè)大腦半球，尤其是受損腦組織周圍，熒光標(biāo)記的BMSCs更為集中。同一時(shí)間點(diǎn)，D組BMSCs歸巢數(shù)量明顯高于C組（P＜0.01）；C、D兩組移植后3 d時(shí)BMSCs歸巢數(shù)量均顯著高于1 d時(shí)（P＜0.001）。見表2。

表2　BMSCs歸巢的數(shù)量

2.4Western blotting

不同時(shí)間點(diǎn)，C、D組SDF-1和CXCR4表達(dá)水平均高于A、B組（P＜0.05），D組高于C組（P＜0.05）。見表3、表4。

表3　移植后1 d時(shí)各組SDF-1和CXCR4蛋白表達(dá)

表4　移植后3 d時(shí)各組SDF-1和CXCR4蛋白表達(dá)

3討論

腦外傷患者的死亡率是其他部位外傷死亡率的10倍。預(yù)計(jì)到2020年，腦外傷將成為全球三大疾病之一［8］。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的發(fā)展，尤其是影像學(xué)技術(shù)和顯微神經(jīng)外科技術(shù)的創(chuàng)新和應(yīng)用，腦外傷患者的死亡率有明顯降低，但幸存者中留下許多后遺癥，如運(yùn)動障礙、言語障礙、焦慮、抑郁、認(rèn)知功能障礙、人格改變等［9-11］。進(jìn)一步探討腦外傷后綜合治療方案，對提高患者生活質(zhì)量、降低致殘率具有積極意義。

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制更新的多潛能細(xì)胞，可分為成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。BMSCs是成體干細(xì)胞中的一類多能干細(xì)胞，屬于中胚層時(shí)期發(fā)育的早期細(xì)胞，可以分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞。研究表明，人BMSCs可在體外傳40代仍保持干細(xì)胞特性，是比較理想的干細(xì)胞移植的種子細(xì)胞［12］。

目前BMSCs的分離純化方法主要有四種：免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞儀分離法、密度梯度離心法和全骨髓貼壁培養(yǎng)法［13-14］。前兩種方法由于尚未發(fā)現(xiàn)特異性很強(qiáng)的表面標(biāo)志分子，加之價(jià)格較昂貴，提取過程相對繁瑣，大范圍推廣應(yīng)用仍然受限；后兩種方法提取純度雖然略低，但操作簡便，價(jià)格便宜，目前仍是BMSCs分離的主要方法，其中密度梯度離心法分離的P0代細(xì)胞相對較純，對細(xì)胞活性的影響?。?5］。本研究采用Ficoll密度梯度離心法，分離出的細(xì)胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)及傳代后，能夠獲得純度較高的干細(xì)胞，符合BMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，其表面抗原與公認(rèn)的結(jié)果一致。

通常我們將器官或組織中可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新與分化間平衡的微環(huán)境稱作壁龕（niche）。細(xì)胞外基質(zhì)作為壁龕的主要結(jié)構(gòu)，在啟動和維持干細(xì)胞功能方面起著重要的生理作用，對細(xì)胞黏附、增殖、遷移、分化和生存都有著重要影響［16］。居住于細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境中的BMSCs不僅接受來自細(xì)胞外基質(zhì)的信號，還通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分和酶，引起蛋白質(zhì)及生長因子的蛋白水解修飾，從而維持BMSCs生長環(huán)境的動態(tài)平衡。

外源性BMSCs經(jīng)動、靜脈移植后，在正常生物內(nèi)具有向多組織歸巢的傾向，如腦、骨髓、肺、肝、脾等；但在炎癥或損傷情況下，BMSCs具有定向遷移到受損區(qū)域的特性。本世紀(jì)初，Saito等通過靜脈移植的方式對標(biāo)記后的BMSCs進(jìn)行體內(nèi)移植，首次證明BMSCs具有歸巢的能力；其后的研究對此也有陸續(xù)報(bào)道。BMSCs歸巢的具體機(jī)制尚未完全明確。一般認(rèn)為，歸巢與白細(xì)胞趨化作用類似。Li等發(fā)現(xiàn)，人BMSCs腦內(nèi)遷移主要通過胼胝體-外囊-室管膜下層通路，進(jìn)而分化為神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞［17］。本研究顯示，腦外傷大鼠受損腦組織周圍熒光標(biāo)記的BMSCs集中分布，再次驗(yàn)證BMSCs具有向炎癥或損傷區(qū)域歸巢的特性。

SDF-1是BMSCs分泌的一種趨化因子，屬于趨化因子家族中CXC亞族，即CXCL12。研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1與其特異性受體CXCR4組成的SDF-1/CXCR4信號軸在BMSCs歸巢中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用［18-19］。一般情況下，CXCR4在BMSCs膜表面僅為3.9%，且隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸降低，其余部分大量存在于BMSCs的胞質(zhì)內(nèi)（83%～98%）［20］。在炎癥、組織損傷、趨化因子等因素刺激下，CXCR4在細(xì)胞膜的表達(dá)水平明顯上調(diào)，有利于促進(jìn)干細(xì)胞歸巢和組織修復(fù)。Yu等在大鼠心肌梗死后BMSCs移植的研究中發(fā)現(xiàn)，SDF-1和CXCR4在心肌缺血部位的表達(dá)水平顯著增加，并進(jìn)一步證明SDF-1/CXCR4信號軸是通過激活PI3K/Akt通路，促進(jìn)BMSCs向心肌缺血壞死區(qū)的歸巢［21］。該調(diào)節(jié)機(jī)制也在急性腎損傷的移植研究中得到證實(shí)［22］。

氧氣是細(xì)胞氧化和代謝所必需的環(huán)境因素，對細(xì)胞的生存、遷移、增殖、分化以及維持機(jī)體生命活動具有重要意義。長期低氧可能加速細(xì)胞衰老，影響認(rèn)知功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和分化。高壓氧治療的作用機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明，其中最重要的機(jī)制是高壓氧可增加血液及組織中的物理溶解氧，提高氧分壓，促進(jìn)細(xì)胞的有氧代謝和ATP合成［23］。大量基礎(chǔ)和臨床研究表明，高壓氧能抑制炎癥反應(yīng)，刺激血管和神經(jīng)形成，對干細(xì)胞的動員、增殖和分化有積極影響。有研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧治療可通過上調(diào)SDF-1/CXCR4的表達(dá)水平，促進(jìn)新生血管形成，從而提高皮瓣移植的存活率［24］。還有研究指出，適宜的高壓氧療程對于促進(jìn)BMSCs歸巢至關(guān)重要［25］。

本研究顯示，高壓氧治療能促進(jìn)外源性BMSCs歸巢至大鼠受損腦組織，其作用與SDF-1/CXCR4信號軸的表達(dá)增強(qiáng)密切相關(guān)。由于本研究在BMSCs移植后觀察時(shí)間較短，未能對其分化及神經(jīng)功能恢復(fù)情況做深入研究。BMSCs歸巢后的多向分化、神經(jīng)功能恢復(fù)及高壓氧療程方面尚有待進(jìn)一步探討。

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Effects of Hyperbaric Oxygen on Homing of Exogenous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells after Traumatic Brain Injury

LIU Yang1，DING Zheng1，TANG Chao-zheng1，ZHOU Su-jian2，LU Xiao-xin2，PENG Hui-ping1
1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350100，China；2.Department of Rehabilitation Medicine，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing Command，PLA，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350025，China
Correspondence to PENG Hui-ping.E-mail:361140072@qq.com

Objective To investigate the effects of hyperbaric oxygen（HBO）on homing of exogenous bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）after traumatic brain injury（TBI）in rats.Methods BMSCs were isolated and cultured with Ficoll density gradient centrifugation，and the surface markers（CD29，CD90，CD45，CD11b）of the third generation were identified with flow cytometry.The authenticated BMSCs were processed by the cell membrane fluorescent probe CM-DiI before transplantation.Thirty-six Sprague-Dawley rats were divided into Sham group（n=6），TBI group（n=6），BMSCs group（n=12），HBO+BMSCs group（n=12）.The number and locations of homing of tracing BMSCs were observed under fluorescent microscope after frozen sections，and the expression of stromal cell-derived factor 1（SDF-1）and CXC chemokine receptor type 4（CXCR4）proteins were detected with Western blotting one and three days after BMSCs transplantation.Results The fluorescence-labeled BMSCs focused on the injured hemisphere，especially around the damaged brain tissue.The number of homing was more in HBO+BMSCs group than in BMSCs group at the same time（P＜0.01），and increased in both groups three days after transplantation compared with those of one day after transplantation（P＜0.01）.The expression of SDF-1 and CXCR4 protein were more in HBO+ BMSCs group than in BMSCs group（P＜0.05）.Conclusion HBO can promote the exogenous BMSCs homing to damaged brain tissue in rats after traumatic brain injury，which is related to the enhancement of SDF-1/CXCR4 axis.

traumatic brain injury；hyperbaric oxygen；bone marrow mesenchymal stem cells；homing；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.006

R651.1

A

1006-9771（2016）07-0769-05

1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院專項(xiàng)基金項(xiàng)目（No.2011-009）；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目（No.2014CXTD08）。

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州市350100；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，福建福州市350025。作者簡介：劉楊（1989-），女，漢族，江西吉安市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病與損傷的康復(fù)。通訊作者：彭慧平，男，碩士，主任醫(yī)師，副教授。E-mail: 361140072@qq.com。

2016-04-11

2016-05-20）