電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后炎性因子及細(xì)胞凋亡的影響①

朱路文，葉濤，姜云飛，吳孝軍，李宏玉，宋名揚(yáng)，唐強(qiáng)

電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后炎性因子及細(xì)胞凋亡的影響①

朱路文1，葉濤2，姜云飛2，吳孝軍2，李宏玉2，宋名揚(yáng)2，唐強(qiáng)1

目的探討電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6含量及細(xì)胞凋亡的影響。方法36只清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和電針預(yù)處理組，每組12只。大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）建立腦缺血2 h再灌注模型。再灌注后24 h，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清、腦組織IL-1β、IL-6的含量，TUNEL染色檢測(cè)缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果與模型組比較，電針預(yù)處理組大鼠血清、腦組織IL-1β、IL-6的含量明顯下降（P＜0.01），TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著下降（P＜0.001）。結(jié)論電針預(yù)處理降低炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡。

腦缺血再灌注；電針；預(yù)處理；白細(xì)胞介素-1β；白細(xì)胞介素-6；細(xì)胞凋亡；炎癥反應(yīng)；大鼠

［本文著錄格式］朱路文，葉濤，姜云飛，等.電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后炎性因子及細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:765-768.

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腦缺血再灌注后，機(jī)體免疫系統(tǒng)激活，分泌白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎癥細(xì)胞因子，引起神經(jīng)元細(xì)胞損傷與凋亡，導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)缺失與功能障礙［1-2］。近年國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，電針預(yù)處理可誘導(dǎo)腦缺血耐受，減輕腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用［3-5］。本實(shí)驗(yàn)探討電針預(yù)處理百會(huì)穴對(duì)腦缺血再灌注大鼠血清、腦組織IL-1β、IL-6含量及缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質(zhì)量220～240 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（黑）2008001。于溫度24～26℃、濕度60%～70%、噪音＜60 dB環(huán)境下飼養(yǎng)，明暗各12 h交替（7:00～19:00開(kāi)燈）。

1.2主要儀器和試劑

G6805-1A型電針儀：上海華誼醫(yī)用儀器廠。MK3酶標(biāo)儀：THERMO SCIENTIFIC公司。KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)：中科中佳科學(xué)儀器有限公司。RM2235型切片機(jī)：LEICA公司。PeriFlux 5000型激光多普勒血流儀：帕瑞醫(yī)學(xué)公司。TUNEL試劑盒：ROCHE公司。IL-1β、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒：北京誠(chéng)林生物技術(shù)有限公司?？捡R斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒：北京賽馳生物科技有限公司。

1.3動(dòng)物分組及干預(yù)

將36只大鼠編1～36號(hào)。計(jì)算機(jī)生成一個(gè)含36個(gè)數(shù)的隨機(jī)數(shù)字表，以表中第一數(shù)對(duì)應(yīng)大鼠編號(hào)1，從左到右，自上而下分別對(duì)應(yīng)1～36號(hào)大鼠。用表中隨機(jī)數(shù)字除以3得余數(shù)確定各編號(hào)的組別，余數(shù)0、1、2分別對(duì)應(yīng)假手術(shù)組、模型組、電針預(yù)處理組，最終各組隨機(jī)分入12只大鼠。假手術(shù)組接受類似電針預(yù)處理組的各項(xiàng)手術(shù)操作，但不行模型制作；模型組僅接受模型制作；電針預(yù)處理組電針預(yù)處理2周后制作模型。

1.3.1電針預(yù)處理

大鼠固定于大鼠固定器上，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物圖譜》選取大鼠百會(huì)穴（雙耳前緣連線中點(diǎn)），采用直徑0.25 mm，長(zhǎng)25 mm毫針（貴州安迪醫(yī)療器械有限公司），45°進(jìn)針2 mm。連接電針儀，另一極連接耳尖，采用疏密波，頻率2/15 Hz，強(qiáng)度1 mA，干預(yù)30 min，每天1次，每周5 d，共2周。

1.3.2模型制備

線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型。術(shù)前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，恒溫加熱板保持大鼠體溫于36.5～37.5℃。碘伏頸部消毒，頸正中處切口，鈍性剝離軟組織，暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎靠近分叉處的頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈分叉處下方用眼科剪剪一“V”型切口，將頭端過(guò)蠟、直徑0.26 mm的魚(yú)線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，深距離分叉處17～18 mm。激光多普勒監(jiān)測(cè)血流阻閉情況，于大腦中動(dòng)脈腦血流降基線值30%以下視為造模成功。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，2 h后拔出栓線。各組于再灌注2 h根據(jù)Longa等的5分制法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分［6］，評(píng)分1、2、3分的大鼠視為造模成功，納入實(shí)驗(yàn)。

1.4取材及檢測(cè)方法

1.4.1血清IL-1β、IL-6含量

再灌注24 h后，各組取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛4 ml/kg麻醉，真空采血管于心尖采血4 ml，室溫靜置30 min，4℃ 3000 r/min離心15 min，取上清，保存于-20℃冰箱。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組血清IL-1β、IL-6含量。

1.4.2腦組織IL-1β、IL-6含量

再灌注24 h后，取余下6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛4 ml/kg麻醉，快速斷頭取腦，切取缺血側(cè)腦梗死周邊組織，稱重后，4℃預(yù)冷PBS制備10%腦組織勻漿，4℃ 3000 r/min離心10 min，取上清，保存于-20℃冰箱。運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法標(biāo)定蛋白含量，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腦組織勻漿中IL-1β、IL-6含量，除以蛋白含量后即得到每毫克組織蛋白中IL-1β、IL-6含量。

1.4.3TUNEL染色

采血結(jié)束后，動(dòng)脈夾或止血鉗夾閉腹主動(dòng)脈或流向下肢的血管，心內(nèi)灌注。冰板上快速斷頭取腦，保存于4%多聚甲醛中，4℃冰箱過(guò)夜。視交叉后1 mm冠狀位向后切取厚4 mm腦組織，置10%中性福爾馬林緩沖液中固定18 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，厚3～5 μm，烤片后4℃保存。

65℃烤片1 h，二甲苯脫蠟（二甲苯Ⅰ、Ⅱ，各5 min），下行梯度酒精水合，室溫下蛋白酶K消化30 min，PBS漂洗3次，各5 min（下同）；37℃暗濕盒中滴加TUNEL反應(yīng)液50 μl，孵育1 h，PBS漂洗；37℃暗濕盒中滴加POD反應(yīng)液50 μl，孵育30 min，PBS漂洗；室溫下DAB顯色，PBS漂洗，蘇木素對(duì)比染色，溫水返藍(lán)。上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，鏡檢。每只大鼠取1張切片，低倍鏡（10×10）下定位缺血半暗區(qū)，高倍鏡（10×40）下觀察拍照，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1血清IL-1β、IL-6含量

與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-1β、IL-6均顯著升高（P＜0.001）。與模型組比較，電針預(yù)處理組血清IL-1β、IL-6含量顯著降低（P＜0.001）。見(jiàn)表1。

2.2腦組織IL-1β、IL-6含量

與假手術(shù)組比較，模型組腦組織IL-1β、IL-6均顯著升高（P＜0.001）。與模型組比較，電針預(yù)處理組腦組織IL-1β、IL-6均明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.3TUNEL染色

假手術(shù)組少見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.001）。與模型組比較，電針預(yù)處理組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少（P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1　　各組血清和腦組織IL-1β、IL-6含量及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

3討論

腦缺血再灌注損傷中醫(yī)學(xué)稱為“中風(fēng)”，由竅閉神匿，神不導(dǎo)氣所致，治療遵循“病變?cè)谀X，首取督脈”的理論。百會(huì)屬督脈，有醒腦開(kāi)竅，升陽(yáng)舉陷，益氣補(bǔ)虛、平肝息風(fēng)的功效。電針刺激百會(huì)穴可減輕腦缺血損傷，降低腦梗死體積，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［7-9］。

電針預(yù)處理是于腦缺血前進(jìn)行單次或多次電針刺激，預(yù)防及保護(hù)腦損傷的一種方法［7，10］。電針預(yù)處理可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、低氧誘導(dǎo)因子-1α、非受體酪氨酸激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用［8，11-12］；還可通過(guò)抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)血腦屏障、內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)等途徑，誘導(dǎo)腦缺血耐受［13-15］。

近年來(lái)，腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是治療腦缺血的重要靶點(diǎn)。腦缺血再灌注后，可產(chǎn)生大量炎癥因子，激活和趨化炎性細(xì)胞及合成分泌黏附因子等，多種因素相互作用引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織繼發(fā)炎癥性損傷［16］。

IL-1β、IL-6是炎癥反應(yīng)中的重要因子。IL-1β是炎癥細(xì)胞的強(qiáng)烈趨化因子，可引起星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞活化與增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化［17］；還可致白細(xì)胞浸潤(rùn)、增加興奮性氨基酸和氧自由基的釋放等，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使炎癥反應(yīng)加劇甚至失控，導(dǎo)致腦組織繼發(fā)性損傷［18-19］。

IL-6表達(dá)水平是腦缺血再灌注損傷程度的重要指標(biāo)［20］。IL-6可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞作用于腦組織，還可引起炎癥介質(zhì)的生成與增多，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達(dá)，從而加速炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞受損［21-23］。

本研究顯示，腦缺血再灌注24 h，可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而電針預(yù)處理可降低該炎癥反應(yīng)相關(guān)炎癥因子，發(fā)揮抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的作用。

炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡在時(shí)間和空間上相互重疊、彼此影響，共同構(gòu)成損傷過(guò)程中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而加速腦缺血再灌注損傷的出現(xiàn)。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是由細(xì)胞內(nèi)外因素刺激導(dǎo)致細(xì)胞本身自殺程序被激活而引起。神經(jīng)細(xì)胞凋亡程序在腦缺血損傷，特別是腦缺血再灌注損傷中起著重要作用［24-26］。細(xì)胞凋亡在腦缺血后所引起的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡占比較大。本研究顯示，腦缺血再灌注可誘發(fā)缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，而電針預(yù)處理可降低細(xì)胞凋亡水平，減輕腦損傷程度。

總之，本研究顯示，電針預(yù)處理可以有效抑制腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，減弱其誘導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，抑制損傷腦組織的細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)腦缺血耐受。本研究進(jìn)一步證實(shí)電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用，為電針預(yù)處理作為缺血性腦卒中的防治措施提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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Effects of Electro-acupuncture Pretreatment on Interleukin-1β，Interleukin-6 and Apoptosis in Rats after Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

ZHU Lu-wen1，YE Tao2，JIANG Yun-fei2，WU Xiao-jun2，LI Hong-yu2，SONG Ming-yang2，TANG Qiang1
1.The Second Hospital Affiliated to Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang 150001，China；2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang 150040，China
Correspondence to TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

Objective To investigate the effect of electro-acupuncture pretreatment on content of interleukin（IL）-1β and IL-6 in serum and ischemic penumbra，and apoptosis in ischemic penumbra in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods Thirty-six male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group（n=12），model group（n=12），and electro-acupuncture pretreatment group（n= 12）.The middle cerebral arteries were occluded for 120 minutes and reperfused.Twenty-four hours after reperfusion，the level of IL-1β and IL-6 in serum and brain tissue was detected with enzyme-linked immunosorbent，and apoptosis of ischemic penumbra was detected with TUNEL.Results The content of IL-1β and IL-6 in the serum and brain tissue，and the number of TUNEL-positive cells decreased in the electro-acupuncture pretreatment group compared with that in the model group（P＜0.01）.Conclusion Electro-acupuncture pretreatment may inhibit inflammatory response and apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury.

cerebral ischemia-reperfusion；electro-acupuncture；pretreatment；interleukin-1β；interleukin-6；inflammatory response；apoptosis；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.005

R743.32

A

1006-9771（2016）07-0765-04

1.哈爾濱市科技創(chuàng)新人才專項(xiàng)基金項(xiàng)目（青年后備人）（No.2014RFQGJ150）；2.黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.QC2015103）；3.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81503666）。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040。作者簡(jiǎn)介：朱路文（1983-），男，山東鄒城市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：針刺預(yù)處理預(yù)防腦血管病。通訊作者：唐強(qiáng)（1963-），男，四川大竹縣人，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。

2016-03-28

2016-05-19）