復方腦肽節(jié)苷脂注射液激活線粒體自噬改善腦缺血再灌注損傷①

王明洋，馮璐，范姝婕，鄭吉，李冬梅，楊楠，左萍萍，劉雁勇

復方腦肽節(jié)苷脂注射液激活線粒體自噬改善腦缺血再灌注損傷①

王明洋，馮璐，范姝婕，鄭吉，李冬梅，楊楠，左萍萍，劉雁勇

目的觀察復方腦肽節(jié)苷脂注射液（CPCGI）對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用并探討其機制。方法Sprague-Dawley大鼠隨機分成假手術組、模型組、CPCGI低劑量治療組、CPCGI高劑量治療組、陽性藥金納多組，每組10只。線栓法制備大鼠大腦中動脈梗阻2 h后復灌模型，即刻給藥，連續(xù)14 d。術后1 d、3 d、7 d和14 d行神經(jīng)功能癥狀缺損評分，術后14 d行貼紙去除及平衡木行走實驗，Western blotting檢測損傷周圍腦組織Beclin1、PINK1及Parkin的表達。結果術后14 d，與模型組相比，各給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低（P＜0.05），大鼠過桿時間明顯縮短（P＜0.01），CPCGI給藥組去除兩側前肢貼紙的時間縮短（P＜0.05）。模型組皮層組織中Beclin1及Parkin蛋白表達明顯下降（P＜0.01），PINK1蛋白表達明顯上升（P＜0.01），CPCGI各組均能逆轉該作用（P＜0.05）。結論CPCGI的神經(jīng)保護作用機制之一可能與激活線粒體自噬，改善線粒體功能有關。

腦缺血再灌注損傷；復方腦肽節(jié)苷脂注射液；線粒體自噬；大鼠

［本文著錄格式］王明洋，馮璐，范姝婕，等.復方腦肽節(jié)苷脂注射液激活線粒體自噬改善腦缺血再灌注損傷［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（7）:750-753.

CITED AS:Wang MY，F(xiàn)eng L，F(xiàn)an SJ，et al.Effect of Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:750-753.

腦卒中是目前全球第二大致死性疾病，且致殘率最高［1-2］。神經(jīng)保護劑對腦卒中患者的恢復有重要作用［3］。復方腦肽節(jié)苷脂注射液（Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection，CPCGI）是一復方制劑，其主要成分為多肽、多種神經(jīng)節(jié)苷脂、次黃嘌呤等。臨床研究顯示，CPCGI對阿爾茨海默病有明顯改善作用［4］，并可用于腦缺血等腦部疾病引起的功能障礙的治療。但其藥理作用機制有待進一步探討。

缺血再灌注損傷是腦卒中重要的病理生理機制之一，而線粒體功能障礙在此過程中發(fā)揮著重要作用［5］。由于神經(jīng)元的正常生理活動依賴于線粒體產(chǎn)生的ATP作為能量供體［6］，調控并維持線粒體的正常功能對神經(jīng)系統(tǒng)功能的執(zhí)行至關重要［7-8］。本研究采用大鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，從改善線粒體功能方面對CPCGI的抗腦缺血再灌注損傷機制進行藥效學評價。

1材料和方法

1.1試劑

CPCGI（國藥準字H22026472）：吉林步長制藥有限公司。銀杏葉提取物注射液（金納多）：中豪國際有限公司。硅膠線栓：北京西濃科技有限公司。戊巴比妥鈉：SIGMA公司。小鼠抗Parkin抗體、兔抗Beclin1抗體：CST公司。兔抗PINK1抗體：SANTA CRUZ公司。小鼠抗β-actin抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠二抗及辣根酶標記山羊抗兔二抗：北京中杉金橋生物技術有限公司。Western blotting實驗相關材料：北京普利萊生物技術有限公司。

1.2實驗動物及分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量260～280 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，質量合格證號SCXK（軍）2012-0004。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，光照12 h/12 h明暗交替，自由飲食。大鼠適應環(huán)境7 d后，線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型。將模型制作成功的大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分成模型組、CPCGI低劑量治療組（0.5 ml/kg，相當于多肽1.6 mg/kg，腹腔注射）、高劑量治療組（1 ml/kg，相當于多肽3.2 mg/kg，腹腔注射）、金納多組（50 mg/kg，腹腔注射），每組大鼠10只。各組大鼠缺血2 h后再灌注即開始給藥。假手術組和模型組大鼠給生理鹽水1 ml/kg腹腔注射。連續(xù)給藥14 d。

1.3模型制備

參照Longa法［9］建立大鼠MCAO模型。術前12 h禁食不禁水。大鼠1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺上。備皮，碘伏消毒。沿頸正中線切開皮膚，鈍性分離右側頸部肌肉，暴露右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈。結扎頸總動脈近心端及頸外動脈，在距分支5 mm處用動脈夾夾閉頸總動脈遠心端。在頸總動脈遠心端結扎處與動脈夾之間剪一小口，插入直徑0.26 mm的圓頭硅化栓線（用0.1%多聚賴氨酸包被）至頸內動脈，最終栓線頭部膨大端進入大腦中動脈阻斷血流供應。2 h后小心抽出栓線。手術過程注意大鼠保溫。

假手術組只進行手術過程而不插線。

1.4行為學評價

1.4.1神經(jīng)功能缺損評分

各組動物分別在術后1 d、3 d、7 d和14 d進行神經(jīng)功能缺損評分［10］，包括運動、感覺、反射和平衡能力測試等［11］。分數(shù)越高，損傷越嚴重。

1.4.2貼紙去除實驗

各組動物術后14 d行貼紙去除實驗［12］。用2片邊長10 mm的正方形粘性紙將大鼠2個前肢掌面粘?。ㄕ承猿潭纫哉４笫?0 s內將粘性紙咬掉為佳），將大鼠置于測試圓筒中，大鼠會本能地將紙片咬掉。觀察并記錄大鼠去除兩側紙片的總時間，若120 s內未去除紙片，記為120 s。

1.4.3平衡木行走實驗

各組動物術后14 d行平衡木行走實驗［13］。平衡木為105×4×3 cm木條，兩端固定使木條離地80 cm。起始點為陡峭平臺，終點為一平臺。記錄大鼠四肢均通過整個平衡木的時間；超過120 s未通過整個平衡桿記為120 s，大鼠從平衡桿跌落記為超過120 s未通過。測試前大鼠每天訓練1次，共訓練2 d。

1.5Western blotting

除金納多組外，各組動物于行為學評價結束后立即斷頭處死，分離腦組織，于液氮中猝冷。取損傷側大腦皮層組織50 mg左右，置于冰上的EP管中，加入10倍體積組織裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制劑∶蛋白磷酸酶抑制劑=100∶1∶1），冰浴中超聲破碎儀破碎1 min，充分勻漿后冰上裂解20 min；4℃12000 r/min離心15 min，取上清。Bradford法測定蛋白濃度。4∶1比例加入5×蛋白上樣緩沖液，97℃變性6 min，取蛋白樣品50 μg行SDS-PAGE電泳。80 V恒壓電泳至樣品進入分離膠后調整為110 V恒壓電泳，直至溴酚藍條帶接近電泳槽底部；200 mA恒流電轉將蛋白印跡轉移到PVDF膜上；加入5%脫脂奶粉封閉1 h；去除封閉液，加入稀釋好的一抗（小鼠抗Parkin抗體，1 ∶1000；兔抗PINK1抗體，1∶200；兔抗Beclin1抗體，1∶1000；小鼠抗β-actin抗體；1∶1000），4℃過夜；洗膜后加入稀釋好的二抗（辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗，1∶5000），室溫孵育1h；膜清洗后置于ECL發(fā)光液中顯色，ECL熒光檢測儀中顯影。Gelpro軟件灰度掃描，采用百分比歸一法比較各組之間目的蛋白的表達。

1.6統(tǒng)計學分析

2結果

2.1神經(jīng)功能缺損評分

假手術組無明顯神經(jīng)功能損傷。與假手術組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分在術后1 d、3 d、7 d和14 d均顯著增加（P＜0.001），各給藥組大鼠經(jīng)過治療14 d后，與模型組相比降低（P＜0.05）。見表1。

表1　　各組神經(jīng)功能缺損評分比較

2.2貼紙去除實驗

模型組去除貼紙時間與假手術組相比顯著延長（P＜0.001）。CPCGI低、高劑量組去除貼紙時間均較模型組縮短（P＜0.05）。見表2。

2.3平衡木行走實驗

模型組過桿時間與假手術組大鼠相比顯著延長（P＜0.001）。CPCGI低、高劑量組，金納多組過桿時間與模型組相比明顯縮短（P＜0.01）。見表2。

表2　　各組感覺及運動功能比較（s）

2.4Western blotting

模型組Beclin1的表達較假手術組明顯降低（P＜0.01），而CPCGI低、高劑量組均能提高其表達（P＜0.05）。

模型組PINK1的表達較假手術組明顯升高（P＜0.01），Parkin表達明顯降低（P＜0.01）。CPCGI低、高劑量組PINK1表達較模型組降低（P＜0.05），CPCGI高劑量組Parkin表達升高（P＜0.05）。見表3。

表3　　各組腦組織Beclin1、PINK1及Parkin蛋白表達

3討論

本研究顯示，CPCGI對腦缺血再灌注損傷的治療作用與陽性藥金納多療效相當，能促進模型大鼠的感覺功能及軀體運動協(xié)調功能的恢復。

腦缺血再灌注損傷使腦神經(jīng)元內線粒體膜通透性改變及線粒體通透性轉換孔開放，細胞色素C大量釋放等，導致線粒體功能障礙［14］。受損線粒體不僅無法產(chǎn)生足夠能量供給神經(jīng)元，還會生成活性氧、自由基，導致氧化損傷進一步加重［15］。

自噬的主要功能是將胞質中一些損壞的細胞器通過溶酶體途徑降解，實現(xiàn)能量的再循環(huán)，以維持細胞自身的穩(wěn)定［16］。Beclin1是哺乳動物細胞自噬的標記性蛋白，主要調控自噬體的形成與成熟，屬特異性基因［17-18］。我們檢測到模型組大鼠損傷側皮層組織蛋白中Beclin1表達顯著下調，說明細胞自噬水平明顯下降，經(jīng)CPCGI治療可劑量依賴地恢復Beclin1表達，使細胞恢復自噬能力。

線粒體選擇性自噬機制的PINK1/Parkin通路在清除受損線粒體過程中也發(fā)揮重要作用［19-22］。正常情況下，PINK1表達于所有線粒體上，并由蛋白水解酶降解；而受損的線粒體由于蛋白水解酶活性被抑制，PINK1會持續(xù)累積［23］。本研究顯示，模型組大腦皮層組織中PINK1的表達顯著升高，說明線粒體自噬功能障礙，CPCGI治療可逆轉這一變化。此外，Parkin參與的泛素蛋白酶體系統(tǒng)對于體內毒素和代謝物的清除以及細胞修復起到重要作用［24-25］。本研究顯示，模型組大腦皮層組織中Parkin蛋白表達降低，CPCGI則可以逆轉該損傷，激活線粒體自噬，有利于清除受損線粒體，保護正常線粒體功能，從而改善缺血再灌注損傷。

綜上所述，CPCGI對急性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能、感覺及運動功能均有較好的保護作用，其作用機制之一可能是通過激活線粒體自噬功能發(fā)揮的。詳細作用機制尚待進一步探討。

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Effect of Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats

WANG Ming-yang，F(xiàn)ENG Lu，F(xiàn)AN Shu-jie，ZHENG Ji，LI Dong-mei，YANG Nan，ZUO Ping-ping，LIU Yan-yong
Department of Pharmacology，Institute of Basic Medical Sciences，Neuroscience Center，Chinese Academy of Medical Sciences&School of Basic Medicine，Peking Union Medical College，Beijing 100005，China
Correspondence to LIU Yan-yong.E-mail:liuyanyong@126.com

Objective To investigate the neuroprotective effect and possible mechanism of Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection（CPCGI）on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Methods Healthy adult male Sprague-Dawley rats were divided into sham group（n=10），model group（n=10），CPCGI low dosage group（n=10）and high dosage group（n=10），and control group（Ginkgo biloba extract，n=10）.All the rats was subjected to middle cerebral artery occlusion（MCAO）for two hours and reperfusion except sham group，and received treatment for fourteen days once reperfusion started.They were tested with modified Neurological Severity Score one，three，seven and fourteen days after MCAO，and adhesive-removal test and beam-walking test fourteen days after MCAO.The expression of Beclin1，PINK1 and Parkin were detected with Western blotting.Results Compared with the model group，the Neurological Severity Score reduced （P＜0.05）and the time crossing the beam reduced（P＜0.01）in all the medical groups fourteen days after MCAO，and the time removing the adhesive paper reduced in the CPCGI groups（P＜0.01）.The expression of Beclin1 and Parkin decreased and the PINK1 level increased in the model group（P＜0.01），and it was reversed in all the CPCGI groups（P＜0.05）.Conclusion CPCGI could relieve the cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through the regulation in mitophagy.

cerebral ischemia-reperfusion injury；Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection；mitophagy；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.002

R743.32

A

1006-9771（2016）07-0750-04

北京協(xié)和青年基金（No.3332015113）。

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所藥理室，北京市100005。作者簡介：王明洋（1990-），女，漢族，河南新密市人，博士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理學。通訊作者：劉雁勇（1972-），男，博士，研究員，主要研究方向：神經(jīng)藥理學。E-mail:liuyanyong@126.com。

2016-03-01

2016-03-18）