超聲空化法制備脫細胞血管支架生物學相容性的實驗研究

劉 賓, 李 菲, 張蔓菁, 魯開化

作者單位：710003 陜西 西安,西安市中心醫(yī)院 燒傷整形外科(劉 賓);西安醫(yī)學院護理學院(李 菲);昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 整形外科(張蔓菁)；第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 整形外科(魯開化);

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超聲空化法制備脫細胞血管支架生物學相容性的實驗研究

劉 賓, 李 菲, 張蔓菁, 魯開化

作者單位：710003 陜西 西安,西安市中心醫(yī)院 燒傷整形外科(劉 賓);西安醫(yī)學院護理學院(李 菲);昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 整形外科(張蔓菁)；第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 整形外科(魯開化);

目的 檢測經(jīng)強度為300 W超聲處理后的脫細胞血管支架的生物相容性。方法 無菌條件下，采取新鮮兔股動脈反復凍溶+超高壓處理后，利用核酸酶進行消化，脫去殘留細胞碎片形成脫細胞血管支架。將強度為300 W的超聲作用于脫細胞血管支架，并對處理后支架材料的生物學相容性進行檢測和觀察。結果 經(jīng)強度為300 W超聲處理后的支架材料，其疏松化程度在明顯提高的同時未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒性，且種子細胞可以長入材料內部。結論 超聲空化法處理后的脫細胞血管支架材料具有較好的組織相容性，可以為組織工程血管支架的研究提供新的思路和方法。

組織工程血管; 脫細胞血管支架; 超聲; 生物相容性

對血管支架的研究一直是血管組織工程研究領域的難點和重點。脫細胞血管基質在血管組織工程中得到越來越多的重視和應用[1-2]。目前，組織工程學種子細胞種植于材料的通行做法是：靜態(tài)培養(yǎng)復合[3]、生物發(fā)生器內復合[4]、旋轉攪動[5]以及離心培養(yǎng)[6]等。這些細胞種植方法需要高密度的種子細胞，但仍無足夠的證據(jù)表明細胞能夠長入支架材料內部[7]。因此，如何在保留脫細胞血管支架機械強度的前提下，提高脫細胞血管基質材料的疏松性和孔隙率，仍是目前組織工程脫細胞血管支架研究中的一個熱點。在前期的試驗中我們發(fā)現(xiàn)[8]，通過超聲波在液體內的空化效應，并使用300 W強度的超聲波，可以在不顯著改變材料本身生物化學成分及生物力學特性的前提下，達到使脫細胞血管支架致密的膠原纖維疏松化的目的。2014-2015年，西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科對超聲處理后支架材料的生物學相容性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑來源

選擇2.0～2.5 kg的大耳白兔10只(由第四軍醫(yī)大學動物中心提供)。核糖核酸酶(R- Nase A)、脫氧核糖核酸酶(D-Nase I，美國SIGMA公司)、超聲生物處理器(VIRSONIC 100，美國)。

1.2 方法

1.2.1 脫細胞血管支架的制備 在麻醉、無菌條件下取出兔股動脈(20根)，具體制備方法同文獻[9]。

1.2.2 超聲處理脫細胞血管支架 超聲探頭經(jīng)高壓滅菌處理后，將脫細胞兔血管修剪為5 mm×25 mm的片狀,分別置入0℃的PBS溶液中。將超聲探頭垂直浸入PBS液中約2 cm。使用處理間隔為1 s，對每個材料總計超聲處理時間為60 s，每個材料所接受的累積超聲強度為300 W。

1.2.3 兔血管內皮細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 取兔股靜脈>50 cm，6 h內進行分離、培養(yǎng)；5號帶柄一次性靜脈輸液針吸取37℃ 預熱雙抗PBS，插入靜脈沖洗，洗除殘血，注入口處用線繩結扎，以防液體返流；分別注入0.125%、0.25% 胰酶和0.1% 膠原酶消化液，使管腔充盈，37℃ ，于12、15、17 min，松開一端，收集消化液； 注入含10%胎牛血清M199培養(yǎng)液再次沖洗管腔；將消化液和沖洗液離心800 r/min，5 min，棄上清；加M199培養(yǎng)液，吹打均勻制成細胞懸液，以每瓶濃度2×105傳入25 cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每24 h半定量換液，當細胞生長至完全融合，按1∶2的比例傳代并接種細胞，建立二倍體細胞系。取5、6代細胞進行試驗。內皮細胞鑒定：⑴細胞形態(tài)學觀察培養(yǎng)過程直接在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況并記錄典型表現(xiàn)。⑵免疫組化檢測vWF的表達。

1.2.4 細胞黏附及接觸細胞毒性測定 將約3 mm2的無菌醫(yī)用粘合膜貼于一次性細胞培養(yǎng)皿中央，無菌條件下取5 mm×5 mm大小超聲處理后的脫細胞血管基質并黏附于細胞培養(yǎng)皿中。作為陽性對照組，將1滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培養(yǎng)皿中央的醫(yī)用粘合膜上；陰性對照組培養(yǎng)皿中央僅粘貼醫(yī)用粘合膜。將準備的成內皮細胞懸液依次接種于上述培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱中(37℃,5%CO2)孵育48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞與培養(yǎng)皿中央材料毗鄰部位的形態(tài)。

1.2.5 材料提取物細胞毒性測定 ⑴取超聲處理過的脫細胞血管支架100 mg,用無菌剪刀盡可能地剪碎，組織碎片放入可密封消毒試管中，稱質量，加入DMEM培養(yǎng)液200 ml(2 ml/mg組織)。密封試管后于37℃孵育96 h，離心(1400 r/min,20 min)、取上清液、0.2 μm濾器過濾后測定體積。⑵MTT法檢測細胞增殖活性。選取培養(yǎng)的3～5代的兔血管內皮細胞，常規(guī)傳代以細胞密度約5×106/孔，分別接種于6塊96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液200 μl,移入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng) 24 h；生長至鋪滿80%孔底后，取3塊96孔培養(yǎng)板，實驗組加入含材料提取液的培養(yǎng)液100 μl；試驗濃度設5個復孔，并設陰性對照孔(DMEM培養(yǎng)液100 μl)和空白孔(無細胞)，3塊板繼續(xù)培養(yǎng)不同時間(12、24、36 h)后進行MTT實驗。先吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液 20 μl(5 mg/ml用PBS稀釋pH=17.4)，37℃、5%CO2恒溫孵箱培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液。每孔加二甲基亞砜(杭州四季青生物有限公司)150 μl，在酶標儀內振蕩10 min，于 492 nm波長處測定各孔吸光度(A值)。每組實驗重復5次，取平均A值。以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.6 脫細胞血管基質對于內皮細胞親和力的研究 將脫細胞血管基質和超聲處理后的脫細胞血管基質，分別修剪為5 mm×25 mm的片狀并黏附于細胞培養(yǎng)皿中，將準備的內皮細胞懸液依次接種于上述培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱中(37℃,5%CO2)分別孵育24、48、72、96、120 h以及1、2、3、4、5周后，分別取支架材料，石蠟包埋,切片，光鏡觀察內皮細胞在支架材料表面的黏附情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件的單因素分析法。兩樣本均數(shù)比較，采用組間或配對比較t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兔血管內皮細胞培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)學觀察 鏡下可見單層細胞呈短梭狀或鵝卵石樣鑲嵌排列(圖1)；免疫化學(SP)染色可見細胞胞漿中呈現(xiàn)棕黃色顆粒，提示細胞內存在vWF(圖2)；因此，從形態(tài)學及免疫組化學方面均證實培養(yǎng)細胞為內皮細胞。

2.2 材料的生物相容性測定結果

超聲處理后材料的細胞毒性：⑴接觸性細胞毒性。超聲處理前后的脫細胞血管材料，均無細胞毒性，在材料的周圍未發(fā)現(xiàn)內皮細胞的接觸或生長抑制，測試樣本周圍的內皮細胞形態(tài)正常(圖3)。經(jīng)過超聲處理的脫細胞血管材料內可見多量內皮細胞長入(圖4)。⑵提取物細胞毒性。材料提取物的細胞毒性見表1。測定結果證明，原濃度材料提取液組對于細胞的抑制作用，與M199組無明顯差異。選取原濃度材料提取液繪制作用后的EC生長曲線。

表1 材料提取液作用后EC吸光度變化

注：*P>0.05，同一時段原濃度液與M199組間比較；◇P>0.05，原濃度液不同作用時間組間比較

2.3 脫細胞血管基質對于內皮細胞親和力的研究

2.3.1 脫細胞血管支架材料的細胞黏附性 組織學觀察證實，將兔血管內皮細胞與單純的脫細胞血管支架材料共培養(yǎng)48 h后便可在支架材料內膜面形成一單層的內皮細胞層(圖5),但是在繼續(xù)培養(yǎng)28 d后未發(fā)現(xiàn)有明顯的細胞長入材料跡象(圖6)。

2.3.2 超聲處理后的脫細胞血管支架材料的細胞黏附性 組織學觀察同樣證實，血管內皮細胞與超聲處理后的脫細胞血管支架材料共培養(yǎng)48 h后，便可在支架材料內膜面形成一單層的內皮細胞層(圖7)；繼續(xù)培養(yǎng)7 d,可在支架材料內膜淺層發(fā)現(xiàn)內皮細胞長入(圖8)；培養(yǎng)至14 d時,支架材料內膜下層亦出現(xiàn)了內皮細胞(圖9)；培養(yǎng)至28 d時,更多的內皮細胞出現(xiàn)在支架材料內膜下層(圖10)。

3 討論

脫細胞血管支架因其具有低免疫源性、機械性能良好等優(yōu)良特性,因此，在組織工程血管研究領域有著比較廣泛的應用。然而其卻存在材料致密性高，孔隙率小，一般條件下種子細胞很難長入支架內部的缺點。因此，如何在保證支架材料機械強度的同時，使材料疏松化、多孔化一直是困擾著脫細胞血管支架材料研究領域的一個難題。

圖1 血管內皮細胞(×40) 圖2 血管內皮細胞vWF表達陽性(SP ×100) 圖3 脫細胞支架與內皮細胞共培養(yǎng)(×40 ) 圖4 超聲處理脫細胞支架與內皮細胞共培養(yǎng)(×40) 圖5 原濃度材料提取液作用后EC的生長曲線 圖6 培養(yǎng)48 h單層內皮細胞(HE×100) 圖7 培養(yǎng)28 d無內皮細胞長入(HE ×100) 圖8 培養(yǎng)48 h單層內皮細胞 圖9 培養(yǎng)7 d內膜淺層內皮細胞長入 圖10 14 d內膜下層出現(xiàn)內皮細胞 圖11 28 d更多內皮細胞出現(xiàn)在內膜下層

Fig 1 Vascular endothelial cells(VEC) (×40). Fig 2 vWF positive expression of VEC (SP ×100). Fig 3 Co-culture of EC and decellularized vascular scaffold (×40). Fig 4 Co-culture of EC and decellularized vascular scaffold treated with sonication (×40). Fig 5 Culture of monolayer EC at 48 hours. Fig 6 Culture of monolayer EC at 48 hours. Fig 7 No EC ingrowth at 28 days after culture. Fig 8 Monolayer EC ingrowth at 48 days after culture. Fig 9 Growth of EC into the superficial intima at 7 days after culture. Fig 10 EC in the subintima at 7 days after culture. Fig 11 More EC in the subintima at 28 days after culture.

超聲生物材料處理的原動力是超聲波引發(fā)的機械、流體力學、溫度效應、光電效應、聲空化等效應的綜合作用,其中聲空化往往占據(jù)主導地位。但是,不同的聲處理目的對超聲場的要求不同。因此,對超聲場有關聲學參數(shù)的優(yōu)化是該領域應用技術的關鍵。 近年來,聲空化作用引起的特殊物理和化學環(huán)境為科學家制備和加工各種組織工程生物材料提供了新的途徑[8,10-12],聲空化方法正成為制備具有特殊性能材料的一種新技術。

良好的生物力學特性和組織相容性是作為組織工程血管支架材料的重要因素。在我們前面的試驗中提示：超聲處理參數(shù)為強度300 W，間隔1 s，時長1 min，脫細胞血管材料的疏松程度和材料的生物力學強度處于一個較均衡的水平，與未經(jīng)超聲處理材料相比，超聲處理可以使兔股動脈脫細胞血管基質的膠原結構明顯疏松，孔隙率增大，同時材料機械強度無明顯降低[8]。而在本實驗中，我們通過接觸性細胞毒性試驗以及提取物細胞毒性試驗，結果表明,經(jīng)過超聲處理后脫細胞血管基質材料具有良好的體外細胞相容性。而超聲處理的脫細胞血管基質與內皮細胞的親和力進行的研究表明，超聲處理前后的脫細胞血管基質與內皮細胞共培養(yǎng)48 h后，都可在材料的表面觀察到單層的內皮細胞覆蓋。然而在繼續(xù)培養(yǎng)2周后，未經(jīng)超聲處理的材料表面仍然只有單層的內皮細胞覆蓋，其淺層及深層未見長入的內皮細胞。而與此不同的是，經(jīng)過超聲處理的材料在與內皮細胞經(jīng)過2周的共培養(yǎng)后，我們發(fā)現(xiàn)，其淺層及中層出現(xiàn)了內皮細胞的黏附和長入。二者在細胞黏附并長入材料內部的區(qū)別主要在于其膠原結構的不同。由此我們可以推斷：經(jīng)過超聲處理的脫細胞血管支架其膠原結構較未處理前明顯疏松，而這種疏松的結構為種子細胞的長入提供了必要的先決條件。另外，我們還發(fā)現(xiàn),通過4周或者更長時間的體外培養(yǎng)，超聲處理后的血管材料中心區(qū)域仍然很難發(fā)現(xiàn)有內皮細胞的長入，這些現(xiàn)象可能是由于材料深部膠原結構相對于外層仍然較致密，營養(yǎng)成分無法在材料中心充分滿足細胞生長需要等原因造成。

4 結論

本研究通過對強度為300 W超聲處理后的脫細胞血管支架材料的生物學相容性進行檢測和觀察，發(fā)現(xiàn)處理后的支架材料，其疏松化程度在明顯提高的同時，仍具有良好的生物學相容性。通過我們的研究表明，利用超聲聲空化效應可以達到為脫細胞基質類生物材料致密結構改性的目的。這一結論為今后解決脫細胞基質材料結構致密的問題提供了一定的思路。

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Experimental research of biocompatibility of the decellularized vascular scaffolds treated by ultrasound cavitation

LIUBin,LIFei,ZHANGMan-jing,LUKai-hua.

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,Xi′anCentralHospital,Xi′an710003,China)

LUKai-hua,Email:lukaihua@fmmu.edu.cn

Objective To detect the biocompatibility of decellularized vascular scaffolds after 300 watts sonication. Methods Under sterile conditions, fresh blood from the femoral artery was isolated from rabbits and then nuclease digestion was performed after treatment with repeated freezing-thawing cycles and supertension. The decellularized vascular scaffolds were formed after removal of rudimental cell debris. Ultrasonic waves at an intensity of 300 watts were used to treat the scaffolds and then the biocompatibility of the treated scaffolds was detected and observed. Results With the 300 watts intensity ultrasonic treatment, a looser structure of the scaffolds was found without apparent cytotoxcity and seed cells could grow easily inside materials. Conclusion The decellularized vascular scaffolds treated by the ultrasound cavitation method may provide a new method to obtain the decellularized vascular scaffolds with better biocompatibility.

Tissue engineering blood vessels; Decellularized vascular scaffolds; Ultrasonic; Biocompatibility

劉 賓(1977-)，男，陜西西安人，副主任醫(yī)師，副教授，博士，碩士研究生導師.

魯開化,710032，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 整形外科,電子信箱:lukaihua@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.08.018

R318.11

A

1673-7040(2016)08-0499-04

2016-05-27)