腺病毒介導(dǎo)GFP基因標(biāo)記人脂肪來源干細(xì)胞可行性研究

陽水發(fā)， 易陽艷， 黃 艷， 吳 舒， 王朝慧

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實(shí)驗(yàn)研究

腺病毒介導(dǎo)GFP基因標(biāo)記人脂肪來源干細(xì)胞可行性研究

陽水發(fā)， 易陽艷， 黃 艷， 吳 舒， 王朝慧

目的 研究腺病毒介導(dǎo)綠色熒光蛋白(GFP)基因標(biāo)記人脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)的可行性。方法 通過酶消化法獲取人ADSCs，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記物以及成脂分化誘導(dǎo)進(jìn)行鑒定。將Ad-GFP通過不同感染復(fù)數(shù)(MOI分別為25、50、100)轉(zhuǎn)染ADSCs，觀察各組轉(zhuǎn)染效率，找出最適合的轉(zhuǎn)染條件。觀察GFP標(biāo)記ADSCs后隨時(shí)間衰減速率，確定標(biāo)記效果的維持時(shí)間。結(jié)果 獲取的細(xì)胞高表達(dá)CD49d、CD90、CD105，不表達(dá)CD34、CD45、CD106，經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周現(xiàn)脂滴，油紅O染色成紅色，符合ADSCs的多種特性。MOI分別以25、50、100轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染效率分別為(77.3±4.2)%、(94.7±3.2)%、(96.3±3.0)%，MOI=50為轉(zhuǎn)染的適宜條件。GFP標(biāo)記ADSCs后，在2周內(nèi)的標(biāo)記率仍可高達(dá)55.0%，至4周后則衰減至17.0%。結(jié)論 本研究提示通過腺病毒能夠高效地介導(dǎo)GFP基因?qū)階DSCs，快速表達(dá)出蛋白產(chǎn)物，維持2～4周的標(biāo)記示蹤效果。

脂肪來源干細(xì)胞； 腺病毒； 綠色熒光蛋白； 標(biāo)記； 轉(zhuǎn)染

脂肪組織中含有大量的具有多向分化潛能的脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)[1]。由于其數(shù)量多獲取容易，使之成為理想的多能干細(xì)胞來源。作為一種間充質(zhì)干細(xì)胞，研究證實(shí)，ADSCs不僅具有強(qiáng)大的多向分化潛能[2-4]，還能合成分泌多種促血管形成細(xì)胞因子[5-6]。ADSCs因其優(yōu)良的間充質(zhì)干細(xì)胞特性，使其在組織工程構(gòu)建[7]以及干細(xì)胞治療等領(lǐng)域的探索成為研究熱點(diǎn)。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)具有高效的熒光效應(yīng)，通過適當(dāng)?shù)妮d體將GFP基因?qū)爰?xì)胞，其表達(dá)的GFP將具有標(biāo)記示蹤作用。腺病毒是目前進(jìn)行基因修飾較為常用的基因載體，通過其介導(dǎo)GFP基因?qū)階DSCs有可能是適宜選擇。自2015年3月，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)療美容科主要就腺病毒介導(dǎo)GFP標(biāo)記ADSCs的效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，摸索合適的轉(zhuǎn)染條件，并明確標(biāo)記隨時(shí)間衰減的速率。

1 對(duì)象與方法

1.1 組織來源

脂肪組織取自本科室健康成年女性腹部吸脂術(shù)后廢棄脂肪，術(shù)前征得患者同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

低糖DMEM培養(yǎng)基、FBS、0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA(美國GIBCO公司)；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、油紅O染色劑、纖維蛋白原、凝血酶(美國SIGMA公司)；鼠抗人CD34、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106多克隆抗體(美國EBIOSCIENCE公司)；腺病毒載體Ad-GFP(上海漢恒生物)；攜帶GFP基因的腺病毒(adenovirus- green fluorescent protein, Ad-GFP；上海漢恒生物)；倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.3 ADSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 ADSCs的獲取 取健康成人吸脂術(shù)后的脂肪組織10 ml，加入等體積1.0 mg/ml的Ⅰ型膠原酶溶液，混勻后37℃恒溫水浴消化40 min，定時(shí)搖勻；1000 r/min離心5 min，去除上層油脂及液體成分，加入完全培養(yǎng)基重懸后200目濾網(wǎng)過濾；再次離心，10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為(5～10)×105/L, 接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，待細(xì)胞80%融合后按1∶2胰蛋白酶消化傳代。每天以倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀況，傳至第3代供實(shí)驗(yàn)用。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs表面抗原 取第3代ADSCs, 胰蛋白酶消化，離心5 min，1000 r/min，棄上清液，加少量PBS吹打均勻；調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，將細(xì)胞懸液移入EP管(100 μl/管)，每管分別加入2種不同熒光素標(biāo)記的流式抗體各5 μl，以同型PE-IgG和FITC-IgG抗體為陰性對(duì)照；室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次以去除未結(jié)合的抗體；離心棄上清液后每管加500 μl PBS重懸均勻，行雙熒光標(biāo)記檢測(cè)。

1.3.3 ADSCs的成脂誘導(dǎo)和油紅O染色 取第3代ADSCs, 胰蛋白酶消化, 接種到置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上,待細(xì)胞貼壁融合較多時(shí)，將培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(高糖DMEM,10%FBS,1 μmol/L地塞米松,10 μmol/L胰島素, 0.5 mmol/L IBMX，200 μmol/L吲哚美辛)，陰性對(duì)照用10%FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每周換液2、3次；定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)2周后取細(xì)胞爬片；PBS清洗后4%多聚甲醛固定5 min，洗滌后加入油紅O工作液染色15 min；PBS洗滌2次后行顯微鏡觀察。

1.4 Ad-GFP轉(zhuǎn)染ADSCs效率

將狀態(tài)良好的第3代ADSCs胰酶消化，離心洗滌，加入完全培養(yǎng)基重懸，按1∶2傳代比例接種于6孔板，加完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合接近于80%，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)單孔細(xì)胞數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按感染復(fù)數(shù)(MOI)25、50、100計(jì)算每孔加入Ad-GFP(病毒滴度為1×1010pfu/ml)的體積，補(bǔ)加半量培養(yǎng)基2 h后換液，置于孵箱常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后每24 h觀察熒光強(qiáng)度，48 h時(shí)各組隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野統(tǒng)計(jì)綠色熒光標(biāo)記率。將MOI為50的轉(zhuǎn)染細(xì)胞消化，重懸后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)綠色熒光標(biāo)記率。

1.5 GFP標(biāo)記ADSCs后隨時(shí)間衰減速率

將MOI=50的轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)置于孵箱常規(guī)培養(yǎng)，3 d換液1次。在轉(zhuǎn)染后1、2、4周分別用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度。每次重復(fù)3個(gè)高倍顯微鏡視野統(tǒng)計(jì)綠色熒光標(biāo)記率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ADSCs光鏡下形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞需要約7 d融合至90%，傳代后生長迅速。至第3代ADSCs形態(tài)穩(wěn)定，為典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈細(xì)長梭形，有粗大的分支，細(xì)胞生長密集時(shí)呈現(xiàn)漩渦性(圖1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs表面抗原表達(dá)結(jié)果

選取的第3代ADSCs經(jīng)6種流式抗體結(jié)合后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示，ADSCs高表達(dá)CD49d、CD90、CD105，不表達(dá)或極低表達(dá)CD34、CD45、CD106。

2.3 ADSCs的成脂誘導(dǎo)和油紅染色結(jié)果

ADSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后見透亮脂滴開始增多變大。誘導(dǎo)2周后脂滴形成較多，融合為較大脂滴，經(jīng)油紅O染色可見脂滴被染成紅色(圖2)。

2.4 Ad-GFP轉(zhuǎn)染ADSCs效率

Ad-GFP按MOI分別為25、50、100轉(zhuǎn)染ADSCs后48 h，在熒光顯微鏡下即可觀察到強(qiáng)度較高的綠色熒光。隨MOI值增大，表達(dá)綠色熒光細(xì)胞數(shù)增多，熒光強(qiáng)度亦增強(qiáng)。通過計(jì)數(shù)得出的綠色熒光標(biāo)記百分率分別為77.3%±4.2%、94.7%±3.2%、96.3%±3.0%。MOI=50的轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP標(biāo)記率為95.4%，與計(jì)數(shù)所得數(shù)值吻合，顯示MOI=50時(shí)轉(zhuǎn)染效率已經(jīng)很高，幾乎所有ADSCs都成功標(biāo)記，繼續(xù)增大MOI值對(duì)標(biāo)記率增加有限。見圖3。

2.5 GFP標(biāo)記ADSCs后隨時(shí)間衰減速率

圖1 第3代ADSCs蘇木精-伊紅染色觀察(倒置相差顯微鏡) a.×100 b.×200 圖2 ADSCs成脂誘導(dǎo)2周油紅O染色(倒置相差顯微鏡 ×200) a. 染色前 b. 染色后 圖3 Ad-GFP轉(zhuǎn)染ADSCs效率 a. MOI=25 b. MOI=50 c. MOI=100 d. 標(biāo)記陽性率 e. MOI=50流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)記率 圖4 GFP標(biāo)記ADSCs后，隨時(shí)間衰減速率 a. 1周 b. 2周 c. 4周

Fig 1 ADSCs at 3 passages stained by hematoxylin eosin stain (Inverted phase contrast microscope). a.×100. b. ×200. Fig 2 ADSCs induced by adipogenic differentiation at 2weeks stained with Oil red O (Inverted phase contrast microscope ×200). a. before staining. b. after staining. Fig 3 Transfection efficiency of ADSCs infected with Ad-GFP. a. MOI=25. b. MOI=50. c. MOI=100. d. marking of positive rate. e. the percentage of labeled cells of MOI=50 by the flow cytometry. Fig 4 The attenuation rate after ADSCs labeled by GFP. a. 1 week. b. 2 week. c. 4 week.

腺病毒介導(dǎo)GFP導(dǎo)入ADSCs后，GFP熒光標(biāo)記率隨時(shí)間延長而減退。轉(zhuǎn)染1周后，標(biāo)記率為83.3%；轉(zhuǎn)染2周后，標(biāo)記率為55.0%；轉(zhuǎn)染4周后，標(biāo)記率為17.0%。見圖4。顯示腺病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染ADSCs后，在2周內(nèi)的標(biāo)記率仍然較高，至4周后，標(biāo)記率則衰減至較低水平。

3 討論

在諸如組織工程構(gòu)建和干細(xì)胞治療研究中，我們需要對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記示蹤，以此研究干細(xì)胞在活體組織器官中的定植和分化轉(zhuǎn)歸等機(jī)制[8]。目前對(duì)于干細(xì)胞標(biāo)記的方法有多種，對(duì)ADSCs的標(biāo)記需要滿足一定的條件，如高效、穩(wěn)定、安全、簡(jiǎn)便。GFP基因是科研工作中常用的報(bào)告基因[9]。在轉(zhuǎn)染過程中，常作為間接提示目的基因?qū)爰?xì)胞效率的標(biāo)記。通過轉(zhuǎn)染載體介導(dǎo)GFP基因?qū)階DSCs，使GFP基因在ADSCs一定時(shí)期內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，通過熒光激發(fā)可以進(jìn)行活體成像和組織切片的熒光分析，因而能對(duì)ADSCs進(jìn)行標(biāo)記示蹤。

目前常用的基因轉(zhuǎn)染載體包括病毒載體和脂質(zhì)體載體。病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高，攜帶基因較大，對(duì)宿主細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)，在當(dāng)前的科研領(lǐng)域應(yīng)用普遍。腺病毒是病毒轉(zhuǎn)染中最常用到的基因載體，其作為基因載體具有多重優(yōu)勢(shì)：轉(zhuǎn)染效率高，基因?qū)胨拗骷?xì)胞后可大量表達(dá)；可轉(zhuǎn)染非增殖期細(xì)胞；不整合入宿主染色體，不致基因突變[10-12]。通過腺病毒介導(dǎo)GFP基因標(biāo)記ADSCs是一種合理方法。

本研究通過酶消化法從人脂肪組織中獲取ADSCs，經(jīng)過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表明標(biāo)記物檢測(cè)、成脂分化誘導(dǎo)進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果表明，符合ADSCs的相關(guān)特征。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們將Ad-GFP以感染復(fù)數(shù)(MOI)為25、50、100感染ADSCs。GFP基因通過腺病毒導(dǎo)入細(xì)胞后，24 h即觀察到少量綠色熒光，48～72 h有高強(qiáng)度的綠光熒光，這說明通過重組腺病毒成功將GFP基因?qū)階DSCs，并且通過成功轉(zhuǎn)錄表達(dá)出GFP。在48 h時(shí)熒光照片顯示，MOI值增大，表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞增多。MOI=50時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)精確檢測(cè)顯示標(biāo)記率達(dá)到95%以上，而再次提高感染復(fù)數(shù)，GFP標(biāo)記率增加空間較小，說明Ad-GFP以感染復(fù)數(shù)為50即已達(dá)到理想的標(biāo)記率。

腺病毒作為基因載體轉(zhuǎn)染的一個(gè)特點(diǎn)是基因不整合到宿主細(xì)胞的基因組中，因而不產(chǎn)生突變致癌的作用，這也決定了腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染屬于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，目的基因只能在一定時(shí)期內(nèi)維持表達(dá)，之后表達(dá)逐漸消失。本研究表明，腺病毒介導(dǎo)GFP標(biāo)記ADSCs能維持2～4周的示蹤效果，在2周內(nèi)具有較好的標(biāo)記效果，超過1個(gè)月則標(biāo)記效果較差。

總之，本研究提示通過腺病毒能夠高效地介導(dǎo)GFP基因?qū)肴薃DSCs，并且進(jìn)入細(xì)胞的GFP基因能夠快速表達(dá)出大量蛋白產(chǎn)物，發(fā)揮對(duì)人ADSCs的標(biāo)記作用，且能維持2～4周的標(biāo)記示蹤效果。本研究的結(jié)果可以為人ADSCs的后續(xù)研究提供一種高效穩(wěn)定的標(biāo)記示蹤方法，如在組織工程中研究ADSCs的分化轉(zhuǎn)歸，以及在干細(xì)胞治療中研究ADSCs的定植分布等。同時(shí)，本研究亦提示腺病毒能高效率的介導(dǎo)目的基因?qū)肴薃DSCs，導(dǎo)入基因后能在較長時(shí)間內(nèi)持續(xù)過表達(dá)，因而可為人ADSCs的基因修飾提供可行的技術(shù)方式。

[1] Mizuno H, Tobita M, Uysal AC. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine[J]. Stem Cells, 2012,30(5):804-810.

[2] 高 宇, 余慶雄, 李青峰. 脂肪干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的研究進(jìn)展[J]. 組織工程與重建外科雜志, 2014(2):106-109.

[3] Li Q, Qi LJ, Guo ZK,et al. CD73+ adipose-derived mesenchymal stem cells possess higher potential to differentiate into cardiomyocytes in vitro[J]. J Mol Histol, 2013,44(4):411-422.

[4] Kajiyama H, Hamazaki TS, Tokuhara M, et al. Pdx1-transfected adipose tissue-derived stem cells differentiate into insulin-producing cells in vivo and reduce hyperglycemia in diabetic mice[J]. Int J Dev Biol, 2010,54(4):699-705.

[5] Zhu M, Zhou Z, Chen Y, et al. Supplementation of fat grafts with adipose-derived regenerative cells improves long-term graft retention[J]. Ann Plast Surg, 2010,64(2):222-228.

[6] Hsiao ST, Lokmic Z, Peshavariya H, et al. Hypoxic conditioning enhances the angiogenic paracrine activity of human adipose-derived stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2013,22(10):1614-1623.

[7] Verseijden F, Posthumus-Van SS, van Neck JW, et al. Comparing scaffold-free and fibrin-based adipose-derived stromal cell constructs for adipose tissue engineering: an in vitro and in vivo study[J]. Cell Transplant, 2012,21(10):2283-2297.

[8] 袁福康, 陸信武, 秦金保, 等. 雙標(biāo)記示蹤脂肪來源干細(xì)胞治療下肢缺血的研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2015,32(11):2676.

[9] 朱玉德, 代興亮, 趙東亮, 等. 紅色/綠色熒光蛋白示蹤膠質(zhì)瘤干祖細(xì)胞在腫瘤血管形成中的作用[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2013,30(2):297-299.

[10] Zheng YM, An ZX, Zhao XE, et al. Comparation of enhanced green fluorescent protein gene transfected and wild-type porcine neural stem cells[J]. Res Vet Sci, 2010,88(1):88-93.

[11] Tatineni S, Mcmechan AJ, Hein GL, et al. Efficient and stable expression of GFP through Wheat streak mosaic virus-based vectors in cereal hosts using a range of cleavage sites: formation of dense fluorescent aggregates for sensitive virus tracking[J]. Virology, 2011,410(1):268-281.

[12] 黃 懿， 韶云鵬， 丁留成， 等. 過表達(dá)整合素連接酶基因腺病毒體外轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2014,31(6):1373.

Feasibility study of Human adipose-derived stem cells marked with GFP gene mediated by adenovirus

YANGShui-fa,YIYang-yan,HUANGYan,WUShu,WANGZhao-hui.

(DepartmentofPlasticSurgery,SecondAffiliatedHospitalOfNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

YIYang-yan,Email:yyy0218@126.com

Objective To research the feasibility of human adipose-derived stem cells (ADSCs) marked with green fluorescent protein (GFP) gene mediated by adenovirus. Methods The ADSCs were harvested from human liposuction fat by enzymatic digestion, then identified by detecting surface antigens and inducing adipogenic differentiation. Next, the Ad-GFP was transfected to ADSCs through different MOI (25, 50, and 100). The transfection efficiency of each group was also observed to determine the optimal transfection conditions. Finally, maintenance time was determined by observing the attenuation rate after GFP gene marked ADSCs. Results The strong expression of the cells were CD49d, CD90 and CD105, while the negative expression were CD34, CD45 and CD106.Lipid droplets were generated at 2 weeks after adipogenic differentiation, and oil red O staining was positive, which was in accordance with a variety of characteristics of ADSCs. Transfection efficiency after different 25, 50, and 100 MOI were (77.3±4.2)%, (94.7±3.2)%, (96.3±3.0)% respectively, indicating that MOI=50 was the optimal condition. The transfection efficiencies of ADSCs marked by GFP were 55.0% at 2 weeks and 17.0% at 4 weeks. Conclusion This study suggests that adenovirus can efficiently mediate GFP gene into ADSCs and rapidly express the GFP gene, maintaining 2 to 4 weeks tracing effect to ADSCs.

Adipose-derived stem cells； Adenovirus; Green fluorescent protein； Mark； Transfection

江西省科技支撐計(jì)劃(2010BSA15100) 作者單位：330006 江西 南昌,南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 醫(yī)療美容科

陽水發(fā)(1989-)，男，江西宜春人，碩士研究生.

易陽艷，330000，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 醫(yī)療美容科，電子信箱：yyy0218@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.08.017

R318.08

A

1673-7040(2016)08-0495-04

2016-04-10)