用高度取向石墨烯/聚乳酸(Gr/PLLA)復(fù)合超細(xì)纖維構(gòu)建神經(jīng)導(dǎo)管

張會(huì)蘭, 易兵成, 王先流, 李碧云, 余哲泡, 婁向新, 張彥中

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620)

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用高度取向石墨烯/聚乳酸(Gr/PLLA)復(fù)合超細(xì)纖維構(gòu)建神經(jīng)導(dǎo)管

張會(huì)蘭, 易兵成, 王先流, 李碧云, 余哲泡, 婁向新, 張彥中

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620)

摘要制備了一種高度取向的石墨烯(Gr)/聚乳酸(PLLA)復(fù)合超細(xì)纖維, 并構(gòu)建了神經(jīng)導(dǎo)管, 研究了Gr/PLLA促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的協(xié)同誘導(dǎo)作用. 研究結(jié)果表明, Gr/PLLA具有較好的纖維形貌與取向度; Gr的引入提高了纖維的熱性能及力學(xué)性能; Gr加入量(≤1%)的增加及纖維取向度的提高使雪旺細(xì)胞(SCs)的黏附數(shù)量及伸展比例均呈增加趨勢(shì); Gr/PLLA纖維可促進(jìn)SCs的增殖, 雪旺細(xì)胞在96 h時(shí)達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài), 表明Gr/PLLA纖維具有較好的細(xì)胞相容性. 基于細(xì)胞形貌及軸突數(shù)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn), Gr/PLLA纖維也能促進(jìn)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12細(xì)胞)的神經(jīng)分化. 直徑為2 mm的Gr/PLLA纖維導(dǎo)管具有較好的纖維取向度和抗壓能力, 能促進(jìn)細(xì)胞沿管軸方向取向生長(zhǎng).

關(guān)鍵詞靜電紡絲; 取向纖維; 石墨烯/聚乳酸復(fù)合超細(xì)纖維; 協(xié)同效應(yīng); 神經(jīng)組織工程

周圍神經(jīng)損傷是臨床上一類普遍的組織損傷問題[1]. 目前常見的治療方法(如自體神經(jīng)移植和端對(duì)端縫合)雖然可行, 但存在供體來源有限、 供體部位功能喪失及修復(fù)距離較短等不足[2,3]. 近年來, 神經(jīng)組織工程(NTE)方法為克服上述治療方法的缺點(diǎn)實(shí)現(xiàn)理想的神經(jīng)修復(fù)效果提供了可能. 基于NTE原理, 構(gòu)建能為神經(jīng)組織的修復(fù)和再生提供一種合適微環(huán)境的仿生生物材料導(dǎo)管支架[4～6]是NTE方法實(shí)現(xiàn)促進(jìn)神經(jīng)再生的一個(gè)關(guān)鍵.

利用靜電紡絲方法制備仿生天然組織細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的納-微米超細(xì)纖維是一種常用的組織工程支架制備方法[7,8]. 研究結(jié)果表明, 靜電紡絲纖維的直徑、 取向度、 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和孔隙率等對(duì)細(xì)胞的黏附和增殖具有重要影響[7,9], 其中纖維取向度對(duì)結(jié)構(gòu)特異性組織(如神經(jīng)、 肌腱等)的構(gòu)建尤為重要[9～11]. 這是因?yàn)槿∠蚶w維能夠給細(xì)胞提供一種更好的接觸導(dǎo)向作用, 使細(xì)胞沿著纖維方向延伸生長(zhǎng), 并再生出結(jié)構(gòu)特異性組織[12～15]. 由于靜電紡絲時(shí)射流的不可控性, 使傳統(tǒng)的靜電紡絲方法(CES)所制備的取向纖維有序性較差, 影響細(xì)胞的取向生長(zhǎng)和分化[16], 因此, 制備高度取向的納-微米超細(xì)纖維對(duì)神經(jīng)組織再生具有重要意義.

在NTE支架中引入聚吡咯(PPy)[17]、 聚苯胺(PANi)[18]及多壁碳納米管(MWCNTs)[19]等導(dǎo)電性組分對(duì)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化有積極作用, 是提高NTE支架生物活性的一種有效途徑. 石墨烯(Gr)是一種由單層碳原子構(gòu)成的具有二維平面結(jié)構(gòu)的新型納米碳材料, 其良好的導(dǎo)電性及生物相容性在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛認(rèn)可[20]. 研究結(jié)果表明,Gr可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖, 調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化, 在含有Gr的纖維膜上神經(jīng)細(xì)胞具有較長(zhǎng)的神經(jīng)突[21,22]. 因此, 將Gr引入取向纖維中, 可能協(xié)同刺激神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和生物學(xué)功能發(fā)揮.

本文采用穩(wěn)定射流電紡絲方法(SJES)[23,24]制備負(fù)載Gr的高度取向PLLA復(fù)合纖維(Gr/PLLA), 研究了纖維的高取向度和Gr的引入對(duì)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的協(xié)同誘導(dǎo)作用, 表征了Gr/PLLA纖維的形貌及熱性能及力學(xué)性能; 用卷繞-熱壓方法制備出具有一定抗壓性能及高度取向的Gr/PLLA神經(jīng)導(dǎo)管并評(píng)價(jià)了其生物相容性.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

Gr(化學(xué)法, 片徑為0.5～2μm, 厚度為0.8～1.2nm), 南京先豐納米材料科技有限公司; 聚乳酸(PLLA): Mη=1×105, 醫(yī)用級(jí), 濟(jì)南岱罡生物有限公司; 三氟乙醇(TFE), 分析純, 上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司; 聚環(huán)氧乙烷(PEO): Mw1>5×106, 英國(guó)AlfaAesar公司, Mw2>6×105,Sigma-Aldrich公司;TritonX-100TM, 多聚甲醛(PFA)及無水乙醇, 分析純, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、 胎牛血清(FBS)、 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、 青霉素-鏈霉素(P/S)及0.25%胰蛋白酶,Invitrogen公司;RS-960型雪旺細(xì)胞(SCs), 上海拜力生物科技有限公司;PC12和SCSP-517, 中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù).

大連泰思曼科技有限公司TXR1020N30-30型高壓電源; 美國(guó)KDScientific公司KDS-100型微量注射泵; 上海雷磁儀器廠DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀; 日本JEOL公司JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM); 日本JEOL公司JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(SEM); 德國(guó)NetZSch儀器制造有限公司204F1型差熱分析儀; 美國(guó)Instron公司Instron-3343型萬能材料測(cè)試機(jī); 日本Nikon公司Nikon80i型倒置顯微鏡; 美國(guó)Thermo公司MK3型酶標(biāo)儀.

1.2取向Gr/PLLA復(fù)合纖維的制備

未經(jīng)分散的Gr粉末呈明顯的多層結(jié)構(gòu)(圖S1, 見本文支持信息). 由于單層或寡層Gr具有較高的電導(dǎo)率[25,26], 可以通過導(dǎo)電率的變化研究石墨烯的分散程度. 配制濃度為0.5mg/mL的Gr懸浮液, 并進(jìn)行超聲處理, 每隔0.5h測(cè)定其電導(dǎo)率. 當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到3h時(shí), 其電導(dǎo)率基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài). 對(duì)超聲3h的Gr用透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行觀察, 發(fā)現(xiàn)其為寡層結(jié)構(gòu). 因此可以認(rèn)為3h為最佳超聲時(shí)間.

將超聲分散的Gr按照0, 0.1%, 0.5%和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例分別加入到5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的PLLA/PEO紡絲液中(PLLA與PEO質(zhì)量比為4∶1,PEO分子量為Mw1, 溶劑為三氟乙醇), 充分?jǐn)嚢柽^夜后進(jìn)行SJES電紡絲. 將PEO的分子量換成Mw2, 按照傳統(tǒng)靜電紡絲方法制備不含石墨烯的半取向PLLA纖維作為對(duì)照. 靜電紡絲參數(shù): 電壓6～7kV; 接收距離19cm; 滾筒轉(zhuǎn)速1000r/min; 注射速率1mL/h; 環(huán)境濕度: 40%～60%; 環(huán)境溫度: 18～25 ℃.

1.3取向Gr/PLLA復(fù)合纖維的理化特性表征

將纖維樣品噴金后進(jìn)行SEM觀察, 用ImageJ軟件對(duì)SEM照片中的纖維直徑進(jìn)行測(cè)量, 用快速傅里葉變換(FFT)對(duì)纖維取向度進(jìn)行分析[27], 通過TEM觀察Gr在纖維中的分散狀態(tài), 加速電壓為200kV. 采用英國(guó)雷尼紹inVia-Reflex型拉曼(Raman)光譜測(cè)試儀檢測(cè)纖維中的Gr成分,He-Ne激發(fā)器, 激發(fā)波長(zhǎng)633nm, 輸出功率10mW.

采用Instron-3343型萬能材料測(cè)試機(jī)將在1000r/min接收轉(zhuǎn)速條件下紡絲2h后收集到的纖維束在溫度20 ℃及濕度50%條件下進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試, 拉伸參數(shù)為: 兩夾間距30mm, 拉伸速率20mm/min, 力傳感器容量50N. 每組有效測(cè)試數(shù)量為5個(gè), 取平均值. 由拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線獲取拉伸強(qiáng)度、 模量、 斷裂應(yīng)變等力學(xué)性能.

利用NetZSch204F1型差熱分析儀對(duì)所制備的纖維進(jìn)行差熱分析(DSC), 即以10 ℃/min的速率從20 ℃升高到100 ℃, 測(cè)定其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg),N2氣氣氛. 同時(shí)采用熱重分析(TGA)檢測(cè)其耐熱性能, 并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到微熵?zé)嶂貓D(DTG).

1.4取向Gr/PLLA復(fù)合纖維的生物學(xué)特性

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)將取向纖維于室溫下干燥24h以上, 再用紫外光殺菌12h. 將纖維膜剪成方形并包裹在圓形玻片(φ=15mm)上, 用PBS緩沖液沖洗3次, 每次15min, 然后用培養(yǎng)基孵育過夜. 實(shí)驗(yàn)中設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 分別為半取向、PLLA、 0.1%Gr/PLLA、 0.5%Gr/PLLA、 1%Gr/PLLA組(后4組為SJES法制備的高度取向組), 每組重復(fù)4次, 并用組織培養(yǎng)板(TCP)作為對(duì)照. 將復(fù)蘇好的SCs懸液按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到24孔板上, 然后置于培養(yǎng)箱(37 ℃,CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%)中培養(yǎng), 隔天更換培養(yǎng)液.SCs培養(yǎng)基配方:DMEM低糖培養(yǎng)基+10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清+1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素-鏈霉素(P/S).

1.4.2SCs的黏附和增殖在室溫下將培養(yǎng)2, 5, 8h的SCs用DAPI和羅丹明-鬼筆環(huán)肽分別對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞骨架進(jìn)行染色. 在染色前先將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出, 用4%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的PFA固定細(xì)胞30min, 棄去上清液并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次, 每次5min; 用0.1%TritonX-100TM透膜處理20min并清洗; 再用10%的山羊血清封閉30min, 清洗以除去背景色. 按照說明書每孔加入約3.3μg/200μL的羅丹明-鬼筆環(huán)肽溶液, 避光處理20min, 棄去溶液并用PBS洗滌3次; 加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液, 避光放置10min, 清洗, 完成染色. 用Nikon80i型倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形貌, 并計(jì)數(shù)其在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)的黏附數(shù)量與伸展比例. 用細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)培養(yǎng)24, 96, 168h時(shí)的細(xì)胞增殖情況.

1.4.3SCs的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)SCs是一種膠質(zhì)細(xì)胞, 在適宜環(huán)境下表達(dá)GFAP. 為確定Gr/PLLA復(fù)合纖維對(duì)SCs蛋白表達(dá)的影響, 對(duì)GFAP進(jìn)行免疫熒光染色. 在去除背景色后加入用10%的山羊血清稀釋200倍的一抗(山羊來源的GFAP, 200μL/孔), 4 ℃處理12h; 用PBS清洗之后用稀釋200倍的二抗(鼠抗羊)避光培養(yǎng)2h; 用PBS清洗之后, 再用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色并使用PBS清洗, 最后每孔加入10μL的抗熒光衰減封片劑, 用倒置熒光顯微鏡觀察熒光.

1.4.4PC12細(xì)胞的分化PC12細(xì)胞可分泌去甲腎上腺素及多巴胺等, 在NGF的刺激下可發(fā)生分化. 采用RPMI1640培養(yǎng)基+15%(體積分?jǐn)?shù))馬血清+2.5%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清+1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素-鏈霉素培養(yǎng)基, 將PC12細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到24孔板上, 并用50ng/mL的NGF誘導(dǎo)4d. 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理并用DAPI和羅丹明-鬼筆環(huán)肽進(jìn)行染色, 并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞分化比例.

1.5Gr/PLLA神經(jīng)導(dǎo)管的制備

將纖維沿一定方向卷繞在直徑為2mm的不銹鋼圓棒上[圖1(A)], 于55 ℃下熱處理15min. 用SEM觀察導(dǎo)管的形貌. 將40μL含有5×104個(gè)細(xì)胞的SCs懸液注射到長(zhǎng)度為5mm的神經(jīng)導(dǎo)管中, 置于含有培養(yǎng)基的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)[圖1(B)], 用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況, 測(cè)試前需將導(dǎo)管轉(zhuǎn)移到新的孔板中, 以去除孔板中殘留細(xì)胞的影響.

Fig.1　Preparation of the oriented nerve conduit(A) and schematic of cell seeding into nerve conduit(B)

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Origin8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表達(dá), p<0.05表示具有顯著性差異, p<0.01表示具有極顯著性差異.

2結(jié)果與討論

Fig.2　SEM images(A1—E1), pixel intensity plots against the angle of acquisition(A2—E2) and histograms of diameter distribution(A3—E3) of electrospun fibers through CES(A1—A3) and SJES(B1—E3) (A1—A3) Semi-oriented; (B1—B3) PLLA; (C1—C3) 0.1%Gr/PLLA; (D1—D3) 0.5%Gr/PLLA; (E1—E3) 1%Gr/PLLA. Insets in (A1—E1) are FFT output images.

2.1取向Gr/PLLA復(fù)合纖維的表征

2.1.1形貌觀察圖2(A1～E1)為傳統(tǒng)靜電紡絲方法(CES)及SJES法制備的半取向PLLA及高度取向PLLA, 0.1%Gr/PLLA, 0.5%Gr/PLLA和1%Gr/PLLA纖維的SEM形貌圖. 各纖維形貌較好, 沒有微珠與粘連等缺陷, 但取向性有較大差異. 圖2(A1～E1)為用快速傅里葉轉(zhuǎn)換(FFT)表征的所對(duì)應(yīng)纖維的各向異性和取向度, 峰越高越陡表示其取向度越好[28]. 可見SJES制備的取向纖維比CES制備的纖維具有更好的取向度[29], 與SEM結(jié)果一致. 由圖2(A2～E2)可知, 半取向纖維的平均直徑為(1.54±0.20)μm, 4種高度取向纖維的直徑分別為(1.50±0.23), (1.48±0.21), (1.47±0.23), (1.50±0.17)μm, 呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(shì)[30]. 這是因?yàn)閷?dǎo)電材料加入到電紡絲溶液中會(huì)提高電紡溶液的導(dǎo)電性, 有利于紡絲過程中產(chǎn)生更大的靜電拉伸力使纖維直徑減小, 當(dāng)Gr加入量增加到1%時(shí), 紡絲液黏度的增加使纖維直徑增加[31].

Fig.3　TEM images of Gr/PLLA fibers containing varied amounts of Gr prepared by SJES(A) PLLA; (B) 0.1%Gr/PLLA; (C) 0.5%Gr/PLLA; (D) 1%Gr/PLLA.

Fig.4　Raman spectra of Gr/PLLA fibers containing varied amounts of Gr prepared by SJES a. Gr; b. PLLA; c. 0.1%Gr/PLLA; d. 0.5%Gr/PLLA; e. 1%Gr/PLLA.

2.1.2Gr/PLLA復(fù)合纖維的結(jié)構(gòu)與成分分析圖3為不同電紡纖維的TEM照片. 可以看出,Gr在纖維內(nèi)部和表面分散均勻. 圖4的拉曼光譜顯示, 只在含有Gr的纖維中檢測(cè)到石墨烯的特征峰D峰(～1340cm-1)和G峰(～1581cm-1), 且Gr的載入量越多峰特征越明顯[32,33], 表明Gr已成功復(fù)合于PLLA基體纖維中.

2.1.3Gr/PLLA復(fù)合纖維的力學(xué)性能圖5(A)為高度取向Gr/PLLA復(fù)合纖維的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線. 拉伸強(qiáng)度及楊氏模量如圖5(B)所示. 可以看到, 隨著Gr加入量的增大, 纖維的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量均呈現(xiàn)先增大后降低的現(xiàn)象, 力學(xué)性能存在臨界點(diǎn)(0.1%Gr/PLLA). 這可能與Gr在纖維中的分散狀態(tài)有關(guān): 當(dāng)Gr用量為0.1%時(shí),Gr在聚合物溶液中分散良好(呈單層或寡層分散), 具有較好的界面交互作用, 有助于力學(xué)性能的提高; 當(dāng)Gr含量過高(>0.1%)時(shí), 可能出現(xiàn)Gr的堆積現(xiàn)象, 不利于應(yīng)力傳遞并增加應(yīng)力集中點(diǎn), 導(dǎo)致力學(xué)性能下降[33].

Fig.5　Typical tensile stress-strain curves(A), tensile strength and Young’s modulus(B) of the well-aligned Gr/PLLA fibers a. PLLA; b. 0.1%Gr/PLLA; c. 0.5%Gr/PLLA; d. 1%Gr/PLLA.

2.1.4Gr/PLLA復(fù)合纖維的熱性能圖6(A)為Gr/PLLA復(fù)合纖維的DSC圖. 由圖6(A)可知,PLLA, 0.1%Gr/PLLA, 0.5%Gr/PLLA及1%Gr/PLLA纖維的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)均在60 ℃以上, 并依次略有提高(表1), 說明Gr納米片層的引入增加了PLLA分子鏈段的運(yùn)動(dòng)難度. 圖6(B)和(C)分別為Gr/PLLA復(fù)合纖維的TGA及DTG分析結(jié)果. 隨著Gr含量的增加, 在達(dá)到相同質(zhì)量損失及最大分解率的溫度均在不斷增加, 0.1%Gr的添加量即可使分解20%和50%的溫度提高近20 ℃, 說明Gr的引入大大提高了PLLA的耐熱性, 與文獻(xiàn)[34,35]研究結(jié)果一致.Gr作為納米填充材料具有很好的熱穩(wěn)定性及導(dǎo)熱率[36],Gr還可通過屏蔽效應(yīng)及阻礙揮發(fā)性分解物的揮發(fā)來延遲PLLA的熱降解[37].

Fig.6　DSC thermogram(A), TGA curves(B), and DTG curves(C) of well-aligned Gr/PLLA fibersa. PLLA; b. 0.1%Gr/PLLA; c. 0.5%Gr/PLLA; d. 1%Gr/PLLA.Table 1　Thermal data of well-aligned Gr/PLLA fibers

SampleDSCTGATg/℃Temperatureof20%massloss/℃Temperatureof50%massloss/℃Temperatureofmaximumrateofdegradation/℃ PLLA61.6259288286.6 0.1%Gr/PL-LA62.1278307312.6 0.5%Gr/PL-LA62.5296319319.1 1%Gr/PLLA63.6304325329.6

2.2取向Gr/PLLA復(fù)合纖維的生物學(xué)特性

2.2.1SCs在取向Gr/PLLA復(fù)合纖維支架上的黏附與增殖SCs是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的一類重要膠質(zhì)細(xì)胞, 本文選取SCs來評(píng)價(jià)其在高度取向的Gr/PLLA復(fù)合纖維上的黏附與增殖特性. 將SCs種植到TCP及不同纖維支架上, 在培養(yǎng)2, 5, 8h時(shí)的倒置熒光顯微鏡圖片(圖7)顯示,SCs分為圓形和延伸形, 并且其比例與細(xì)胞生長(zhǎng)所依附的纖維材料有關(guān). 為進(jìn)一步量化SCs的黏附情況, 對(duì)黏附細(xì)胞的密度[圖8(A)]及延伸形細(xì)胞的比例[圖8(B)]進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 結(jié)果表明, 與TCP和半取向纖維相比, 高度取向的Gr/PLLA復(fù)合纖維更有利于細(xì)胞的黏附, 尤其是在細(xì)胞種植8h時(shí)更為明顯. 纖維取向度及Gr的含量增加能夠顯著促進(jìn)SCs的伸長(zhǎng), 說明Gr的引入及纖維的高取向度對(duì)SCs的黏附具有協(xié)同促進(jìn)作用. 用CCK-8試劑盒檢測(cè)SCs在TCP及不同纖維支架上培養(yǎng)24, 96, 168h時(shí)的細(xì)胞增殖情況(圖9). 從24h到96h, 細(xì)胞數(shù)量增加明顯, 表明SCs在各取向纖維上均可較好生長(zhǎng); 從96h到168h, 細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)平穩(wěn)生長(zhǎng)狀態(tài), 組間數(shù)據(jù)無顯著性差異, 表明Gr/PLLA纖維在Gr含量低于1%時(shí)均具有較好的細(xì)胞相容性. 由圖7細(xì)胞生長(zhǎng)96h時(shí)的形貌可見, 細(xì)胞在TCP上呈無規(guī)生長(zhǎng), 在半取向纖維上有一個(gè)主要方向, 而在高度取向纖維上細(xì)胞僅沿一個(gè)方向(纖維方向)進(jìn)行延伸. 為了對(duì)細(xì)胞取向進(jìn)行量化, 用FFT方法表征了細(xì)胞的取向度(圖S2, 見本文支持信息), 可以看出, 細(xì)胞取向峰值由TCP、 半取向纖維、PLLA纖維到1%Gr/PLLA纖維分別為0.78, 1.47, 1.92, 1.91, 細(xì)胞在高度取向的纖維上的取

Fig.7　Fluorescent images of SCs cultured on TCP(A1—A5), semi-oriented fibers(B1—B5), PLLA fibers(C1—C5), 0.1%Gr/PLLA fibers(D1—D5), 0.5%Gr/PLLA fibers(E1—E5) and 1%Gr/PLLA fibers(F1—F5) for 2 h(A1—F1), 5 h(A2—F2), 8 h(A3—F3), 24 h(A4—F4) and 96 h(A5—F5) F-actin(red) and nuclei(blue) of cells were stained by Rhodamine-phalloidin and DAPI, respectively.

Fig.8　Adherent cell density(A) and elongation percentage(B) on TCP, semi-oriented, PLLA, 0.1%Gr/PLLA, 0.5%Gr/PLLA and 1%Gr/PLLA substrates after seeding SCs for 2, 5 and 8 h TCP; Semi-oriented; PLLA; 0.1%Gr/PLLA; 0.5%Gr/PLLA; 1%Gr/PLLA. * p<0.05; ** p<0.01.

Fig.9　Proliferation of SCs on TCP, semi-oriented, PLLA, 0.1%Gr/PLLA, 0.5%Gr/PLLA and 1%Gr/PLLA substrates after culturing the SCs for 24, 96 and 168 h * p<0.05.

向性最優(yōu), 表明高度取向纖維具有更好的導(dǎo)向作用, 促進(jìn)SCs沿纖維方向延伸生長(zhǎng).

2.2.2SCs的GFAP表達(dá)SCs在神經(jīng)再生中可以形成髓鞘, 從而起到一定的軸突保護(hù)作用, 促進(jìn)周圍神經(jīng)[38]和中樞神經(jīng)[39]的再生. 研究發(fā)現(xiàn), 在神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)神經(jīng)再生作用研究中,SCs直接與高度取向纖維緊密接觸[12]. 因此, 檢測(cè)SCs在與高度取向的含石墨烯的PLLA纖維接觸時(shí)的功能表達(dá)(如GRAP蛋白表達(dá))對(duì)了解SCs的功能特性十分重要. 由圖10可見, 在不同基底上培養(yǎng)96h時(shí)的SCs全部表達(dá)GFAP, 表明接觸導(dǎo)向和Gr的引入對(duì)SCs的功能表達(dá)無明顯影響.

Fig.10　Fluorescent images of GFAP stained SCs cultured on TCP(A), semi-oriented fibers(B), PLLA fibers(C), 0.1%Gr/PLLA fibers(D), 0.5%Gr/PLLA fibers(E) and 1%Gr/PLLA fibers(F) for 96 h Green: GFAP; blue: nuclei of cells.

2.3PC12細(xì)胞的分化

用PC12細(xì)胞評(píng)價(jià)了纖維取向度及Gr的引入對(duì)其分化的協(xié)同效應(yīng).PC12是一種神經(jīng)瘤細(xì)胞, 在沒有突觸時(shí)是未分化狀態(tài), 有突觸時(shí)表示處于分化狀態(tài). 由圖11可見, 隨著Gr含量的增加及纖維取向

Fig.11　Fluorescent images of PC12 cells cultured on TCP(A), semi-oriented fibers(B), PLLA fibers(C), 0.1%Gr/PLLA fibers(D), 0.5%Gr/PLLA fibers(E) and 1%Gr/PLLA fibers(F) for 96 h F-actin(red) and nuclei of cells(blue) were stained by Rhodamine-phalloidin and DAPI, respectively. The arrows were pointed to differentiated neurites.

Fig.12　Percentage of neurite-bearing PC12 cells after being induced on different substrates for 96 h a. TCP; b. Semi-oriented; c. PLLA; d. 0.1%Gr/PLLA; e. 0.5%Gr/PLLA; f. 1%Gr/PLLA. ** p<0.01.

度的提高, 分化的細(xì)胞數(shù)量也隨之增加, 且神經(jīng)突沿電紡纖維的方向伸展. 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖12), 含有神經(jīng)突的PC12細(xì)胞比例在半取向纖維上的分化比例僅為(4±0.82)%, 而在1%Gr/PLLA纖維上的分化比例為(16.75±0.96)%, 分化效率提高了4倍左右. 表明Gr的加入及纖維取向度的提高對(duì)PC12的細(xì)胞分化也具有協(xié)同促進(jìn)作用.

2.4基于取向Gr/PLLA復(fù)合纖維的神經(jīng)導(dǎo)管的性能評(píng)價(jià)

制備神經(jīng)導(dǎo)管的傳統(tǒng)方法為卷繞-縫合法[40], 這類導(dǎo)管抗壓性能較差, 而且對(duì)纖維取向度具有一定的破壞作用. 本文采用卷繞-熱壓法制備的導(dǎo)管則可避免上述不足, 由于選取的熱壓溫度(55 ℃)低于PLLA纖維的Tg(表1), 可避免高溫引起的纖維熔融, 使取向纖維的形貌得以保持. 圖13(A)為用半取向纖維、 高度取向PLLA纖維、 1%Gr/PLLA高度取向纖維在55 ℃下熱壓15min后制備的纖維軸向取向神經(jīng)導(dǎo)管(內(nèi)徑2mm, 壁厚0.3mm). 用CCK-8試劑盒檢測(cè)SCs的增殖情況, 結(jié)果表明, 不同組之間無顯著差異, 與細(xì)胞在二維平面支架上的結(jié)果一致. 對(duì)導(dǎo)管內(nèi)部的細(xì)胞進(jìn)行DAPI和羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在高度取向的導(dǎo)管內(nèi)沿纖維方向伸展[圖13(B～D), 其中的插圖為細(xì)胞種植前導(dǎo)管內(nèi)壁纖維的SEM形貌照片], 說明三維狀態(tài)下的Gr/PLLA纖維具有良好細(xì)胞相容性和導(dǎo)向生長(zhǎng)作用, 為Gr/PLLA導(dǎo)管用于體內(nèi)神經(jīng)再生提供了可能.

Fig.13　Digital photograph of different types of nerve conduits fabricated by reeling-heating method(A) and morphologies of Schwann cells after being cultured with Semi-oriented(B), PLLA(C) and 1%Gr/PLLA conduits(D) for 96 h Insets of (B—D): SEM images of the nerve conduits. F-actin(red) and nuclei of cells(blue) were stained by Rhodamine-phalloidin and DAPI, respectively.

3結(jié)論

本文采用穩(wěn)定射流電紡絲方法制備了直徑約1.5μm的不同石墨烯含量(≤1%)的Gr/PLLA超細(xì)復(fù)合纖維. 隨著Gr加入量的增加, 復(fù)合纖維的力學(xué)性能呈現(xiàn)先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì), 而熱學(xué)性能明顯增強(qiáng).Gr的加入及纖維取向度的提高對(duì)SCs的黏附具有協(xié)同作用, 有利于細(xì)胞沿纖維方向伸展. 該支架材料有利于細(xì)胞的增殖, 且種植96h后的SCs仍全部表達(dá)GFAP, 表明該材料具有較好的細(xì)胞相容性. 此外, 該高度取向Gr/PLLA纖維對(duì)PC12細(xì)胞的分化也具有協(xié)同效應(yīng). 利用卷繞-熱壓的方法在55 ℃及15min條件下制備出內(nèi)徑為2mm的神經(jīng)導(dǎo)管的纖維形貌較好、 取向度較高, 有利于SCs的增殖及取向生長(zhǎng). 這些結(jié)果為研究Gr/PLLA導(dǎo)管體內(nèi)的神經(jīng)再生作用提供了可能.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150958.

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HighlyAlignedUltrafineFibersof

Graphene/Poly(L-lacticacid)(Gr/PLLA)

(Ed.:W,Z)

?SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.51073032, 31570969),theNaturalScienceFoundationProjectofShanghai,China(No.15ZR1400500)andtheKeyBasicResearchFoundationofShanghaiCommitteeofScienceandTechnology,China(No.14JC1490100).

doi:10.7503/cjcu20150958

收稿日期:2015-12-16. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-04-15.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 51073032, 31570969)、 上海市自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 15ZR1400500)和上海市科委基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 14JC1490100)資助.

中圖分類號(hào)O631.1+1; Q28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

CompositefortheConstructionofNerveConduit?

ZHANGHuilan,YIBingcheng,WANGXianliu,LIBiyun,YUZhepao,LOUXiangxin,ZHANGYanzhong*

(College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China)

AbstractHighly aligned ultrafine fibers of graphene/poly(L-lactic acid)(Gr/PLLA) composite were prepared for studying the synergistic effect of fiber orientation degree and Gr incorporation on nerve cell growth and differentiation, from which nerve conduits by reeling-heating the aligned Gr/PLLA fibers were fabricated for potential neural tissue engineering applications. The results showed that the Gr/PLLA fibers made by stable jet electrospinning(SJES) had higher degree of fiber alignment. Incorporation of Gr improved the thermal and mechanical properties of the PLLA fibers. Increasing the Gr content and fiber orientation degree gave rise to increased adhesion number and elongation percentage of the Schwann cells(SCs). All the fiber scaffolds could promote SCs to proliferate well and cells growth reached the best state at 96 h, indicating appropriate cytocompatibility of the Gr/PLLA fibers. In addition, it was found the aligned Gr/PLLA fibers also promoted the neural differentiation of PC12 cells. The nerve conduits with inner diameter of 2 mm made of Gr/PLLA fibers showed good axial fiber orientation degree and pressure-resistance ability, and could promote cell growth directionally.

KeywordsElectrospinning; Aligned fiber; Ultrafine fibers of grapheme/poly(L-lactic acid) composite; Synergistic effect; Neural tissue engineering

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 張彥中, 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事生物醫(yī)學(xué)材料研究.E-mail:yzzhang@dhu.edu.cn