鹽酸阿霉素分子印跡傳感器的制備及識別特性

張　燕, 鄭　晶, 王　娟, 郭滿棟

(山西師范大學化學與材料科學學院, 臨汾 041004)

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鹽酸阿霉素分子印跡傳感器的制備及識別特性

張燕, 鄭晶, 王娟, 郭滿棟

(山西師范大學化學與材料科學學院, 臨汾 041004)

摘要采用自組裝以及電聚合的方法, 在磷酸鹽緩沖液(PBS)中以3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)為功能單體, 鹽酸阿霉素(DOX)為模板, 在金電極表面電聚合制備DOX印跡敏感膜(MIPs), 構(gòu)建了一種選擇性檢測DOX的分子印跡電化學傳感器. 采用循環(huán)伏安法(CV)及交流阻抗法(EIS)對其性能進行了表征. 優(yōu)化實驗條件后, 在含0.005 mol/L K3 [Fe(CN)6]及0.1 mol/L KCl的PBS中, 應用差分脈沖伏安法(DPV)測試了該傳感器的響應性能. 實驗結(jié)果表明, 該傳感器檢測DOX的線性范圍為4.0×10-7～1.0×10-6mol/L, 相關(guān)系數(shù)為0.9967, 檢出限(S/N=3)達6.5×10-8mol/L; 采用電化學洗脫法可使傳感器再生, 對DOX的測定具有良好重現(xiàn)性及穩(wěn)定性; 該傳感器對于干擾物長春堿、 放線菌素D及5-氟尿嘧啶有微弱的電流響應, 顯示出良好的選擇性. 將該傳感器用于人體血樣中鹽酸阿霉素的分析, 回收率為96.0%～106.7%, 表明其具有潛在的實用價值.

關(guān)鍵詞分子印跡聚合物; 電化學傳感器; 3,4-乙烯二氧噻吩; 鹽酸阿霉素

Fig.1　Structures of DOX and EDOT

鹽酸阿霉素(DOX, 結(jié)構(gòu)式見圖1)屬蒽環(huán)類抗生素, 是一種抗腫瘤藥物, 抗瘤譜較廣, 臨床上用于治療急性白血病、 惡性淋巴瘤、 乳腺癌、 肺癌、 卵巢癌、 骨及軟組織肉瘤、 腎母細胞瘤、 神經(jīng)母細胞瘤、 膀胱癌、 甲狀腺癌、 前列腺癌、 頭頸部鱗癌、 睪丸癌、 胃癌和肝癌等. 它在人體內(nèi)的存在量直接影響人體健康狀況, 因此構(gòu)建一種能對血樣中鹽酸阿霉素進行快速、 靈敏、 準確的檢測方法, 在與其相關(guān)疾病的快速有效診斷上具有重要的實際價值. 目前, 檢測DOX的方法主要有高效液相色譜法[1], 毛細管電泳法[2], 熒光法[3]及流動注射化學發(fā)光法[4]等, 這些方法普遍存在儀器操作復雜、 耗時且高成本等不足, 因此研究高效、 快速且簡單的DOX檢測方法仍有必要.

分子印跡電化學傳感器[5～10]因其靈敏度高、 選擇性好及性能穩(wěn)定等優(yōu)點[11], 已逐漸成為電化學分析法中極有潛力的研究對象, 其中電流型傳感器應用最廣. 相比于傳統(tǒng)聚合法[12～14], 電化學聚合法因?qū)τ≯E膜厚度及多孔性的可控性[15～17]使其近年來得到迅速發(fā)展. 本文采用電聚合3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT, 結(jié)構(gòu)式見圖1)制備了導電聚合膜聚3,4-乙烯二氧噻吩(PEDOT). 以PEDOT[18]為功能單體, 鹽酸阿霉素為模板分子, 構(gòu)建了鹽酸阿霉素分子印跡傳感器. 與文獻[19]報道的浸蠟石墨電極伏安法相比, 本傳感器響應快、 成本低、 選擇性良好且具有更低的檢出限, 可滿足鹽酸阿霉素痕量分析的要求. 將其初步應用于測定人體血清中鹽酸阿霉素含量, 獲得了較滿意的結(jié)果.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

鹽酸阿霉素(揚子江藥業(yè)有限公司); 3,4-乙烯二氧噻吩(合肥博美生物科技有限責任公司); 殼聚糖(國藥集團化學試劑有限公司); 氯金酸(武漢鑫思銳科技有限公司); 檸檬酸鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司); 磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉(天津市申泰化學試劑有限公司)配成不同pH值的PBS緩沖液. 所用試劑均為分析純, 實驗用水為去離子水. 實驗過程均在室溫下進行.

LK2005A型電化學工作站(天津市蘭力科化學電子高技術(shù)有限公司);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);JSM-7500F型掃描電子顯微鏡(日本電子公司);pHS-3C型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠). 電化學實驗采用三電極系統(tǒng): 金電極為工作電極(d=2mm);Ag/AgCl為參比電極; 鉑電極為對電極.

1.2實驗過程

1.2.1分子印跡膜傳感器的制備向50mL去離子水中加入0.35mLHAuCl4溶液, 加熱沸騰后快速滴加3mL質(zhì)量分數(shù)為1%的檸檬酸鈉溶液, 攪拌30min, 待溶液變?yōu)樽霞t色后移去熱源, 再攪拌10min, 得到納米金溶膠[20]. 取200μL納米金加入殼聚糖溶液中, 超聲溶解, 制得CS-AuNPs混合液. 移取3μLCS-AuNPs混合液滴涂于基體電極表面, 于室溫下晾干后, 將其置于含4×10-3mol/LEDOT和1×10-5mol/L鹽酸阿霉素的PBS緩沖溶液(pH=7.23)中, 以50mV/s的速率在-0.2～1.5V電位窗口內(nèi)電聚合7圈, 得到嵌有鹽酸阿霉素分子的導電聚合膜電極. 經(jīng)電化學方法洗脫, 除去鑲嵌在導電聚合膜內(nèi)的鹽酸阿霉素模板, 制得分子印跡聚合膜傳感器, 其示意圖見Scheme1.

Scheme 1　Schematic diagram for the preparation of the MIP electrode

在相同條件下不加模板分子制備了非印跡膜傳感器. 將制得的傳感器保存于4 ℃冰箱中, 備用.

1.2.2電化學測試以鐵氰化鉀為電化學探針對鹽酸阿霉素進行差分脈沖伏安法(DPV)檢測, 檢測電位窗口為1.2～1.8V, 電位增量為4mV, 脈沖振幅為50mV, 脈沖寬度為50mV. 測試底液為含0.1mol/LKCl和5mmol/LK3[Fe(CN)6]的磷酸緩沖溶液(pH=7.23).

2結(jié)果與討論

2.1電化學制備分子印跡聚合膜

為模擬血液的pH環(huán)境[21], 將基底電極置于含4.0mmol/L3,4-乙烯二氧噻吩的PBS溶液(pH=7.23)中, 在-0.2～1.5V聚合電位內(nèi)以50mV/s的速率掃描聚合10圈, 得到導電聚合膜電極PEDOT/AuNPs-CS/Au/CME. 圖2(A)為EDOT在基底金電極上電聚合過程的循環(huán)伏安(CV)曲線,

Fig.2　CV curves for the electrochemical polymerization of EDOT in the absence(A) and presence(B) of DOX in PBSScan rate: 50 mV/s; cycling number: (A) 10; (B) 7.

可見EDOT的電聚合為不可逆過程. 電流響應隨掃描圈數(shù)的增多逐漸增大, 表明電極表面已逐漸形成一層致密導電聚合膜. 圖2(B)為加入模板分子DOX后的EDOT電聚合曲線, 與圖2(A)相比并無顯著差異, 表明DOX的存在不干擾EDOT的電聚合.

2.2印跡膜的表征

2.2.1循環(huán)伏安法表征以5mmol/LK3[Fe(CN)6]溶液為電化學探針, 采用循環(huán)伏安法對制備的分子印跡膜傳感器進行了表征, 結(jié)果如圖3(A)所示. 在基底金電極上觀察到1對明顯的氧化還原峰. 在電極表面電聚合3,4-乙烯二氧噻吩后, 電流響應明顯增大[圖3(A)曲線b]. 當CS-AuNPs復合材料修飾到電極表面后, 電流響應進一步提高[圖3(A)曲線c]. 而當電極表面形成MIPs薄膜后, 電流響應迅速下降[圖3(A)曲線d]. 這可能是由于K3[Fe(CN)6]無法穿過聚合物層到達電極表面所致, 但由于功能單體PEDOT是一種導電聚合物, 故此時的電流響應仍比裸電極大. 洗脫模板后,K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰電流又呈現(xiàn)增加趨勢[圖3(A)曲線e], 表明模板洗脫后形成的識別位點可促進電子傳輸, 使K3[Fe(CN)6]更容易通過孔穴到達電極表面.

Fig.3　CV curves of the electrodes in 0.1 mol/L KCl containing 5 mmol/L K3[Fe(CN)6](A) and electrochemical impedance spectroscopy of the electrodes(B) (A) a. Au/CME; b. PEDOT/Au/CME; c. AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME; d. DOX-MIPs/AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME; e. MIPs/AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME; f. NMIPs/AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME. (B) ■ Au/CME; ▼ DOX-MIPs/AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME; ● PEDOT/Au/CME; ▲ AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME.

2.2.2交流阻抗法表征由電化學阻抗譜(EIS)[圖3(B)]可見, 裸金電極的Nyquist圖基本呈線性, 表明裸電極表面不存在阻擋電子傳輸?shù)奈镔|(zhì), 鐵氰根離子迅速到達電極表面發(fā)生電子傳遞反應. 電聚合PEDOT后, 半圓的直徑明顯下降, 表明PEDOT層可促進[Fe(CN)6]3-/4-的電子轉(zhuǎn)移. 當CS-AuNPs修飾到電極表面后, 半圓直徑進一步下降, 表明CS-AuNPs納米復合物能提高電導率. 然而, 當MIPs修飾到電極表面后, 電阻明顯增大, 表明電極上形成了印跡膜, 并進一步抑制了氧化還原探針到達電極表面. 以上結(jié)果與循環(huán)伏安法所得結(jié)果一致.

綜上所述, 循環(huán)伏安實驗和阻抗譜實驗均證實了鹽酸阿霉素在聚合膜中的印跡效應.

Fig.4　SEM images of MIP-modified electrode(A), eluted electrode(B) and NIP-modified electrode(C)

2.2.3不同電極的SEM表征不同電極的掃描電子顯微鏡(SEM)照片如圖4所示. 由圖4(A)可見, 在CS-AuNPs復合膜中較為緊密地排列著由EDOT單體電聚合得到的PEDOT粒子. 洗脫模板分子前的印跡聚合膜呈現(xiàn)質(zhì)地緊密, 較為均勻的形態(tài). 而在洗脫模板分子后, 印跡聚合膜表面凹凸不平, 呈現(xiàn)出多孔結(jié)構(gòu), 這可能是模板分子洗脫后在膜中留下了孔穴所致, 使其表面粗糙度增加, 電極表面的吸附面積增大, 有利于提高傳感器對模板分子的選擇性結(jié)合能力. 而洗脫后的非印跡電極表面雖有一層致密薄膜[圖4(C)], 卻少有印跡孔穴存在, 且非印跡膜上有突出的“顆粒”狀亮點出現(xiàn), 這是由于CS-AuNPs在電極表面被非印跡膜包裹所致.

由Randles-Sevcik方程Ip=2.69×105Acn3/2D1/2v1/2(擴散系數(shù)D值取6.3×10-6cm2/s)可得Au/CME,PEDOT/Au/CME和AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME的有效表面積A分別為0.1412, 0.3389和0.4857cm2. 這說明基底金電極經(jīng)CS-AuNPs和PEDOT修飾后有效表面積明顯增大, 電化學活性位點增多, 促進了電極表面的電子傳遞. 這進一步驗證了阻抗譜實驗和循環(huán)伏安實驗分析結(jié)果.

2.3實驗條件的優(yōu)化

2.3.1聚合電位和掃描圈數(shù)的選擇選擇4.0mmol/L3,4-乙烯二氧噻吩的PBS(pH=7.23)溶液作為聚合底液, 考察了不同聚合電位對聚合過程的影響. 結(jié)果表明, 電位范圍為-0.2～0.8, -0.2～1.0, -0.2～1.2和-0.2～1.5V時, 3,4-乙烯二氧噻吩均可在電極表面聚合形成導電膜. 但是聚合電位越高, 3,4-乙烯二氧噻吩越有可能在電極上發(fā)生氧化反應. 綜合考慮, 選擇-0.2～1.5V為聚合電位窗口. 聚合膜厚度對傳感器的性能有很大影響. 膜過薄, 膜內(nèi)的印跡點少, 導致檢測時的線性范圍窄、 靈敏度低; 膜過厚, 物質(zhì)在膜內(nèi)的傳輸速率變慢, 響應時間延長, 影響分析速度, 因此膜的厚度必須適宜. 膜的厚度由電聚合時間即掃描圈數(shù)決定[22]. 對于導電聚合, 聚合時間越長, 膜越厚. 由圖1(A)可知, 電流響應隨著CV掃描圈數(shù)的增多呈現(xiàn)增大趨勢, 但7圈后,PEDOT的氧化峰電流不再增大, 反而有減小趨勢, 這是因為PEDOT膜聚合圈數(shù)過多導致膜太厚阻礙了電子轉(zhuǎn)移. 因此, 選擇7圈為選擇最佳電聚合圈數(shù).

2.3.2模板去除條件的優(yōu)化鹽酸阿霉素分子中含有多個強極性官能團, 模板與單體間的作用位點多, 分子間作用力大, 導致模板深陷在聚合物膜中, 溶劑洗脫困難. 為提高洗脫效率, 采用電化學洗脫法去除模板. 將DOX-PEDOT/AuNPs-CS/Au/CME電極置于0.050mol/LPBS緩沖溶液(pH=7.23) 中, 以50mV/s的掃描速度, 分別在0～1.0, 0～1.2, 0～1.4, 0～1.6, 0～1.8和0～2.0V電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描10圈, 比較不同電位范圍掃描下模板的清除效果. 發(fā)現(xiàn)掃描去除效果最佳的電位范圍為0～2.0V. 固定掃描電位, 考察了不同掃描圈數(shù)對模板去除的影響, 發(fā)現(xiàn)掃描4～8 圈后電極于鐵氰化鉀中的峰電流相同, 考慮到掃描圈數(shù)過多會對聚合膜造成破壞, 選擇0～2.0V內(nèi)掃描4圈作為去除模板的最佳條件.

Fig.5　Influence of the adsorption time on the response of the sensor

2.3.3吸附時間對傳感器電化學響應的影響考察了鹽酸阿霉素在所構(gòu)建傳感器上的吸附時間對K3[Fe(CN)6]峰電流的影響. 將印跡膜電極浸入一定濃度的阿霉素溶液中進行吸附, 每隔5min取出, 在0.005mol/LK3[Fe(CN)6]PBS中用DPV法測定其響應電流的變化(圖5). 結(jié)果表明, 隨著吸附時間的延長,K3[Fe(CN)6]氧化峰電流逐漸下降, 表明印跡位點逐漸被阿霉素分子占據(jù); 當吸附時間達到20min后, 峰電流出現(xiàn)平臺, 電流不再下降, 說明鹽酸阿霉素與印跡膜傳感器的物質(zhì)交換達到平衡狀態(tài), 膜中鹽酸阿霉素已達到飽和. 因此, 最佳吸附時間為20min. 根據(jù)Laviron公式IP=

n2F2ΓAv/4RT=QnFv/4RT計算得到DOX印跡敏感膜對DOX的吸附容量Γ=1.1368×10-9mol/cm2[式中: Γ(mol/cm2)為DOX印跡敏感膜在電極表面的覆蓋度; Ip(A)為背景電流; n為電子轉(zhuǎn)移數(shù); F(96500C/mol)為法拉第常數(shù); A(cm2)為電極表面積; Q(C)為電荷量; v(V/s)為掃描速率; R(J·K-1·mol-1)為氣體常數(shù); T(K)為熱力學溫度].

2.4印跡膜傳感器的響應特性

2.4.1線性范圍與檢出限在最優(yōu)實驗條件下, 將分子印跡膜傳感器放入不同濃度的鹽酸阿霉素溶液中吸附20min, 進行DPV測定, 結(jié)果如圖6所示. 傳感器的響應電流ΔIp(測試底液中含有DOX與不含DOX時的峰電流之差)與DOX濃度c在4.0×10-7～1.0×10-6mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系, 線性方程為ΔIp=-4.0424-1.0099c(R2=0.9967), 最低檢出濃度為2.0×10-7mol/L, 檢出限為6.5×10-8mol/L(3σ).

Fig.6　DPV curves of MIP/AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME after adsorption in different concentrations of DOX(A) and linear relationship of current peak difference vs. DOX concentration on MIP/AuNPs-CS/PEDOT/Au/CME(B)

表1列出了不同方法檢測DOX的結(jié)果. 與其它方法相比, 本傳感器具有更低的線性范圍和檢出限, 適用于快速檢測低濃度水平的鹽酸阿霉素.

Table 1　Comparison of detection results of DOX by this method and literature methods

Fig.7　Structures of substance used in interference experiments

2.4.2印跡膜傳感器的選擇性為驗證印跡傳感器的選擇性, 選用可能會對血樣中DOX的測定產(chǎn)生影響的長春堿、 5-氟尿嘧啶及放線菌素D(結(jié)構(gòu)式見圖7)進行了干擾實驗.

Fig.8　Current response of different substances on MIP sensor and NIP sensor a. DOX; b. VLB; c. 5FU; d. ACD.

將濃度均為2×10-6mol/L的各干擾物質(zhì)分別加入到鐵氰化鉀溶液中, 在相同條件下測定印跡傳感器和非印跡傳感器對鹽酸阿霉素和各干擾物質(zhì)所產(chǎn)生的電流響應, 結(jié)果如圖8所示. 可見, 傳感器對以上干擾物質(zhì)的電流響應很小, 表明干擾物質(zhì)無法結(jié)合到分子印跡膜傳感器上. 對于非印跡傳感器, 無論是鹽酸阿霉素還是干擾物質(zhì), 電流響應均很小, 這是由于在非印跡傳感器中沒有鹽酸阿霉素的印跡結(jié)合位點所致. 此結(jié)果證實基于分子印跡聚合物的傳感器對于鹽酸阿霉素有良好的選擇性.

由于實驗測定選擇的是血清樣品, 因此對血清中存在的一些離子也進行了干擾實驗. 在2×10-6mol/L鹽酸阿霉素溶液中加入0.1mol/LNa+, 0.5mmol/LCa2+, 0.5mmol/LMg2+, 0.5mmol/LZn2+和0.5mmol/LK+作為競爭底物進行測定, 結(jié)果表明峰電流值在±0.19μA范圍內(nèi)變化, 說明這些常見離子對測定的干擾很小, 表明該分子印跡電化學傳感器在實際的應用中有較好的選擇識別性.

2.5印跡膜傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

在最優(yōu)實驗條件下, 用同一傳感器對2×10-6mol/L鹽酸阿霉素溶液平行測定5次, 其相對標準偏差為1.20%; 電極不使用時, 保存于4 ℃冰箱內(nèi)放置過夜, 在相同條件下測定2×10-6mol/L鹽酸阿霉素溶液, 電流響應幾乎接近于初始值; 存放一個月后, 響應電流降為初始值的81.54%, 表明印跡傳感器具有良好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性.

2.6實際樣品檢測

將血漿在室溫下放置1h, 待凝結(jié)出血餅后將其移除, 以3000r/min轉(zhuǎn)速離心15min; 取上層清液振蕩至均勻, 以15000r/min轉(zhuǎn)速離心15min, 取上層清液, 重復操作2次. 將經(jīng)過前處理的樣品儲存于冰箱中備用. 取5.0mL血清樣品, 采用標準加入法加入一定量的鹽酸阿霉素標準溶液制成儲備液. 在最優(yōu)實驗條件下, 考察DOX在1, 3, 5和7μmol/L4個加標濃度下的回收率及相對標準偏差, 每個樣品平行測定3次. 由表2可見, 該方法的回收率為96.0%～106.7%, 相對標準偏差為0.86%～1.66%.

Table 2　Determination result of DOX in blood serum samples

采用差分脈沖伏安法以血清樣品為背景對該傳感器的性能進行了測試. 在最優(yōu)實驗條件下, 將印跡膜傳感器置于含0, 1, 3, 5, 7和9μmol/L鹽酸阿霉素溶液中, 進行DPV測定. 結(jié)果表明, 在4.0×10-7～1.0×10-6mol/L范圍內(nèi), 峰電流差值ΔI與血清樣品中的DOX濃度c呈良好的線性關(guān)系. 線性方程為ΔIp=-2.8006-0.9905c(R2=0.9952). 傳感器的檢出限為8.6×10-8mol/L(S/N=3), 略高于在標準溶液中所得值, 這是由于實際應用中血清背景在某一程度上存在干擾.

3結(jié)論

通過電聚合方法在金電極上構(gòu)建了鹽酸阿霉素分子印跡電化學傳感器, 用于鹽酸阿霉素的檢測.CS-AuNPs/PEDOT復合材料能顯著增強電化學響應. 電化學表征結(jié)果證實,MIPs膜能選擇性地重結(jié)合模板分子, 且構(gòu)建的傳感器對DOX的選擇性明顯優(yōu)于其它結(jié)構(gòu)類似的抗癌藥物. 優(yōu)化傳感器參數(shù)后, 該傳感器可初步用于人體血樣中DOX的檢測, 所構(gòu)建的傳感器制作簡單, 分析性能良好.

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(Ed.:D,K)

?SupportedbytheNaturalScienceFoundationofShanxiProvince,China(No.20001057).

doi:10.7503/cjcu20150938

收稿日期:2015-12-17. 網(wǎng)絡出版日期: 2016-04-12.

基金項目：山西省自然科學基金(批準號: 20001057)資助.

中圖分類號O657.1

文獻標志碼A

PreparationandPropertiesofDoxorubicinHydrochlorideSensorBasedonMolecularlyImprintedPolymer?

ZHANGYan,ZHENGJing,WANGJuan,GUOMandong*

(College of Chemistry and Material Science, Shanxi Normal University, Linfen 041004, China)

AbstractAn electrochemical sensor was developed for the determination of doxorubicin hydrochloride(DOX) using the molecularly imprinted technique. A molecular imprinted polymer(MIP) on the surface of a gold electrode was prepared by electropolymerization of 3,4-ethylenedioxythiop-hene(EDOT) in the presence of DOX in the phosphate buffer solution. Under the optimum conditions, the properties of the electrochemical sensor modified with DOX-imprinted membrane were characterized by cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. A linear relationship between oxidation peak current and DOX concentration was obtained over the range of 4.0×10-7—1.0×10-6mol/L with a correlation coefficient of 0.9967 and a detection limit(S/N=3) of 6.5×10-8mol/L. After regeneration by washing with electrochemical method, the sensor showed excellent reproducibility and good stability. The MIP electrode exhibited very weak response to vinblastine, actinomycin D and fluorouracile, proving a good selectivity. The imprinted sensor was applied to the determination of doxorubicin hydrochloride in human blood serum samples with the relative standard deviation(RSD) below 4% and recovery ranging from 96.0% to 106.7%.

KeywordsMolecularly imprinted polymer; Electrochemical sensor; 3,4-Ethylene dioxythiophene; Doxorubicin hydrochloride

聯(lián)系人簡介: 郭滿棟, 男, 教授, 主要從事生物傳感器與電分析化學研究.E-mail:guomd@dns.sxnu.edu.cn