加味孔圣枕中丹對(duì)慢性腦缺血癡呆大鼠VEGF表達(dá)和微血管密度的影響

龐小剛，畢春玉，于華蕓，武　冰，吳智春，王志宏

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

?

加味孔圣枕中丹對(duì)慢性腦缺血癡呆大鼠VEGF表達(dá)和微血管密度的影響

龐小剛，畢春玉，于華蕓，武冰，吳智春，王志宏

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

[摘要]目的觀察加味孔圣枕中丹對(duì)慢性腦缺血致血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)和微血管密度(MVD)的影響，探討該方影響血管生成、改善學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制。方法將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、加味孔圣枕中丹組和貝伐單抗組，除假手術(shù)組外，其余組均采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎法建立慢性腦缺血癡呆大鼠模型。造模24 h后，加味孔圣枕中丹組及貝伐單抗組均給予加味孔圣枕中丹水煎濃縮液16 mL/(kg·d)灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等容量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)30 d。貝伐單抗組另給予貝伐珠單抗注射液2 mg/kg腹腔注射，1次/2周。干預(yù)結(jié)束后，Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠逃避潛伏期評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化法檢測(cè)皮質(zhì)及胼胝體VEGF和CD34表達(dá)情況，以CD34標(biāo)記MVD。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，胼胝體VEGF表達(dá)水平升高(P<0.05)，皮質(zhì)和胼胝體MVD顯著升高(P均<0.05)；與模型組比較，加味孔圣枕中丹組大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)，皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達(dá)水平、MVD均顯著升高(P均<0.05)；與貝伐單抗組比較，加味孔圣枕中丹組皮質(zhì)VEGF表達(dá)水平及MVD均顯著升高(P均<0.05)。結(jié)論加味孔圣枕中丹能上調(diào)慢性腦缺血大鼠腦組織VEGF表達(dá)，促進(jìn)腦組織血管生成，這可能是其改善癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]加味孔圣枕中丹；血管性癡呆；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是腦血管病后的主要并發(fā)癥，是以健忘、呆笨為主要臨床表現(xiàn)的一種腦功能衰退性疾病[1]。隨著人口老齡化及腦血管病發(fā)病率增長，VD將會(huì)成為全球第一大癡呆類型[2]，嚴(yán)重威脅人類身心健康。慢性腦缺血是VD 發(fā)生的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，慢性持續(xù)性腦血流量下降使大腦參與認(rèn)知的重要部位如額、顳葉皮質(zhì)，海馬以及白質(zhì)區(qū)等長期處于缺血狀態(tài)，逐漸出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙[3-4]，改善和恢復(fù)局部的血供可能是治療本病的有效手段。加味孔圣枕中丹方由龜板、山茱萸、川芎等組成，功可補(bǔ)腎活血開竅，前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)VD大鼠腦細(xì)胞具有一定保護(hù)作用[5]。本次研究擬建立慢性腦缺血VD大鼠模型，觀察其對(duì)VD大鼠皮質(zhì)及胼胝體血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)及微血管密度(MVD)的影響，進(jìn)一步探究其可能機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±10)g，清潔級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要藥物貝伐珠單抗注射液購自瑞士羅氏制藥公司。加味孔圣枕中丹由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科負(fù)責(zé)煎制，每毫升含龜板0.33 g、生龍骨0.33 g、山茱萸0.28 g、肉蓯蓉0.22 g、石菖蒲0.17 g、遠(yuǎn)志0.17 g、丹參0.28 g、川芎0.22 g。

1.3主要試劑與儀器VEGF單克隆抗體(Lot.GR58038-1)和CD34單克隆抗體(lot. GR55967-1)購自英國ABCAM公司。濃縮型DAB試劑盒(Lot.15111A03)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics 公司)，LEICARASP300全自動(dòng)脫水機(jī)(德國徠卡公司)，OLYMPUS CX41光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、加味孔圣枕中丹組、加味孔圣枕中丹加貝伐珠單抗組(簡(jiǎn)稱貝伐單抗組)，每組10只，4組大鼠飼養(yǎng)環(huán)境相同。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎法(2-VO)建立VD大鼠模型[6]：4%水合氯醛6.5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部常規(guī)備毛、消毒，頸部中線正中切開，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，無菌絲線雙結(jié)扎，剪斷頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎剪斷。逐層縫合傷口，外敷少許青霉素鈉。模型制備24 h后，加味孔圣枕中丹組及貝伐單抗組均給予加味孔圣枕中丹水煎濃縮液16 mL/(kg·d)灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等容量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)30 d。貝伐單抗組另給予貝伐珠單抗注射液2 mg/kg腹腔注射，1次/2周。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1Morris水迷宮逃避潛伏期干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮裝置參照文獻(xiàn)[7]，選用大鼠通用型圓桶，在圓桶上緣設(shè)等距離的東、西、南、北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，將水面和水桶分成4個(gè)象限。實(shí)驗(yàn)時(shí)向水桶加水至37 cm，水溫控制在23～25 ℃，水內(nèi)添加墨汁，使其呈黑色不透明狀。先將大鼠放入水池中進(jìn)行自由游泳訓(xùn)練2 min，使其熟悉環(huán)境。實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)4 d，每天定于固定時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將高度為35 cm、直徑為8 cm的平臺(tái)設(shè)置于東北象限，將大鼠先由遠(yuǎn)離平臺(tái)的西南象限入水[8]，然后分別由其他3個(gè)象限入水，至其找到平臺(tái)，記錄其逃避潛伏期，并在臺(tái)上停留2 min。如果2 min未能找到，則將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在平臺(tái)上2 min，潛伏期記錄為120 s。每日以大鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為大鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績(jī)。

1.5.2皮質(zhì)及胼胝體VEGF及CD34表達(dá)情況Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉大鼠取腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制片，常規(guī)脫蠟及抗原修復(fù)，按試劑盒說明書逐步進(jìn)行免疫組化染色，用SABC法。VEGF蛋白在細(xì)胞漿表達(dá)，陽性細(xì)胞可見棕黃色或棕褐色顆粒，Image Pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，400倍鏡下，隨機(jī)取3個(gè)視野，測(cè)出VEGF陽性反應(yīng)細(xì)胞的積分光密度(IOD)。CD34陽性染色時(shí)細(xì)胞內(nèi)有淺棕色至深棕色顆粒沉著，每張染色切片于低倍鏡下(×40)尋找3個(gè)微血管密集區(qū)，隨后于高倍鏡下(×200)計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野中的微血管數(shù)，取平均值代表MVD值。

2結(jié)果

2.1各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較隨著大鼠學(xué)習(xí)次數(shù)的增加，各組逃避潛伏期逐漸縮短。從第2天開始，模型組大鼠潛伏期明顯長于假手術(shù)組(P均<0.05)；第3天和第4天，加味孔圣枕中丹組大鼠潛伏期均顯著短于模型組(P均<0.05)；加味孔圣枕中丹組和貝伐單抗組各時(shí)段潛伏期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達(dá)IOD及MVD比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胼胝體VEGF表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，皮質(zhì)和胼胝體MVD顯著增加(P均<0.05)；與模型組比較，加味孔圣枕中丹組皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達(dá)水平及MVD均顯著升高(P均<0.05)；與貝伐單抗組比較，加味孔圣枕中丹組皮質(zhì)VEGF表達(dá)水平及MVD均顯著升高(P均<0.05)。見表2。各組皮質(zhì)及胼胝體VEGF和CD34染色表現(xiàn)見圖1及圖2。

表2　各組大鼠皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達(dá)IOD及MVD比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05; ②與模型組比較，P<0.05；③與貝伐單抗組比較，P<0.05。

圖1　各組大鼠胼胝體及皮質(zhì)VEGF染色表現(xiàn)(SABC，×400)

圖2　各組大鼠胼胝體及皮質(zhì)CD34染色表現(xiàn)(SABC，×200)

3討論

慢性腦缺血是多種原因?qū)е麻L期的腦灌流不足[11]，其引起的能量代謝障礙、離子通道功能失調(diào)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌失調(diào)以及炎癥因子釋放等各種損傷因素協(xié)同作用，逐漸引起皮質(zhì)、海馬以及大腦白質(zhì)等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)腦組織產(chǎn)生不可逆的損傷[12-13]，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。因而改善受損腦組織的血液供應(yīng)、減輕缺血程度是改善VD臨床癥狀，控制其病情進(jìn)展的有效手段。長期以來，腦缺血研究多集中在神經(jīng)元或灰質(zhì)的損傷反應(yīng)上，忽視對(duì)腦白質(zhì)損傷的研究。從腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的角度來看，所有與缺血有關(guān)的腦區(qū)、細(xì)胞類型和細(xì)胞成分都應(yīng)受到保護(hù)，不僅要保護(hù)灰質(zhì)，亦應(yīng)保護(hù)白質(zhì)。

VD是現(xiàn)今唯一可預(yù)防的癡呆類型，早期積極防治病情具有可逆性。本病屬祖國醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆證”“善忘”等范疇，發(fā)病部位在腦，功能物質(zhì)基礎(chǔ)為髓，乃本虛標(biāo)實(shí)之證，腎精虧虛為致病之本[14]，瘀阻竅閉乃致病之標(biāo)，臨證治當(dāng)補(bǔ)腎益髓、活血開竅[15]。加味孔圣枕中丹是在“補(bǔ)腎益髓”治則指導(dǎo)下，以《備急千金要方》孔圣枕中丹加山茱萸、肉蓯蓉、川芎、丹參而成，方中重用龜板為君，補(bǔ)腎、活血，標(biāo)本兼顧；臣以山茱萸益陰補(bǔ)精，肉蓯蓉填精益髓、溫助腎陽。君臣相配，陰陽并補(bǔ)，以治腎精虧虛之本。佐以川芎、丹參活血祛瘀；石菖蒲開竅醒神；遠(yuǎn)志安神定志、益智強(qiáng)識(shí)；龍骨鎮(zhèn)驚安神。諸藥相合，共奏補(bǔ)腎益精、活血開竅之功。補(bǔ)腎填精、溫陽益火即可生精益髓，益智健腦，且精氣血旺盛，利于活血祛瘀；活血開竅以除病標(biāo)，使瘀祛竅通，神識(shí)自復(fù)。本研究中Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著大鼠學(xué)習(xí)次數(shù)的增加，各組逃避潛伏期的時(shí)間逐漸縮短，表明所有大鼠均具有通過訓(xùn)練學(xué)習(xí)產(chǎn)生記憶的能力；模型組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組長，而加味孔圣枕中丹組大鼠潛伏期縮短，提示加味孔圣枕中丹能夠改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

VEGF作為一種重要的血管發(fā)育調(diào)節(jié)因子，是影響缺血后大腦重塑的重要調(diào)控因子之一。腦缺氧缺血后，VEGF表達(dá)增高，與其受體結(jié)合促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖, 誘導(dǎo)新生血管的生成[16]，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，增加缺血區(qū)供血供氧，起直接保護(hù)作用[17]。CD34是一種階段特異性白細(xì)胞分化抗原, 選擇性地表達(dá)于人類造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面[18]，是一種與新生小血管相關(guān)的抗原，被作為最敏感的新生血管內(nèi)皮標(biāo)記物[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加味孔圣枕中丹組大鼠皮質(zhì)及胼胝體VEGF表達(dá)水平和MVD均顯著高于模型組，提示加味孔圣枕中丹可促進(jìn)VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)腦血管生成，從而恢復(fù)、改善皮質(zhì)及白質(zhì)缺血區(qū)血供，具有全腦保護(hù)效應(yīng)，這可能是其改善VD大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制之一。

貝伐單抗是VEGF阻斷劑，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加味孔圣枕中丹和貝伐單抗聯(lián)合使用組大鼠腦VEGF和MVD與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與加味孔圣枕中丹組比較皮質(zhì)VEGF表達(dá)水平和MVD則顯著降低，提示影響VEGF生物學(xué)效應(yīng)是加味孔圣枕中丹的作用靶點(diǎn)之一。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，貝伐單抗組逃避潛伏期明顯短于模型組，但與加味孔圣枕中丹組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示加味孔圣枕中丹改善學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制除與影響VEGF相關(guān)外，可能還有其他方面的機(jī)制，有待于進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Roman GC. Vascular dementia revisited:diagnosis,pathogenesis,treatment,and prevention[J]. Med Clin North Am,2002，86(3):477-499

[2]Ihara M,Tomimoto H. Lessons from a mouse model characterizing features of vascular cognitive impairment with white matterchanges[J]. J Aging Res,2011，2011:978761

[3]Venkat P,Chopp M,Chen J. Models and mechanisms of vascular dementia[J]. Exp Neurol,2015，272：97-108

[4]孫莉，張昱，鄒昕穎，等. 慢性前腦缺血致癡呆大鼠皮質(zhì)及皮質(zhì)下白質(zhì)區(qū)病理學(xué)變化的對(duì)比研究[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2004，21(5):19-21

[5]季旭明，于華蕓，吳智春，等. 加味孔圣枕中丹提高VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及對(duì)腦細(xì)胞的保護(hù)作用研究[J]. 微循環(huán)學(xué)雜志,2011，21(2):93-94

[6]王群，王擁軍. 嚙齒類血管性癡呆動(dòng)物模型[J]. 中國卒中雜志,2015，10(4):279-283

[7]孫成棟，李貴海，李昂，等. 三酮腦通片對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響[J]. 中國全科醫(yī)學(xué),2006，9(8):640-642

[8]羅小泉，駱利平，陳海芳，等. Morris水迷宮檢測(cè)大鼠記憶力方法的探討[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010，31(10):2667-2669

[9]邱宏，金國琴，金如鋒，等. 水迷宮重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析及其在SPSS中的實(shí)現(xiàn)[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2007，5(1):101-105

[10] 閆盼盼，閆國立，詹向紅，等. Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探析[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013，31(2):264-266

[11] Shibata M,Ohtani R,Ihara M,et al. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion[J]. Stroke,2004，35(11):2598-2603

[12] 劉漢興，章軍建. 慢性腦缺血與認(rèn)知功能障礙[J]. 國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊(cè),2004，12(4):278-281

[13] Toyran N,Zorlu F,Donmez G,et al. Chronic hypoperfusion alters the content and structure of proteins and lipids of rat brain homogenates:a Fourier transform infrared spectroscopy study[J]. Eur Biophys J,2004，33(6):549-554

[14] 溫艷暉，黃源鵬. 淺述血管性癡呆的中醫(yī)診治[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志,2015，36(3):83-85

[15] 韓彥利. 多奈哌齊聯(lián)合補(bǔ)腎填精活血方治療血管性癡呆的療效研究[J]. 臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志,2015，2(10):1796

[16] 龍建飛，張秋霞，王蕾，等. 血管內(nèi)皮生長因子及其受體在缺氧缺血性腦損傷的作用研究[J]. 世界中醫(yī)藥,2015，10(4):637-639

[17] 張偉三，徐晏. 血管內(nèi)皮生長因子及其受體對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用[J]. 醫(yī)學(xué)綜述,2009，15(8):1130-1132

[18] 柏樹令，趙丹. CD34抗原的生物學(xué)特性及其臨床應(yīng)用[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展,2005，11(1):54-56； 60

[19] 馬璟曦，羅勇. 電針合谷穴對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦內(nèi)毛細(xì)血管密度及CD34表達(dá)的影響[J]. 中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2014，21(3):201-205

[作者簡(jiǎn)介]龐小剛，男，碩士，講師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治腦血管病藥物作用途徑及分子機(jī)制研究。 [通信作者]王志宏,E-mail:hong62w@126.com

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202641)；山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目(201302021)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.003

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)23-2515-04

[收稿日期]2016-04-10

Impacts of modified Kongshengzhenzhong Pills on expression of VEGF and MVD in VD rats induced by chronic cerebral ischemia

PANG Xiaogang，BI Chunyu，YU Huayun,WU Bing, WU Zhichun,WANG Zhihong

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Shandong,China)

Abstract：Objective It is to observe the impacts of modified Kongshengzhenzhong Pills on the ability of learning and memory，as well as the expression of VEGF protein and the micro vessel density(MVD)in brain tissue of the vascular dementia(VD)rats induced by chronic cerebral ischemia，and to explore the effects of this decoction on angiogenesis and its mechanism of improving learning and memorizing ability. Methods Rat models of VD induced by chronic cerebral ischemia was prepared by bilateral common carotid artery ligation. The experimental animals were randomly divided into sham operation group, model group, modified Kongshengzhenzhong Pills group, and Bevacizumab group. Drug intervention was carried out for 30days.The ability of learning and memorizing of the rats was assessed by Morris water maze experiment. The expression of VEGF protein and CD34 both in cortex and callosum were detected by immunohistochemistry, and MVD was calculated. Results Compared with the sham operation group, the average escape latent period prolonged, the expression of VEGF in callosum, MVD both in cortex and callosum increased in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the average escape latent period shortened, the expression of VEGF and MVD both in cortex and callosum increased significantly in modified Kongshengzhenzhong Pills group(P<0.05).Conclusion Modified Kongshengzhenzhong Pills can elevate the expression of VEGF protein and promote blood vessel formation in brain tissue of VD rats. And these effects may serve as one of its mechanisms of improving learning and memorizing ability of VD rats.

Key wordsmodified Kongshengzhenzhong Pills; vascular dementia; vascular endothelial growth factor; microvessel density