基于IL-7的甘草多糖抗腫瘤機(jī)制的研究*

王　麗，趙　穎，崔換天，李　薇，宋新波，邊育紅

（1.天津市第二人民醫(yī)院，天津　300192；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　300193；3.天津市肝病研究所，天津　300192）

基于IL-7的甘草多糖抗腫瘤機(jī)制的研究*

王麗1，3，趙穎2，崔換天2，李薇2，宋新波2，邊育紅2

（1.天津市第二人民醫(yī)院，天津300192；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；3.天津市肝病研究所，天津300192）

［目的］明確甘草多糖抗腫瘤作用及其作用機(jī)制。［方法］建立CT-26細(xì)胞荷瘤小鼠動(dòng)物模型，隨機(jī)分為正常組、模型組、甘草多糖組（甘草多糖灌胃500mg/kg）、香菇多糖組（陽(yáng)性藥組，香菇多糖灌胃195mg/kg）和白細(xì)胞介素-7 （IL-7）抗體阻斷組（甘草多糖灌胃500 mg/kg，IL-7抗體與0、5、10 d腹腔注射0.4 mg/kg）。連續(xù)給藥14 d，計(jì)算小鼠腫瘤質(zhì)量、抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)；檢測(cè)小腸黏膜上皮細(xì)胞IL-7mRNA表達(dá)情況和血清中IL-7含量。［結(jié)果］灌胃給予甘草多糖14 d后，甘草多糖可以顯著降低荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量，其抑瘤率為21.56%；顯著提高小鼠體質(zhì)量和胸腺指數(shù)，改善其生活質(zhì)量；提高小腸黏膜上皮細(xì)胞IL-7mRNA表達(dá)和血清中IL-7含量；IL-7抗體阻斷后，其抑瘤率和胸腺指數(shù)顯著降低，小腸黏膜上皮細(xì)胞IL-7mRNA雖高表達(dá)，但血清中IL-7含量低于試劑盒檢測(cè)限。［結(jié)論］甘草多糖具有顯著的抗腫瘤作用，其抗腫瘤機(jī)制可能與提高小腸黏膜上皮細(xì)胞分泌IL-7有關(guān)。

甘草多糖；小腸黏膜上皮細(xì)胞；抗腫瘤；白細(xì)胞介素-7

腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，目前其治療手段以手術(shù)、放化療等為主。但是由于這些方法在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷正常細(xì)胞，大大降低了其臨床治療效果。目前，尋找有效低毒的抗腫瘤及抗腫瘤輔助藥物是國(guó)內(nèi)外腫瘤防治研究的熱點(diǎn)。

多糖，又稱多聚糖，是由單糖組成的高分子化合物，是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，自上世紀(jì)40年代人們從黏質(zhì)塞氏桿菌（Serratia marcescens）分離出具有抗腫瘤活性的細(xì)菌多糖以來(lái)，多糖的抗腫瘤作用越來(lái)越得到人們的關(guān)注。中藥多糖以其扶正兼祛邪的優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于抗腫瘤的臨床治療，如人參多糖注射液聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌能夠有效緩解患者的臨床癥狀和體征，提高患者生活質(zhì)量，無(wú)明顯不良反應(yīng)［1］。中國(guó)現(xiàn)已有香菇多糖片、黃芪多糖注射液等多種多糖制劑的上市銷售。雖然中藥多糖具有明確的抗腫瘤作用，但其分子機(jī)制尚不明確，制約了其臨床使用。

多糖是具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)大分子化合物，研究表明，大部分多糖不能被直接分解吸收，且多糖的生物學(xué)活性與其空間構(gòu)象有一定的關(guān)系，即使會(huì)有部分多糖在消化道被降解成單糖而吸收，也喪失了原本特有的活性。因此，處于機(jī)體與外界抗原接

觸第一線的腸黏膜上皮細(xì)胞逐漸被關(guān)注，有學(xué)者提出小腸黏膜上皮細(xì)胞是健脾益氣中藥的主要藥理作用靶點(diǎn)［2］。如口服黃芪多糖和豬苓多糖可以通過(guò)刺激腸上皮細(xì)胞，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用［3］，靈芝多糖可以刺激H22肝癌小鼠腸道黏膜，調(diào)節(jié)全身免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草多糖具有明確的抗腫瘤活性，并且可以刺激小腸黏膜上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-7（IL-7）等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。綜上本研究將以小腸黏膜上皮細(xì)胞分泌IL-7入手，探討甘草多糖抗腫瘤潛在機(jī)制，為甘草多糖的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料

1.1藥品與試劑甘草多糖（由天津中醫(yī)藥大學(xué)中一制藥有限公司提供）；香菇多糖（浙江普洛康裕天然藥物有限公司 批號(hào)：120901）IL-7抗體（北京博奧森，批號(hào)131122）；RPMI 1640培養(yǎng)基 （美國(guó)Hyclone公司）、特級(jí)胎牛血清（FBS，以色列BioInd公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司）。

1.2儀器PCR儀：Bio-RAD iQTM5；CO2恒溫培養(yǎng)箱：Forma 3110，Thermo；倒置相差顯微鏡：Nikon ECLIPSE TS100；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/C小鼠，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雄性，鼠齡6周，體質(zhì)量18～22 g。

*基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（2011BAI07B02-5）。作者簡(jiǎn)介：王麗（1986-），女，碩士研究生，藥師，主要從事的中藥藥理研究。

通訊作者：邊育紅，E-mail：bianyuhong_2012@163.com。

1.4細(xì)胞株CT-26腫瘤細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。

2　方法

2.1甘草多糖的提取與精制采用前期報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方案提取甘草粗多糖［5］，將甘草粗多糖配制成5%水溶液，80 Hz、30℃超聲1 h，室溫?cái)嚢? h以待多糖充分溶解。6 000 r/min離心10 min除去水不溶性物質(zhì)，上清液濃縮后采用57%～82%乙醇濃度進(jìn)行醇沉操作，醇沉?xí)r均攪拌2 h，4℃過(guò)夜，抽濾，沉淀依次用95%乙醇、丙酮洗數(shù)次。sevage法脫蛋白、透析除鹽，冷凍干燥后，備用。

2.2動(dòng)物造模與分組此次實(shí)驗(yàn)所用的Balb/C小鼠飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持室溫在（22±2）℃，濕度40%±10%；自然光照射，小鼠適應(yīng)環(huán)境2 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

造模方法：取CT-26細(xì)胞懸液，經(jīng)生理鹽水稀釋計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞至5×105個(gè)/mL，每鼠右腋下接種0.2 mL。荷瘤小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組8只，做好標(biāo)記。分別為陽(yáng)性對(duì)照組（香菇多糖組）、模型組、甘草多糖與IL-7抗體聯(lián)用組（IL-7組）、甘草多糖組，另外8只正常小鼠作為正常組，稱質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)，標(biāo)記。給藥劑量與方式如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)給藥劑量Tab.1　Dosage of administration

2.3荷瘤小鼠一般生活狀況的觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察荷瘤小鼠的活動(dòng)能力、毛發(fā)和攝食、飲水量變化等情況。

2.4甘草多糖對(duì)荷瘤小鼠肉瘤的影響第14天給藥2 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，分離瘤塊，取腫瘤組織，于生理鹽水中稍稍漂洗殘血，吸水紙輕輕吸干多余水分后，稱質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算抑瘤率，公式如下：

抑瘤率=（陰性對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）×100%/陰性對(duì)照組平均瘤質(zhì)量

2.5甘草多糖對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響第14天給藥2 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，分離脾臟和胸腺于生理鹽水中稍稍漂洗殘血，吸水紙輕輕吸干多余水分后，稱質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)，按下式計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量mg/體質(zhì)量g

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量mg/體質(zhì)量g

2.6甘草多糖對(duì)荷瘤小鼠小腸黏膜上皮組織中IL-7基因表達(dá)的影響第14天給藥2 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，剪取約5 cm的小腸，DEPC水洗凈腸道內(nèi)污物及雜質(zhì)，剪開(kāi)腸道，用潔凈玻璃板刮取小腸內(nèi)壁上皮組織，置于凍存管中，將樣品于液氮中速凍，然后放到-80℃冰箱內(nèi)保存。從-80℃冰箱內(nèi)取出組織，在液氮中磨碎，每100 mg組織內(nèi)加入1 mL裂解液RZ，置于冰上，用勻漿儀處理。按照總RNA Isolation Kit說(shuō)明書，首先抽提總RNA，使用UV法檢測(cè)每個(gè)樣品中的總RNA濃度，OD260/280在1.8～2.2范圍內(nèi)被認(rèn)為是提取的總RNA純度較高。取2 μg 總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系10μL，37℃反應(yīng)60min。然后依照SYBR Green Real Time RT-PCR說(shuō)明書，以獲得的cDNA為模版，進(jìn)行實(shí)時(shí)災(zāi)光定量核酸擴(kuò)增，分別擴(kuò)增IL-7、β-catenin，反應(yīng)體系20 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性15 s，退火/延伸55℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。所得CT值經(jīng)轉(zhuǎn)換后以2-ΔΔCT相對(duì)定量法獲得目的基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)值。目的基因及內(nèi)參基因引物由沙船（天津）生物科技發(fā)展有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

表2　PCR引物信息Tab.2　Primer sequence

2.7甘草多糖對(duì)荷瘤小鼠血清中IL-7含量的影響

第14天給藥2 h后，眼眶靜脈叢取血法收集血液，離心后血清保存于-80℃冰箱。檢測(cè)時(shí)將血清從-80℃冰箱中取出，置于冰上，備用。使用IL-7抗體試劑盒，按說(shuō)明書上步驟操作：將試劑盒置于室溫中平衡30 min，從鋁箔袋中取出板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔S0、S1、S2、S3、S4、S5，各加50 μL；樣品孔中先加待測(cè)樣品10 μL，再加樣品稀釋液40 μL；空白孔為純水；除空白孔外，每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱培育60 min；棄去液體，板條于吸水紙上拍干，每孔加200 μL洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)此操作5次；洗凈后，每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光培育15 min后，每孔加入終止液50 μL，5 min后，于450 nm下檢測(cè)各孔的OD值。

2.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1甘草多糖精制與純化將甘草粗多糖經(jīng)過(guò)醇沉、脫蛋白和除鹽等處理后得到精制的甘草多糖，通過(guò)課題組前期報(bào)道［5-6］的苯酚-硫酸法測(cè)得該多糖含量為65%，高效凝膠色譜法測(cè)定其分子量分布如圖1所示。

3.2一般情況觀察在接種CT-26腫瘤細(xì)胞懸液后的前6 d，各組小鼠一般狀況均未發(fā)現(xiàn)明顯差異，正常進(jìn)食飲水，反應(yīng)敏捷，被毛亮澤。自接種第7天開(kāi)始，小鼠開(kāi)始出現(xiàn)腋下膨隆，而后出現(xiàn)小的瘤塊，食欲下降，自主活動(dòng)減少，精神萎靡。其中模型組以上反應(yīng)最為明顯，其他各組反應(yīng)均有所緩解。

3.3甘草多糖對(duì)CT-26細(xì)胞荷瘤小鼠抑瘤率的影響由表3可知，甘草多糖組和香菇多糖組的瘤質(zhì)量均低于模型組（P＜0.05），甘草多糖組的抑瘤率最高，為21.56%；IL-7組瘤質(zhì)量雖低于模型組，但腫瘤重量與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示甘草多糖和香菇多糖均具有一定的抗腫瘤作用，IL-7抗體可以阻斷甘草多糖的抗腫瘤作用。

3.4甘草多糖對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響從表4可知，與正常組相比，模型組小鼠脾臟質(zhì)量及脾臟指數(shù)顯著增高，胸腺質(zhì)量及胸腺指數(shù)顯著降低；各給藥組脾臟質(zhì)量與脾臟指數(shù)和模型組小鼠相比差異無(wú)顯著性（P＞0.05），與模型組小鼠相比，香菇多糖組和甘草多糖組胸腺重量和胸腺指數(shù)均顯著提高，甘草多糖組提高最多（P＜0.05），但甘草多糖組與香菇多糖組間差異無(wú)顯著性。

圖1　甘草多糖高效凝膠色譜圖Fig.1　HPGPC chromatogram of Gancao polysaccharide

表3甘草多糖對(duì)CT-26細(xì)胞荷瘤小鼠抑瘤率的影響Tab.3　Effects of Gancao polysaccharide on tumor progression

3.5甘草多糖對(duì)小腸黏膜上皮細(xì)胞IL-7表達(dá)的影響如圖2所示，與模型組相比較，香菇多糖、甘草多糖和IL-7組均可以極顯著提高荷瘤小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞IL-7的表達(dá)，IL-7組提高最多推測(cè)可能是由于腹腔注射的IL-7抗體中和了體內(nèi)產(chǎn)生的IL-7后引起機(jī)體反饋性產(chǎn)生更多IL-7有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

3.6甘草多糖對(duì)荷瘤小鼠血清IL-7含量的影響結(jié)果表明：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y?=0.010 6X+0.012 5，r2= 0.997 2。按照上述線性回歸方程計(jì)算各組血清中IL-7含量，結(jié)果顯示：正常組、模型組、香菇多糖組和IL-7抗體組中血清所含IL-7含量均沒(méi)有達(dá)到試劑盒檢測(cè)限，甘草多糖組可以測(cè)得血清中含量為28.95 pg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，提高IL-7表達(dá)可能是甘草多糖抗腫瘤的重要作用環(huán)節(jié)。見(jiàn)圖3。

4　討論

表4　甘草多糖對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響（±s）Tab.4　Effects of Gancao polysaccharide on immune organs（±s）

表4　甘草多糖對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響（±s）Tab.4　Effects of Gancao polysaccharide on immune organs（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別　體質(zhì)量　脾臟重量（mg）　胸腺重量（mg）　脾臟指數(shù)（mg/g）　胸腺指數(shù)（mg/g）正常組　20.50±0.96　73.38±8.3**　25.94±7.24**　3.58±0.34**　1.28±0.40**模型組　21.19±1.55　276.30±79.04　8.99±3.43　12.94±3.24　0.43±0.13香菇多糖組　21.65±1.68　246.14±60.17　14.39±3.01*　11.30±2.18　0.66±0.13*甘草多糖組　23.78±0.94*　292.80±27.32　19.60±6.97*　12.29±0.77　0.83±0.29* IL-7組　22.30±1.23　275.34±49.19　12.72±5.46　12.32±1.86　0.56±0.22

甘草為豆科甘草屬植物烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根莖。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為其具有補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、緩和藥性和瀉火解毒等功效［7］。甘草多糖是一種α-吡喃多糖，是甘草的主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)甘草多糖可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，并具有一定的抗腫瘤活性，對(duì)多種實(shí)體瘤均有良好的抑制作用［8］。但目前甘草多糖抗腫瘤作用尚不明確，有學(xué)者推測(cè)甘草多糖的抗腫瘤作用與激活免疫監(jiān)視系統(tǒng)有關(guān)，也有學(xué)者認(rèn)為可能是通過(guò)影響細(xì)胞因子的分泌，間接達(dá)到殺傷腫瘤的作用［9-11］。因此明確甘草多糖作用機(jī)制將為其在腫瘤的臨床治療中的應(yīng)用提供理論支持。

圖2　甘草多糖對(duì)小腸黏膜上皮細(xì)胞IL-7 mRNA表達(dá)的影響Fig.2　Expression of IL-7 mRNA on intestinal epithelial cells

圖3　IL-7標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3　IL-7 standard curve

IL-7為促紅細(xì)胞生成素家族Ⅰ型短鏈細(xì)胞因子，由152個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為20～28 kDa。編碼它的基因位于8q12～13，包含6個(gè)外顯子。近年來(lái)，大量研究結(jié)果表明IL-7具有良好的抗腫瘤作用，IL-7能抑制腫瘤生長(zhǎng)，有研究將重組人IL-7注射至荷人纖維肉瘤小鼠的腫瘤基底部，發(fā)現(xiàn)一定濃度的IL-7能抑制腫瘤生長(zhǎng)，甚至使部分小鼠腫塊完全消退。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，重組人IL-7腹腔用藥能增加正?；蚝闪鲂∈笃ⅰ⒘馨徒Y(jié)中白細(xì)胞數(shù)量，限制腫瘤轉(zhuǎn)移。Komschlies等［12］將IL-7用于腎癌伴有肺轉(zhuǎn)移的小鼠模型上，隨后觀察到IL-7產(chǎn)生了明顯的抗腫瘤效果，轉(zhuǎn)移灶縮少75%，伴有全身T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增多，提示IL-7提高了機(jī)體抗腫瘤能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也揭示IL-7的抗腫瘤作用與T細(xì)胞密切相關(guān)，IL-7可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟、防止其凋亡；提高T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫；抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖；增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)［13-15］。IL-7還可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子水平達(dá)到抗腫瘤作用。IL-7可以減低免疫抑制因子TGF-β分泌，提高IFN-γ、CXCL9、CXCL10、IL-1、IL-6、IL-12和IL-17等細(xì)胞因子的表達(dá)，以提高宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)效能［16-17］。因此，目前學(xué)者認(rèn)為血清中的IL-7升高是宿主免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤作用的一種表現(xiàn)形式［18］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，甘草多糖具有良好的抗腫瘤作用，可以增加荷瘤小鼠小腸粘膜上皮細(xì)胞IL-7mRNA的表達(dá)，并增加血清中IL-7的含量，采用抗體中和IL-7以后，甘草多糖抗腫瘤活性顯著降低。因此，筆者推測(cè)甘草多糖可能是作用于小腸黏膜上皮細(xì)胞，促進(jìn)其IL-7的分泌，進(jìn)而提高免疫系統(tǒng)功能，達(dá)到抗腫瘤作用。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Study on the anti-tumor effect mechanism of Gancao polysaccharide on production of IL-7

WANG Li1，3，ZHAO Ying2，CUI Huan-tian2，LI Wei2，SONG Xin-bo2，BIAN Yu-hong2
（1.The Second People's Hospital of Tianjin，Tianjin 300192，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Tianjin Medical Research Institute of Liver Disease，Tianjin 300192，China）

［Objective］To elucidate the mechanism of Gancao polysaccharide（GP）on anti-tumor.［Methods］CT-26 cells were used to set up the tumor-bearing model in mice.The mice were respectively divided into following groups：normal group，model group，GP group （GP i.g，500 mg/kg），letinan group（letinan i.g，195 mg/kg）and IL-7 antibody group（GP i.g，500 mg/kg，IL-7antibody i.p，.0.4 mg/kg on day 0，5 and 10）.After administration of GP for 14 days，the tumor，spleen and thymus were weighted to measure the tumor inhibition rat，spleen index and thymus index.［Results］After the administration of GP for 14 days，the tumor inhibition rate in GP group was 21.56%. The IL-7 gene expression in GP group was upregulated and the serum level of IL-7 was increased in GP group.The tumor inhibition rate and thymus index were decreased in IL-7 antibody group followed by the significant lower IL-7 level in serum in spite of the IL-7 gene expressed in intestine.［Conclusion］This study demonstrated that GP exert significant anti-tumor effect and the mechanism behind the anti-tumor effect may relate to the IL-7 production of intestinal epithelial cells.

Gancao polysaccharide；small intestinal mucosal epithelial cell；anti-tumor；IL-7

R285.5

A

1672-1519（2016）06-0373-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.06.14

2015-12-24）