MEF2A RNA干擾對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A表達(dá)及細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)的影響*

周文平，張　輝，張金盈

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450052　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450052　△男，1967年12月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：冠心病，E-mail:wpzhou1212@126.com

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MEF2A RNA干擾對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A表達(dá)及細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)的影響*

周文平1)△，張輝2)，張金盈2)

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 4500522)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450052△男，1967年12月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：冠心病，E-mail:wpzhou1212@126.com

摘要目的：觀察肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(MEF2A)RNA干擾對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A及細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)表達(dá)的影響。方法：培養(yǎng)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建MEF2A RNA干擾慢病毒或者陰性對(duì)照慢病毒(NC)并轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組(不加慢病毒)、NC組和MEF2A RNA干擾組3組，應(yīng)用ELISA和RT-PCR法分別檢測MEF2A及ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：ICAM-1在對(duì)照組、NC組和MEF2A RNA干擾組上清液中的表達(dá)量分別為(1.133±0.182)、(1.267±0.115)、(2.249±0.185) μg/L；VCAM-1在對(duì)照組、NC組和MEF2A RNA干擾組上清液中的表達(dá)量分別為(2.382±0.204)、(2.253±0.281)、(5.077±0.198) μg/L。ICAM-1、VCAM-1在上清液中的水平及mRNA表達(dá)水平，NC組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MEF2A RNA干擾組與對(duì)照組和NC組相比均升高(P<0.05)。結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)的MEF2A RNA干擾可抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A活性及mRNA的表達(dá)，并可促進(jìn)血管內(nèi)ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表達(dá)。

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一組動(dòng)脈硬化的血管病中常見的、最重要的一種，其癥狀主要決定于血管病變及受累器官的缺血程度。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)是目前研究較多的與AS相關(guān)的生物活性物質(zhì)[1]。MEF2A是由定位在15q26的基因編碼的具有507個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),肌細(xì)胞中MEF2A轉(zhuǎn)錄因子可與多數(shù)肌肉特異性基因調(diào)控區(qū)富含A/T的序列相結(jié)合,調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)心肌發(fā)育，并在血管生長發(fā)育過程中起重要作用[2]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)可以高效特異地阻斷特定基因的表達(dá)，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于體內(nèi)外基因功能的研究。該研究應(yīng)用體外合成的MEF2A短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，高效特異性地抑制MEF2A的表達(dá)，觀察MEF2A RNAi對(duì)MEF2A及細(xì)胞因子細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)表達(dá)的影響，為預(yù)防AS的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞購自江蘇江陰齊氏生物科技有限公司。細(xì)胞的培養(yǎng)采用江蘇江陰齊氏生物科技有限公司專利產(chǎn)品小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育培養(yǎng)。細(xì)胞凍存液配制：體積分?jǐn)?shù)10%DSMO、體積分?jǐn)?shù)50%DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清),混合均勻并過濾后備用。胰蛋白酶溶液：蒸餾水配制，濃度為2.5 g/L，注射濾器過濾除菌。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及主要步驟①實(shí)驗(yàn)共分3組，對(duì)照組、慢病毒陰性對(duì)照組(NC組)及不同靶點(diǎn)的MEF2A RNAi組(靶點(diǎn)A、B、C和D)。②MEF2A RNAi效率測定及體外靶片段篩選：對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC病毒或者不同的MEF2A RNAi慢病毒載體來確定沉默效率最高的RNAi靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。③觀察RNAi后各組(對(duì)照組、NC組和靶點(diǎn)B RNAi組)ICAM-1、VCAM-1水平及mRNA表達(dá)的變化。

1.3小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MEF2A及ICAM-1、VCAM-1水平的測定從-196 ℃液氮罐中取出小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，于37 ℃的無菌水浴槽內(nèi)迅速融化。在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染的前1 d，將生長達(dá)融合狀態(tài)的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板孵育。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將上清液移入新的96孔板中，按照MEF2A、ICAM-1、VCAM-1 ELISA檢測試劑盒說明書分別測定MEF2A、ICAM-1及VCAM-1的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

1.4小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A及ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平的測定采用RT-PCR法。用RNA提取試劑盒提取小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。MEF2A正義鏈5’-GATAGAGATTCAGTGGAGTTCC-3’，反義鏈5’-TGACAGAGTTAAAGAGGAGTGG-3’，產(chǎn)物長度104 bp；ICAM-1正義鏈5’-ATGGCTCAGCCAGGAGTTA ACG-3’，反義鏈5’-CAGCATTGGGGTCAGAC CTCTC-3’，產(chǎn)物長度182 bp；VCAM-1正義鏈5’-GCAGATGAGTTAACGGCTCAGC-3’，反義鏈5’-ACAGACCTCTCTTGGGGTCAGC-3’，產(chǎn)物長度174 bp；內(nèi)參β-actin正義鏈5’-GCTATGCTCTCCCT CACGCCAT-3’，反義鏈5’-TCACGCACGATTTC CCTCTCAG-3’，產(chǎn)物長度130 bp。PCR反應(yīng)體系共20 μL，含Taq DNA聚合酶0.5 U、各引物50 pmol。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。然后行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統(tǒng)上成像分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組間MEF2A蛋白、mRNA表達(dá)水平及上清液中ICAM-1、VCAM-1水平、mRNA表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

2結(jié)果

2.1MEF2A RNAi效率測定及體外靶片段篩選結(jié)果見表1。由表1可知，NC組與對(duì)照組相比，MEF2A表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RNAi組與對(duì)照組、NC組MEF2A表達(dá)水平進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且MEF2A靶點(diǎn)B最有效，沉默效率最高，因此，確定靶點(diǎn)B為實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)片段。

2.2ICAM-1和VCAM-1在對(duì)照組、NC組和RNAi組上清液中的表達(dá)結(jié)果見表2。由表2可知，對(duì)照組、NC組小鼠上清液中ICAM-1、VCAM-1的水平均低于RNAi組。

表1　MEF2A RNAi效率測定及體外靶片段篩選結(jié)果

表2　各組小鼠上清液中ICAM-1、VCAM-1水平的比較　μg/L

2.3MEF2A RNAi對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響結(jié)果見表3。由表3可知，NC組與對(duì)照組相比，小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RNAi組ICAM-1及VCAM-1 mRNA表達(dá)水平增高。

表3　各組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平的比較

3討論

在各種病因啟動(dòng)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,平滑肌細(xì)胞增殖形成新生內(nèi)膜，導(dǎo)致內(nèi)膜增厚、管腔狹窄，形成AS[3]。

MEF2A蛋白與血管的完整性和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存有關(guān)，有絲分裂原激活蛋白的蛋白激酶ERK5參與內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖信號(hào)的傳導(dǎo)[4]。Kato等[5]認(rèn)為,ERK5/MEF2通路通過激活KLF2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)血流介導(dǎo)的內(nèi)皮完整性。Olsen等[6]發(fā)現(xiàn)，MEF2-HDAe信號(hào)在維持血管的完整性方面有重要作用，MEF2A在血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá),對(duì)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和血管重塑具有重要作用。細(xì)胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1屬免疫球蛋白超家族成員，主要以低水平表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，功能上主要介導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，促進(jìn)淋巴細(xì)胞聚集[7]。在一般生理狀態(tài)下，非活化內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1表達(dá)水平較低；而在體內(nèi)炎性反應(yīng)的病理?xiàng)l件下，ICAM-1、VCAM-1在血管內(nèi)皮出現(xiàn)高表達(dá)[8]。在AS病變形成早期，ICAM-1、VCAM-1促進(jìn)單核細(xì)胞向內(nèi)皮黏附、遷移，通過修飾低密度脂蛋白促進(jìn)細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生，使單核細(xì)胞分化增殖，產(chǎn)生更多的細(xì)胞炎癥因子；在AS病變進(jìn)展期，ICAM-1、VCAM-1促進(jìn)已進(jìn)入病灶的單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞激活，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用；隨著AS病程的進(jìn)展，ICAM-1、VCAM-1介導(dǎo)更多的細(xì)胞進(jìn)入斑塊，促進(jìn)斑塊發(fā)展，并使斑塊的不穩(wěn)定性增加[9]。

在該研究中作者發(fā)現(xiàn)，小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A高表達(dá)，選擇沉默效率最高的目的基因片段對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行RNAi后，MEF2A蛋白及mRNA表達(dá)明顯受到影響。正常小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1及其mRNA的表達(dá)相對(duì)較低，轉(zhuǎn)染MEF2A RNAi 慢病毒載體后，ICAM-1、VCAM-1及其mRNA表達(dá)均明顯增高。NC組與對(duì)照組相比未發(fā)現(xiàn)ICAM-1、VCAM-1及其mRNA表達(dá)有任何差別，這說明NC病毒轉(zhuǎn)染不能降低ICAM-1、VCAM-1及其mRNA的表達(dá)，也說明MEF2A RNAi的有益作用并不是來源于慢病毒轉(zhuǎn)染所引起的非特異性免疫反應(yīng)。該研究結(jié)果還顯示，正常小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達(dá)較少，MEF2A RNAi后，ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達(dá)明顯上升，提示MEF2A參與了血管內(nèi)皮黏附功能和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。所以，慢病毒介導(dǎo)的MEF2A RNAi可以有效降低小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A活性及其mRNA的表達(dá)，同時(shí)，促進(jìn)AS相關(guān)因子ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表達(dá)，從而在AS的形成中發(fā)揮重要作用。

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(2015-10-04收稿責(zé)任編輯姜春霞)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.017

中圖分類號(hào)R541.4

關(guān)鍵詞小鼠；肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A；RNA干擾；ICAM-1；VCAM-1

Effects of RNA interference of myocyte enhancer factor 2A on expressions of MEF2A, ICAM-1， and VCAM-1 in mice aortic endothelial cells

ZHOU Wenping1),ZHANG Hui2),ZHANG Jinying2)

1)DepartmentofCardiovascularMedicine,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsmouse;myocyte enhancer factor 2A;RNA interference;ICAM-1;VCAM-1

AbstractAim: To identify the effects of RNA interference of myocyte enhancer factor 2A(MEF2A) on the expressions of MEF2A and relative inflammatory genes ICAM-1 and VCAM-1 in mice aortic endothelial cells. Methods: The aortic endothelial cells in mice were cultivated, then MEF2A lentivirus RNA interference or negative control lentivirus(NC) were built and transfected aortic endothelial cells in mice. The cells were allocated into control group(without lentivirus), NC group, and MEF2A RNA interference group. MEF2A,ICAM-1, and VCAM-1 expressions were detected by ELISA, and mRNA levels of MEF2A,ICAM-1, and VCAM-1 were further examined by RT-PCR.Results: In the control group, NC group, and MEF2A RNA interference group,ICAM-1 expression in the supernatant fluid were (1.133±0.182),(1.267±0.115),and (2.249±0.185) μg/L, VCAM-1 expression in the supernatant fluid were (2.382±0.204),(2.253±0.281),and (5.077±0.198) μg/L. There was no significant difference in ICAM-1 or VCAM-1 expression in the supernatant fluid between NC group and the control group(P>0.05).When MEF2A RNA interference group was compared with the control group and NC group, there were significant differences(P<0.05).Conclusion: Lentivirus-mediated RNA interference of MEF2A could inhibit the expression of MEF2A and promote intravascular ICAM-1, VCAM-1 activity mRNA expression.

*河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目14IRTSTHN018

*：與對(duì)照組和NC組相比，P<0.05;#:與其他3個(gè)RNAi組相比，P<0.05。

*：與對(duì)照組和NC組相比，P<0.05。

*：與對(duì)照組和NC組相比，P<0.05。