臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素對(duì)肺纖維化小鼠的早期干預(yù)效果*

楊　宇， 袁曉梅， 趙　欣,吳敏娜，高新愿，許芝山， 鐘根深#， 郭悅鵬#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科 衛(wèi)輝 453100　2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室 新鄉(xiāng) 453000　3)河南省神經(jīng)病學(xué)研究所生物治療實(shí)驗(yàn)室 衛(wèi)輝 453100

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臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素對(duì)肺纖維化小鼠的早期干預(yù)效果*

楊宇1)， 袁曉梅1)， 趙欣1),吳敏娜2)，高新愿1)，許芝山3)， 鐘根深3)#， 郭悅鵬1)#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科 衛(wèi)輝 4531002)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室 新鄉(xiāng) 4530003)河南省神經(jīng)病學(xué)研究所生物治療實(shí)驗(yàn)室 衛(wèi)輝 453100

摘要目的：探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素對(duì)肺纖維化小鼠的早期治療效果及作用機(jī)制。方法：健康成年清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠40只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(n=8):對(duì)照組(氣管內(nèi)注入生理鹽水，48 h后尾靜脈注射生理鹽水)、模型組(氣管內(nèi)注入博來霉素，48 h后尾靜脈注射生理鹽水)、鹽酸多西環(huán)素組(氣管內(nèi)注入博來霉素，48 h后腹腔注射鹽酸多西環(huán)素，隔日注射1次，連用4次)、干細(xì)胞組(氣管內(nèi)注入博來霉素，48 h后尾靜脈注射UC-MSCs)、聯(lián)合組(氣管內(nèi)注射博來霉素，48 h后尾靜脈注射UC-MSCs聯(lián)合腹腔注射鹽酸多西環(huán)素，隔日注射1次，連用4次)。于造模第28天，取小鼠右肺組織行HE、Masson染色，進(jìn)行肺泡炎評(píng)分及肺纖維化評(píng)分；取左肺組織測(cè)定羥脯氨酸含量。采用免疫組化法檢測(cè)MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，干細(xì)胞組和鹽酸多西環(huán)素組肺泡炎及肺纖維化程度減輕，羥脯氨酸含量降低，MMP-9蛋白的表達(dá)減弱，TIMP-1蛋白的表達(dá)升高，聯(lián)合組以上指標(biāo)改善最為顯著(P<0.05)。結(jié)論：早期應(yīng)用UC-MSCs聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素能夠顯著減輕小鼠肺纖維化程度，其機(jī)制可能與提高TIMP-1表達(dá)、抑制MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

近年肺纖維化發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，目前尚無有效治療方法；肺纖維化預(yù)后不良，中位生存期一般僅為3～5 a[1]。肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但已有證據(jù)[2]表明，與致病因子引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)過度降解、纖維細(xì)胞分泌過量膠原物質(zhì)有關(guān)，其中MMPs為降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要因子?，F(xiàn)有研究[3-4]證實(shí)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)及鹽酸多西環(huán)素均具有糾正細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡、治療肺纖維化的作用。該研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討UC-MSCs聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素對(duì)肺纖維化的早期干預(yù)效果。

1材料與方法

1.1材料40只8周齡雌性清潔級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。博來霉素(日本化藥株式會(huì)社)，鹽酸多西環(huán)素(?？谄媪⒅扑幑煞萦邢薰?，羥脯氨酸試劑盒(南京建成科技有限公司)，兔抗人PerCP-CD34、APC-CD45、FITC-CD90、PE-CD166單克隆抗體(美國(guó)Becton Dickinson公司)，兔抗鼠MMP-9、TIMP-1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?，改良Masson三色染色液試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)。手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠)，超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、倒置相差顯微鏡及其他常用試劑由河南省神經(jīng)病學(xué)研究所提供。臍帶取自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科健康足月順產(chǎn)新生兒。研究經(jīng)該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，產(chǎn)婦及家屬簽署知情同意書。

1.2UC-MSCs的制備、分離與鑒定剪取5 cm新鮮臍帶，清洗后用解剖剪剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，放入培養(yǎng)瓶中，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜止培養(yǎng)7 d后可見長(zhǎng)梭形細(xì)胞從組織塊下方長(zhǎng)出，以后每3 d換液1次。第11天，當(dāng)組織塊周圍細(xì)胞團(tuán)較密集時(shí)，丟棄組織塊，加入12.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化，離心后以PBS洗3遍，最后在PBS中吹打懸勻，制成1×109L-1的細(xì)胞懸液，分5管，除空白管外，向各實(shí)驗(yàn)管分別加入PerCP-CD34、APC-CD45、FITC-CD90、PE-CD166標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，暗室內(nèi)孵育30 min后PBS洗2遍，再加入PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與標(biāo)本收集40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(n=8):對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、鹽酸多西環(huán)素組(C組)、干細(xì)胞組(D組)、聯(lián)合組(E組)。小鼠用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛按5 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。頸部皮膚備皮，消毒后在手術(shù)顯微鏡下縱向切開皮膚0.5 cm，鈍性分離肌肉，暴露氣管。手術(shù)顯微鏡下用1 mL注射器向A組小鼠氣管內(nèi)注入100 μL生理鹽水，其他4組注射相同體積的博來霉素溶液(3.5 mg/kg)。拔出針頭后，立即將操作臺(tái)直立，左右旋轉(zhuǎn)1 min。造模后48 h，A、B組小鼠由尾靜脈注入生理鹽水200 μL；C組腹腔注入200 μL(20 mg/kg)鹽酸多西環(huán)素，隔日注射1次，連用4次；D組尾靜脈注入U(xiǎn)C-MSCs 200 μL(約含細(xì)胞數(shù)1×106)；E組尾靜脈注入U(xiǎn)C-MSCs，腹腔注入鹽酸多西環(huán)素，用法用量同上。于造模后第28天，麻醉小鼠，固定于手術(shù)臺(tái)上，胸部開口，剪斷胸骨，用生理鹽水灌洗肺部，摘取肺臟。取右肺放入40 g/L多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，左肺凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4肺組織病理學(xué)評(píng)分對(duì)石蠟切片行HE染色、Masson染色，在光鏡下參考Szapiel等[5]提供的方法(表1)，根據(jù)HE染色評(píng)價(jià)肺泡炎程度，根據(jù)Masson染色評(píng)價(jià)肺纖維化程度。

表1　小鼠肺泡炎與肺纖維化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5肺組織羥脯氨酸含量的測(cè)定取60 mg凍存肺組織，采用堿性水解法測(cè)定肺組織中羥脯氨酸含量，操作步驟按羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行。羥脯氨酸含量=(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管含量(5 mg/L)×水解液總體積(10 mL)/肺組織濕重(mg)。

1.6肺組織中MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)水平的測(cè)定取各組小鼠肺組織石蠟切片，按照免疫組化試劑盒操作步驟進(jìn)行，染色封片后在顯微鏡下觀察，每張切片選取5個(gè)視野(×200)。細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。評(píng)分:未著色為0分，輕度著色為1分，中度著色為2分，高度著色為3分。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理選用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較5組小鼠病理學(xué)評(píng)分、肺組織羥脯氨酸含量以及肺組織中MMP-9 和TIMP-1蛋白的表達(dá)水平，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1UC-MSCs的鑒定檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)管細(xì)胞CD166(陽(yáng)性百分比為94.52%)、CD90(陽(yáng)性百分比為97.84%)高表達(dá)，CD45(陽(yáng)性百分比為0.22%)、CD34(陽(yáng)性百分比為0.08%)低表達(dá)。

2.2病理觀察結(jié)果見圖1。HE染色:鏡下可見A組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔未見增厚，偶見炎性細(xì)胞滲出；B組正常肺泡結(jié)構(gòu)消失,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)可見中等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；D組大部分肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔增厚，偶見肺泡壁塌陷，近支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；E組僅近胸膜處有炎性浸潤(rùn)，少量肺泡間隔稍增厚，絕大部分肺泡結(jié)構(gòu)正常。Masson 染色：A組肺泡間隔內(nèi)見淡藍(lán)色壁狀膠原染色，為正常肺泡成分；B組滿視野藍(lán)色膠原纖維滲出；C組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂區(qū)域見大量藍(lán)色條索狀膠原纖維滲出；D組少數(shù)肺泡腔內(nèi)見片狀藍(lán)色膠原纖維滲出；E組僅近胸膜處見少量藍(lán)色膠原纖維滲出。各組肺泡炎和纖維化評(píng)分見表2，由表2可知，模型組(B組)肺泡炎和肺纖維化程度最嚴(yán)重，而給予鹽酸多西環(huán)素(C組)和干細(xì)胞(D組)后均減輕，2藥聯(lián)合(E組)則最輕。

2.3肺組織中羥脯氨酸含量比較各組肺組織羥脯氨酸含量均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

2.4各組小鼠肺組織中MMP-9 和TIMP-1蛋白的表達(dá)情況見圖1、表3。

表2　5組小鼠病理學(xué)評(píng)分及肺組織羥脯氨酸含量

從左至右：分別為A、B、C、D、E組;1:HE染色；2: Masson 染色；3:MMP-9；4：TIMP-1。圖1　5組小鼠HE、Masson及免疫組化染色結(jié)果(×200)

組別nMMP-9TIMP-1A組80.63±0.35*1.10±0.19*B組82.63±0.250.58±0.17C組81.63±0.35*0.70±0.19D組81.60±0.47*2.05±0.21*△E組80.88±0.28*△#2.15±0.18*△F40.911129.427P<0.001<0.001

3討論

目前構(gòu)建小鼠肺纖維化模型的常用方法為肉眼下頸部切開，分離氣管后用1 mL注射器將博來霉素注入小鼠氣管內(nèi)[6]。作者在造模過程中發(fā)現(xiàn)此種造模方式對(duì)小鼠損傷較大，易損傷頸部血管，造成小鼠失血休克死亡，同時(shí)用注射器穿刺氣管時(shí)易穿透氣管，造成藥液外滲，導(dǎo)致造模效果不佳。作者將此種造模方式改良，在手術(shù)顯微鏡下操作，有效避開頸部血管，手術(shù)顯微鏡下可清晰尋找到氣管軟骨間隙，確保博來霉素溶液準(zhǔn)確灌入氣管內(nèi),造模效果均一。

臨床常用治療肺纖維化的藥物有糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、秋水仙堿等，此類藥物可阻止過度免疫反應(yīng)，緩解患者癥狀，但并未改善患者的生存率及肺功能，且副作用大[7]?，F(xiàn)今肺纖維化新型藥物的研發(fā)重點(diǎn)已從抗機(jī)體炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)移到抗細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維化。抑制生物因子活性的抗肺纖維化藥物已逐漸應(yīng)用于臨床，如生長(zhǎng)因子TGF-β抑制劑、吡非尼酮、尼達(dá)尼布等[8]。但這些生物因子抑制劑作用靶點(diǎn)過于單一，不能很好地抑制由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子交互作用產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)過度纖維化，且臨床應(yīng)用時(shí)間尚短，療效及相關(guān)副作用有待時(shí)間考證。

近年在實(shí)驗(yàn)室研究中間充質(zhì)干細(xì)胞治療肺纖維化顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。與細(xì)胞活性因子相比，間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞活性物質(zhì)調(diào)控基質(zhì)修復(fù)過程。與其他間充質(zhì)干細(xì)胞相比，UC-MSCs因來源于分娩廢棄物，易獲取，且采取過程中不會(huì)給供體帶來任何痛苦而擁有廣闊的臨床應(yīng)用前景[9]。在對(duì)UC-MSCs治療肺纖維化的機(jī)制研究中，有研究[10]認(rèn)為UC-MSCs可在肺部分化為肺泡上皮細(xì)胞，直接修復(fù)損傷肺組織，抑制肺部纖維化，但UC-MSCs肺部植入率偏低，且不具有定向分化為肺泡上皮細(xì)胞的能力，故轉(zhuǎn)分化機(jī)制不應(yīng)是UC-MSCs治療肺纖維化的主要機(jī)制。大部分研究[11-12]表明UC-MSCs可旁分泌細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如直接分泌IL-10、IL-13抑制炎癥反應(yīng)，抑制TGF-β、TNF-α、VEGF的產(chǎn)生或活性，調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs平衡等。

鹽酸多西環(huán)素作為一種半合成抑菌類抗生素，已長(zhǎng)期運(yùn)用于臨床抗感染治療中。近年來發(fā)現(xiàn)其可以通過螯合Zn2+和Ca2+，特異性抑制MMPs活性，同時(shí)還能直接或間接抑制IL-1、NO、uPA釋放或表達(dá)來減輕纖維素滲出性病變[14]。現(xiàn)有研究[15]亦證明鹽酸多西環(huán)素可顯著減輕肺纖維化。該研究結(jié)果表明UC-MSCs、鹽酸多西環(huán)素均可減輕小鼠肺纖維化程度且二者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳，其機(jī)制可能為UC-MSCs聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素可增強(qiáng)對(duì)MMP-9的抑制作用。

UC-MSCs與鹽酸多西環(huán)素聯(lián)用對(duì)肺纖維化的改善作用是否存在其他機(jī)制還需進(jìn)一步探討。另外在博來霉素致小鼠肺損傷的早期，小鼠肺部感染的幾率增加，鹽酸多西環(huán)素可以有效控制感染，也是其減輕肺纖維化程度的原因[16]。

總之，早期應(yīng)用UC-MSCs聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素能夠顯著減輕小鼠肺纖維化程度，其機(jī)制可能為UC-MSCs能提高TIMP-1表達(dá)，且聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素能夠抑制MMP-9的表達(dá)。該結(jié)果有可能為臨床治療肺纖維化提供新的思路。

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(2015-09-14收稿責(zé)任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.014

#通信作者:郭悅鵬，男，1957年10月生，本科，主任醫(yī)師，教授，研究方向：呼吸疾病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:guoyuepeng2517@163.com；鐘根深，男，1981年3月生，博士，副教授，研究方向：生物治療的基礎(chǔ)及臨床研究，E-mail：zhonggs@xxmu.edu.cn

中圖分類號(hào)R563

關(guān)鍵詞臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;鹽酸多西環(huán)素;肺纖維化;MMP-9;TIMP-1;小鼠

Effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation combined with doxycycline on mice with early stage pulmonary fibrosis

YANG Yu1)，YUAN Xiaomei1),ZHAO Xin1),WU Minna2),GAO Xinyuan1), XU Zhishan3), ZHONG Genshen3), GUO Yuepeng1)

1)DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Weihui4531002)DepartmentofMicrobiology,BasicMedicalCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang4530003)LaboratoryofBiotherapy,InstituteofNeurologyinHenanProvince,Weihui453100

Key wordsUC-MSC;doxycycline hydrochloride;pulmonary fibrosis;MMP-9;TIMP-1;mouse

AbstractAim: To investigate the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(UC-MSCs) transplantation and doxycycline in a mice model of pulmonary fibrosis and its mechanism． Methods: A total of 40 C57BL/6 female mice were randomly allocated into 5 groups.Mice in control group were intratracheally injected with NS under operating microscope. Mice in other groups were intratracheally injected with bleomycin. After 48 h, mice in the control and model group were injected with normal saline via the tail vein, mice in the doxycycline group were injected with doxycycline via abdomen, mice in the stem cell group were injected with UC-MSCs via the tail vein,and mice in the combination treatment group were given UC-MSCs plus doxycycline. On the 28th day, the lung tissue was collected. Histopathological scoring of alveolitis and pulmonary fibrosis was performed according to Szapiel's method. The content of hydroxyproline was determined using alkaline hydrolysis method. The expressions of MMP-9 and TIMP-1 were determined using immunohistochemistry. Results: Compared with the model group, the alveolitis and pulmonary fibrosis in the stem cell group and doxycycline group alleviated, the content of hydroxyproline and the expression of MMP-9 decreased, while the expression of TIMP-1 increased, and the above parameters improved most significantly in the combination treatment group(P<0.05). Conclusion: UC-MSCs transplantation and doxycycline can relieve bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. The mechanism might be related with inhibiting MMP-9 and inducing TIMP-1 expression.

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81201765；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新支持計(jì)劃資助項(xiàng)目YJSCX20406Z

*：5組間兩兩相比，P均<0.05。

*：與B組比較，P<0.05；△：與C組比較，P<0.05；#：與D組比較，P<0.05。