4.1R基因敲除小鼠血液生理生化參數(shù)分析*

禹麗娜,李建輝，張麗果，寧姝威，薛超越，范丹丹，楊小靜，裘一兵，康巧珍，汲振余#

1)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院腫瘤病理科 鄭州 450052　2)鄭州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450000　3)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

?

4.1R基因敲除小鼠血液生理生化參數(shù)分析*

禹麗娜1,2),李建輝1,3)，張麗果1)，寧姝威1,3)，薛超越1,3)，范丹丹1)，楊小靜1)，裘一兵1)，康巧珍3)，汲振余1)#

1)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院腫瘤病理科 鄭州 4500522)鄭州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 4500003)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

摘要目的：檢測(cè)并分析蛋白4.1R基因敲除小鼠(4.1R-/-)和野生型小鼠(4.1R+/+)血液生理生化參數(shù)。方法：摘眼球法采集兩組小鼠(n=6)血液，用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀和生化分析儀檢測(cè)血液生理生化參數(shù)。結(jié)果：血液生理參數(shù)中，4.1R-/-小鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和中性粒細(xì)胞比率顯著低于野生型小鼠(P<0.05)；血小板計(jì)數(shù)、平均血小板體積、血小板壓積、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞比率顯著高于野生型小鼠(P<0.05)。生化參數(shù)中，4.1R-/-小鼠堿性磷酸酶顯著低于野生型小鼠，總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素顯著高于野生型小鼠(P<0.05)。結(jié)論：蛋白4.1R缺失可導(dǎo)致慢性溶血性貧血，4.1R-/-小鼠相關(guān)血液生理生化參數(shù)隨之改變。

蛋白4.1R是最初發(fā)現(xiàn)于成熟紅細(xì)胞中的細(xì)胞膜骨架蛋白分子，是紅細(xì)胞膜骨架的一個(gè)基本成分[1]，有相對(duì)分子質(zhì)量為80 000、135 000兩種亞型[2]。目前，該蛋白在紅細(xì)胞中的功能研究比較透徹，但在有核細(xì)胞中的功能還不清楚。4.1R蛋白缺乏會(huì)降低有核細(xì)胞E-鈣黏蛋白與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)合能力并破壞細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸[3]，影響角質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移[4]。CD4+T淋巴細(xì)胞中4.1R蛋白能與L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(L-type amino acid transporter,LAT)結(jié)合并抑制ZAP-70對(duì)LAT的磷酸化，負(fù)調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞的活化[5]。為進(jìn)一步研究蛋白4.1R在T細(xì)胞中的功能，作者從美國(guó)紐約血液中心引進(jìn)并建立了4.1R基因敲除(4.1R-/-)小鼠模型，對(duì)其血液生理和生化參數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，以豐富4.1R-/-小鼠模型相關(guān)資料，為后續(xù)研究與應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4.1R-/-小鼠與4.1R+/+野生型小鼠，遺傳背景為C57BL/6，SPF級(jí)，均來(lái)自該實(shí)驗(yàn)室。小鼠按SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于IVC-Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中。環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，照明12 h亮暗交替，空氣潔凈度1萬(wàn)級(jí)。飲水為經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌的蒸餾水，飼料為河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的經(jīng)鈷60照射滅菌的SPF級(jí)飼料。

1.2小鼠基因型鑒定隨機(jī)選取8周齡4.1R-/-小鼠與4.1R+/+小鼠各6只，取肝臟，研磨提取RNA反轉(zhuǎn)錄(42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min)，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，30個(gè)循環(huán)。4.1R引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，正向引物1序列：5’-ATGACAACAGAGAAGAGTTTAGTG GCTGAAGC-3’，正向引物2序列：5’-ATGCACTGTA AGGTCTCCTTGTTGGATGACACG-3’，共同反向引物序列：5’-CTCCTCAGAGATCTCTGTCTCCTGGTGGA-3’。產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出1 700 bp與2 500 bp片段的為4.1R+/+小鼠，無(wú)擴(kuò)增片段的為4.1R-/-小鼠。

1.3血液生理參數(shù)檢測(cè)取8周齡 4.1R-/-小鼠與4.1R+/+小鼠各6只，空腹12 h，摘除眼球法取血，每只取血0.8 mL左右，裝入2 mL加有抗凝劑的采血管中，使用全自動(dòng)血液分析儀(Pentra80，法國(guó)ABX公司)檢測(cè)血液生理參數(shù)[6]。

1.4生化參數(shù)檢測(cè)取8周齡4.1R-/-小鼠與4.1R+/+小鼠各6只，空腹12 h，摘除眼球法取血，每只取血0.8 mL左右，收集入未加抗凝劑的采血管中，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血清。使用全自動(dòng)生化分析儀(BT2000Plus，意大利)檢測(cè)血液生化參數(shù)[7]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組小鼠血液生理生化參數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1小鼠基因型鑒定PCR擴(kuò)增后，4.1R+/+小鼠成功擴(kuò)增出2條條帶，大小分別為1 700 bp與2 500 bp，而4.1R-/-小鼠沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，表現(xiàn)為完全缺失(圖1)。

2.2兩組小鼠血液生理參數(shù)的比較見(jiàn)表1。4.1R-/-小鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)和中性粒細(xì)胞比率(NEU)低于4.1R+/+小鼠(P<0.01)，而血小板計(jì)數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)和淋巴細(xì)胞比率(LYM)高于4.1R+/+小鼠(P<0.05)。二者的單核細(xì)胞比率(MON)、嗜酸性粒細(xì)胞比率(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞比率(BAS)、異淋巴細(xì)胞百分比(ALY)、巨大不成熟細(xì)胞百分比(LIC)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　兩組小鼠血液生理參數(shù)的比較

2.3兩組小鼠血液生化參數(shù)的比較見(jiàn)表2。4.1R-/-小鼠堿性磷酸酶(ALP)水平低于4.1R+/+小鼠(P<0.05)；總膽紅素(T-BIL)、直接膽紅素(D-BIL)和間接膽紅素(I-BIL)水平高于4.1R+/+小鼠(P<0.05)。二者的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2　兩組小鼠血液生化參數(shù)的比較

3討論

蛋白4.1R在紅細(xì)胞膜上一端連接跨膜蛋白，一端連接血影蛋白-肌動(dòng)蛋白骨架，對(duì)維持紅細(xì)胞的形狀、黏附、脆性及正常生理功能具有重要作用[8]。4.1R基因敲除會(huì)引起紅細(xì)胞的畸形以及溶血[9-10]。蛋白4.1R缺失會(huì)導(dǎo)致人類紅細(xì)胞呈橢圓形，而4.1R-/-小鼠紅細(xì)胞更多地呈現(xiàn)為球形[11]。該實(shí)驗(yàn)中作者對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的基因型進(jìn)行了鑒定，確定了小鼠的基因型，4.1R-/-小鼠具有穩(wěn)定的遺傳特性。作者在400倍顯微鏡下觀察，并未發(fā)現(xiàn)4.1R+/+小鼠與4.1R-/-小鼠血涂片有異常。小鼠血液生理生化參數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，4.1R-/-小鼠血液中HGB水平低于4.1R+/+小鼠。一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物血液中HGB含量越多，紅細(xì)胞最大脆性越小[12]。因此，4.1R-/-小鼠紅細(xì)胞最大脆性大于4.1R+/+小鼠，相應(yīng)地其抗張力和變形能力降低，故具有易溶血傾向。變形能力差的紅細(xì)胞不易或不能通過(guò)直徑比它小很多的脾竇微循環(huán)，而阻留在脾臟內(nèi)，被巨噬細(xì)胞破壞。肝臟也可清除改變顯著的異常紅細(xì)胞。較大量血管外溶血時(shí)，膽紅素與葡萄糖醛酸不能及時(shí)結(jié)合，血液中I-BIL含量升高，可能會(huì)出現(xiàn)黃疸。在小鼠血液生化參數(shù)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，4.1R-/-小鼠血液中I-BIL含量偏高。據(jù)此判斷，蛋白4.1R缺失小鼠紅細(xì)胞易出現(xiàn)溶血。長(zhǎng)期的慢性溶血使得4.1R-/-小鼠發(fā)生貧血現(xiàn)象，造成RBC降低，HCT變小，PLT升高，肝功能指標(biāo)ALP降低。

研究[11]顯示，蛋白4.1R缺失后，小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期縮短，增殖能力變強(qiáng)。該研究中，血液生化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示4.1R-/-小鼠血液中WBC減少，其中LYM偏高，NEU偏低，此現(xiàn)象與蛋白4.1R在CD8+T淋巴細(xì)胞中的功能是否具有相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

雖然4.1R-/-小鼠易發(fā)生慢性溶血性貧血，但是在SPF飼養(yǎng)條件下，其與4.1R+/+小鼠相比在外觀形態(tài)、體重、日?；顒?dòng)等方面并無(wú)明顯差異。4.1R-/-小鼠也具有正常的生存能力和生育能力，因此是研究蛋白4.1R功能的有效動(dòng)物模型。4.1R-/-小鼠血液生理生化參數(shù)指標(biāo)系統(tǒng)的建立，為研究蛋白4.1R在紅細(xì)胞發(fā)育、T淋巴細(xì)胞功能及相關(guān)疾病中的作用提供了基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)

[1]SALOMAO M,ZHANG XH,YANG Y.Protein 4.1R-dependent multiprotein complex:new insights into the structural organization of the red blood cell membrane[J]. Proc Natil Acad Sci USA,2008,105(23):8026

[2]BAZZINI C,BENEDETTI L,CIVELLO D,et al.ICln: a new regulator of non-erythroid 4.1R localisation and function[J].PLoS One,2014,9(10):e108826

[3]YANG S,GUO X,DEBNATH G,et al.Protein 4.1R links E-cadherin/beta-catenin complex to the cytoskeleton through its direct interaction with beta-catenin and modulates adherens junction integrity[J].Biochim Biophys Acta,2009,1788(7):1458

[4]LOSPITAO E,PéREZ-FERREIRO CM,GOSLBEZ A,et al.An internal ribosome entry site element directs the synthesis of the 80 kDa isoforms of protein 4.1R[J].BMC Biol,2008,6(1):51

[5]KANG Q,YU Y,PEI X,et al.Cytoskeletal protein 4.1R negatively regulates T-cell activation by inhibiting the phosphorylation of LAT[J].Blood,2009,113(24):6128

[6]杜靜,葉亮,林欣乾,等.白細(xì)胞介素-10基因敲除小鼠血液生理生化指標(biāo)分析[J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(14):2138

[7]王宇,吳旭穎,魏詔盛,等.Rag2敲除小鼠臟器重量、血液生理生化指標(biāo)及免疫細(xì)胞的研究[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2014,5(5):56

[8]SHI ZT,AFZAL V,COLLER B,et al.Protein 4.1R-deficient mice are viable but have erythroid membrane skeleton abnormalities[J].J Clin Invest,1999,103(3):331

[9]李津嬰,葉煦亭,黃正霞,等.中國(guó)人先天性溶血性貧血紅細(xì)胞膜骨架4.1蛋白電泳變異型[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(9):967

[10]KAPUS A,GRINSTEIN S,WASAN S,et al.Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+exchanger stably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence, osmotic sensitivity, and role in cell proliferation[J].J Biol Chem,1994,269(38):23544

[11]GAUTHIER E,GUO X,MOHANDAS N,et al.Phosphorylation-dependent perturbations of the 4.1R-associated multiprotein complex of the erythrocyte membrane[J].Biochemistry,2011,50(21):4561

[12]王楊科,毛治彥,李麗霞.黃鱔血液生理參數(shù)的研究[J].氨基酸和生物資源,2002,24(1):7

(2015-10-14收稿責(zé)任編輯王曼)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.008

#通信作者，男，1965年8月生，博士，研究員，研究方向：蛋白功能與腫瘤，E-mail:jizhenyu@zzu.edu.cn

中圖分類號(hào)R-332

關(guān)鍵詞4.1R；血液生理生化參數(shù)；溶血性貧血；小鼠

Analysis on blood physiological and biochemical parameters of 4.1R gene knockout mice

YU Lina1,2),LI Jianhui1,3)，ZHANG Liguo1)，NING Shuwei1,3)，XUE Chaoyue1,3)，F(xiàn)AN Dandan1),YANG Xiaojing1)，QIU Yibing1)，KANG Qiaozhen3), JI Zhenyu1)

1)DepartmentofTumorPathology,HenanInstituteofPharmaceuticalScience,Zhengzhou450052 2)DepartmentofGastroenterology,ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou4500003)SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsprotein 4.1R；blood physiological and biochemical parameter；hemolytic anemia；mouse

AbstractAim: To detect and analyze blood physiological and biochemical parameters of 4.1R gene knockout mice(4.1R-/-) and wild-type (4.1R+/+) mice. Methods: Blood samples of 4.1R-/-mice and wild-type mice were collected by enucleating of eyeball, followed by blood physiological and biochemical parameters testing with automatic blood cell analyzer and biochemical analyzer. Results: Compared with those of the wild-type mice,RBC, HGB, HCT,and NEU of 4.1R-/-mice were obviously lower(P<0.05);while PLT,MPV,PCT,WBC and LYM of 4.1R-/-mice were obviously higher(P<0.05). ALP,one of biochemical parameters, was significantly lower,while T-BIL, D-BIL and I-BIL of 4.1R-/-mice were significantly higher(P<0.05). Conclusion: Deletion of protein 4.1R might result in chronic hemolytic anemia, and changes of blood physiological and biochemical parameters may be basic information for the further study with 4.1R-/-mice model.

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81172784,30972707