阿維A對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3 mRNA的影響及增液湯含藥血清的調(diào)節(jié)作用

王紅梅，劉琳，林書祥，王維（.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 000；.山西省晉城市人民醫(yī)院，晉城 048000；.天津市兒童醫(yī)院，天津 004）

阿維A對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3 mRNA的影響及增液湯含藥血清的調(diào)節(jié)作用

王紅梅1，劉琳2，林書祥3，王維3
（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；2.山西省晉城市人民醫(yī)院，晉城 048000；3.天津市兒童醫(yī)院，天津 300134）

目的觀察阿維A對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)水通道蛋白3（AQP3）mRNA的影響及增液湯含藥血清的調(diào)節(jié)作用。方法應(yīng)用不同濃度阿維A及增液湯干預(yù)HaCaT細(xì)胞，熒光定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）測(cè)定HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果阿維A溶液干預(yù)下的HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA表達(dá)下降，呈劑量依賴性；增液湯含藥血清干預(yù)下HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA的表達(dá)上升，呈劑量依賴性；HaCaT細(xì)胞在增液湯含藥血清與阿維A共同干預(yù)下的AQP3 mRNA表達(dá)水平高于同等濃度阿維A溶液干預(yù)的表達(dá)。結(jié)論阿維A溶液下調(diào)HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA表達(dá)，增液湯含藥血清可以抑制這種下調(diào)作用。

阿維A；增液湯；水通道蛋白3，HaCaT細(xì)胞

隨著阿維A應(yīng)用到臨床治療銀屑病，其不良反應(yīng)也逐漸顯現(xiàn)出來，主要不良反應(yīng)是皮膚黏膜的干燥，發(fā)生率將近100%。皮膚干燥帶來的瘙癢、皸裂不僅降低了患者的生存質(zhì)量，而且增加了皮膚黏膜潛在感染的危險(xiǎn)，所以有效緩解阿維A帶來的皮膚黏膜干燥損害，將是增加阿維A安全應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵。

研究發(fā)現(xiàn)，AQP3 mRNA作為存在于皮膚的一種能快速轉(zhuǎn)運(yùn)水的膜整合蛋白，其高表達(dá)可以提高表皮水份的輸送及增強(qiáng)皮膚的保水能力，緩解皮膚干燥。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)中醫(yī)滋陰潤(rùn)燥的經(jīng)典方劑“增液湯”對(duì)于緩解阿維A引起的皮膚干燥有良好的緩解作用，在此我們觀察增液湯對(duì)阿維A引起的HaCaT細(xì)胞的AQP3mRNA表達(dá)的影響，從而探討增液湯治療皮膚干燥的機(jī)制，為該方的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株、大鼠人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞株（GDC106HaCaT），SD大鼠［合格證號(hào)SCXK（京）2002－0003］。

1.1.2主要試劑阿維A膠囊（重慶華邦藥業(yè)），中藥飲片購(gòu)自天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院百草堂藥房，二甲基亞礬（美國(guó)Sigma），細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清（Hyelonegongsi），TRIzol Reagent（Invitrogen公司），cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.1.3主要設(shè)備儀器超凈工作臺(tái)（CJT-16）（蚌埠凈化設(shè)備廠），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（311）（Thermo Forma），相差倒置顯微鏡（IX71）（日本OLympus公司），冰凍離心機(jī)（5180R）（Eppendorf），熒光定量PCR儀（GR-3000）（澳大利亞南Corbett Research）。

1.1.4引物序列GAPDH，擴(kuò)增產(chǎn)物313 bP；上游引物：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′；下游引物：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。AQP3，擴(kuò)增產(chǎn)物 226 bp：上游引物：5′-AGACAGCCC CTTVAGGATTT-3′；下游引物：5′-TCCCTTGCCC TGAATATCTC-3′。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1含藥血清的制備

1.2.1.1SD大鼠雄性，200～220 g，室溫22℃，相對(duì)濕度60%，常規(guī)喂養(yǎng)，禁食不禁水24 h后稱質(zhì)量，按人與動(dòng)物體表面積折算等效劑量比值表計(jì)算每日灌胃藥量，每日上午9∶00灌胃，灌胃7 d。

1.2.1.2灌胃藥物的制備玄參30 g，麥冬24 g，生地24 g。制成含生藥量2 g/mL的藥液，滅菌后分裝，密封4℃冰箱保存。

1.2.1.3含藥血清的制備心臟取血，2 500 r/min，5 min離心后，取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾，-20℃保存。

1.2.1.4阿維A溶液的制備按分子質(zhì)量計(jì)算，將阿維A膠囊溶于DMSO，制備成含10-5mmol/L阿維A濃度的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，37℃，CO2恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組①空白對(duì)照組：不加入干預(yù)藥物；②阿維A干預(yù)組：分別加入含10-5、10-6、10-7mol/L阿維A溶液培養(yǎng)24 h。③增液湯含藥血清干預(yù)組：含3%、5%增液湯含藥血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。④空白血清干預(yù)組：含3%、5%空白血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。⑤阿維A溶液與增液湯含藥血清共同干預(yù)組：含10-5、10-6、10-7mol/L阿維A的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后分別加入含5%增液湯含藥血清的培養(yǎng)液。⑥阿維A溶液與空白血清共同干預(yù)組：含10-5、10-6、10-7mol/L阿維A的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后分別加入含5%空白血清的培養(yǎng)液。

1.4MTT法檢測(cè)藥物干預(yù)對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）

1.5.1總RNA提取收集HaCaT細(xì)胞，向每管約5×106個(gè)細(xì)胞中加入0.5 mL Trizol總RNA提取試劑，輕輕吹打，室溫靜置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分解，加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置10 min，4℃，12 000 r/min，離心15 min，將上層水相移至新的EP管中，加入異丙醇，混勻，室溫靜置10min，4℃，12000r/min，離心15min，棄液，加入1mL 75%乙醇洗RNA 1次，4℃，12 000 r/min，離心5 min，棄液，重復(fù)1次。4℃，12 000 r/min，離心5 min，吸凈殘存液體，室溫干燥。用0.1 mL DEPC水溶解RNA，55℃孵育10 min。取10 μL RNA溶液，加990 μL DEPC水稀釋，在紫外分光光度計(jì)內(nèi)測(cè)定RNA溶液在260 nm及280 nm處的光密度（OD）值。OD：60/ OD：50＞1.7時(shí)標(biāo)本可用，否則重新提取。根據(jù)OD26值計(jì)算RNA濃度。

1.5.2逆轉(zhuǎn)錄在冰浴的無核酸酶的離心管中加入2μg總RNA，2μLRandom，2μLdNTP，補(bǔ)RNasefree水定容至13.5 μL。70℃加熱5 min后迅速在冰上冷卻2 min，瞬時(shí)離心收集反應(yīng)液后加入4 μL 5× First-StrandBuffe，1 μL 0.1M DTT，0.5 μL RNasin。加1μLTIANScriptM-MLV混勻。25℃溫浴10min，42℃溫浴50 min，95℃加熱5 min終止反應(yīng)，RNase-free dd H2O將體系稀釋至30 μL，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3RT-PCR反應(yīng)20×SYBRsolution室溫平衡并徹底混勻。將125 μL 20×SYBRsolution加入至1 mL 2.5×RealMasterMix中。在平頭PCR管中分別加入2.5×RealMasterMix/20×SYRBsolution 9 μL，正向引物及負(fù)向引物各2 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，超純水5 μL。反應(yīng)體系為20 μL。在RG3 000定量PCR儀上按照RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃起始變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)AQP3基因進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理相應(yīng)數(shù)據(jù)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，成組數(shù)據(jù)多樣本均數(shù)比較用方差分析，組間比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同藥物處理后HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA表達(dá)的變化分析RT-PCR結(jié)果，以陰性組為基準(zhǔn)，預(yù)設(shè)其AQP3 mRNA表達(dá)水平為1.0，采用單因素4水平設(shè)計(jì)定量資料的方差分析，顯示組間總體來說差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2　結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)藥物干預(yù)對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用①阿維A溶液對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖有抑制作用，隨著阿維A濃度的增加，對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增加，阿維A濃度10-6mmol/L、10-7mmol/L阿維A溶液對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用較小（P＜0.05）。②增液湯含藥血清對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用（P＞0.05）。③空白血清對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用（P＞0.05）④阿維A溶液與增液湯含藥血清兩者共同干預(yù)組對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用與阿維A干預(yù)組一致，隨著阿維A濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)，阿維A濃度10-6mmol/L、10-7mmol/L阿維A溶液對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用較小，阿維A溶液與增液湯含藥血清兩者共同干預(yù)組對(duì)HaCaT細(xì)胞的抑制作用較單純阿維A干預(yù)較弱，但無明顯差別（P＞0.05）。

2.2各組AQP3 mRNA的表達(dá)凝膠電泳圖所示：條帶在特異性范圍內(nèi)，且有亮度差異，基因測(cè)序符合AQP3。見圖1。

圖1 各組AQP3 mRNA表達(dá)凝膠電泳圖

2.3RT-PCR結(jié)果各組HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA的表達(dá)，見表1。

阿維A溶液可下調(diào)HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA的表達(dá)，并隨濃度的增大下調(diào)作用增強(qiáng)；增液湯含藥血清上調(diào)HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA的表達(dá)，并隨濃度的增大上調(diào)作用增強(qiáng)；增液湯含藥血清干預(yù)阿維A干預(yù)過的HaCaT細(xì)胞，其表達(dá)AQP3 mRNA的水平高于同等濃度的阿維A溶液干預(yù)下的HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3 mRNA的水平。

3　討論

阿維A是用于治療銀屑病第二代維甲酸類藥物，其臨床效果得到廣泛的認(rèn)可，但在其臨床應(yīng)用過程中發(fā)生的不良反應(yīng)——皮膚干燥引發(fā)脫屑、皸裂等現(xiàn)象及瘙癢、疼痛等不適感，不僅影響著患者的生存質(zhì)量，而且皮膚的干燥脫屑，會(huì)造成角質(zhì)層變薄，皮膚脂質(zhì)分泌減少，皮膚屏障保護(hù)功能減退，往往會(huì)增加金黃色葡萄球菌的定植，增加了皮膚潛在感染的危險(xiǎn)性；皮膚中的水含量是維持表皮結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，正常含水量形成的滲透屏障是維持角質(zhì)細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵，當(dāng)角質(zhì)層水含量降到臨界水平以下，正常脫屑所需酶的功能將受損，會(huì)使得角化細(xì)胞黏附堆積在皮膚表面，致使皮膚的干燥、粗糙、脫屑，皮膚屏障功能受損的惡性循環(huán)［1］。所以在阿維A的臨床應(yīng)用過程中有效地增加皮膚的含水量及脂質(zhì)含量緩解皮膚的干燥不適成為提高阿維A臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。

表1各組HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA的表達(dá)

水通道蛋白（AQP）是一類在細(xì)胞膜上與水分子通透性有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，為一組小分子疏水性跨膜蛋白，可增加細(xì)胞膜的水通透性，在機(jī)體水平衡和內(nèi)環(huán)境維持中發(fā)揮重要作用AQP一般選擇性運(yùn)輸水分子，但少數(shù)AQP還可運(yùn)輸甘油、尿素等小分子物質(zhì)，如AQP3。研究發(fā)現(xiàn)，AQP3基因敲除小鼠出現(xiàn)皮膚干燥、彈性降低、皮膚屏障功能修復(fù)及傷口愈合延遲，且選擇性甘油水平減少和表皮保水能力降低［2］。作為干燥性皮膚病，AQP3也與銀屑病相關(guān)，用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色等方法檢測(cè)銀屑病患者皮損和皮損周圍皮膚，發(fā)現(xiàn)AQP3表達(dá)均顯著低于對(duì)照組；與健康對(duì)照組相比，銀屑病患者皮損和皮損周圍皮膚中經(jīng)表皮水喪失增多，皮膚含水量降低［3］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：阿維A可使HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3 mRNA的水平下降，并隨濃度的增大下調(diào)力量增強(qiáng)，說明阿維A治療銀屑病所致干燥等不良反應(yīng)與AQP3的表達(dá)下降有關(guān)。

增液湯為中醫(yī)滋陰潤(rùn)燥的經(jīng)典方劑，由生地黃、麥冬、玄參3味藥組成，在臨床廣泛應(yīng)用于瘙癢癥、干燥綜合征等疾病，取得良好的臨床效果，臨床中我們應(yīng)用增液湯與阿維A膠囊聯(lián)合服用可以緩解服用阿維A患者皮膚黏膜的干燥不適；彭圓等［4］用免疫印跡法測(cè)定：口服增液湯可以提高大鼠皮膚AQP3蛋白水平的表達(dá)，潤(rùn)澤大鼠皮毛。筆者研究發(fā)現(xiàn)，增液湯含藥血清有提高HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3 mRNA的水平的作用，并隨濃度的增大作用力增強(qiáng)，說明增液湯增強(qiáng)皮膚濕潤(rùn)性，緩解阿維A所致皮膚黏膜干燥。

本次研究發(fā)現(xiàn)：阿維A可使HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3 mRNA的水平下降，并隨濃度的增大下調(diào)力量增強(qiáng)；用增液湯含藥血清干預(yù)阿維A干預(yù)過的

HaCaT細(xì)胞，其表達(dá)AQP3 mRNA的水平高于同等濃度的阿維A溶液干預(yù)下的HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3 mRNA的水平。從理論上支持了在同服增液湯可以增加表皮細(xì)胞水通道蛋白3的表達(dá)，提高皮膚含水量及脂質(zhì)含量，緩解皮膚干燥，減輕阿維A的不良反應(yīng)，從而為更有效應(yīng)用阿維A治療銀屑病提供有力的臨床保障。

［1］Choi EH，Man MQ，Wang F，et al.Is endogenous glycerol a determinant of stratum corneum hydration in humans［J］.J Invest Dermatol，2006，126：1356.

［2］Hara M，Ma T，Verkman AS.Selectively reduced glycerol in skin of aquaporin-3-deficientmicemayaccountforimpairedskinhydration，elasticity，and barrier recovery［J］.J Biol Chem，2002，277：46616-46621.

［3］Voss KE，Bollag RJ，F(xiàn)ussell N，et al.Abnormal aquaporin-3 protein expression in hyperproliferative skin disorders［J］.Arch Dermatol Res，2011，303：591-600.

［4］彭圓，田黎明，張翀，等.增液行舟方藥對(duì)津虧便秘衰老模型水通道蛋白表達(dá)的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（11）：2611-2613.

Effect of Acitretin Solution on the Expression of AQP3 mRNA in HaCaT cells and the Regulation of Zengyetang Drug Serum to This Effect

Wang Hongmei1，Liu Lin2，Lin Shuxiang3，Wang Wei3
1.Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital，Tianjin 3000120，China；2.the People's Hospital of Jincheng，Jincheng 048000，China；3.Tianjin Children's Hospital，Tianjin 300134，China

ObjectiveIn order to investigate the influence of acitretin solution on the expression of AQP3 mRNA in HaCaT cells and study the regulation of Zengyetang drug serum.MethodsWe used acitretin solution and Zengyetang drug serum in different concentration to treat HaCaT cells and adopted RT-PCR method to detect AQP3 mRNA of HaCaT cells.ResultsThe expression level of AQP3 mRNA in HaCaT cells treated with acitretin solution declined in a dose-dependent manner.The expression level of AQP3 mRNA in HaCaT cells treated with Zengyetang drug serum raised and also showed dose-dependence. The expression level of AQP3 mRNA HaCaT cells treated with both Zengyetang drug serum and acitretin solution was higher than that only treated with the same concentration of acitretin.ConclusionThe expression of AQP3 mRNA in HaCaT cells treated with acitretin solution declines.And this effect can be held up by Zengyetang drug serum.

Acitretin；Zengyetang；AQP3；HaCaTcells

R

A

1672－0709（2016）03-0151－04

王紅梅，E-mail：yyy961030@163.com

2016-02-29）