組胺H4受體在過敏性紫癜患者外周血及腎臟組織中的表達(dá)

雷蕾，蔣瑾瑾，周霖，顧軍（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院，上海 200433）

論著

組胺H4受體在過敏性紫癜患者外周血及腎臟組織中的表達(dá)

雷蕾，蔣瑾瑾，周霖，顧軍
（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院，上海 200433）

目的比較過敏性紫瘢（HSP）患者外周血及腎臟組織H4R的表達(dá)情況，初步探討H4R在HSP中作用。方法收集126名初次發(fā)病HSP患者及94名健康體檢者外周血標(biāo)本，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法，分別比較HSP急性期組與健康對(duì)照組之間、HSP急性期不同臨床表型之間H4RmRNA的表達(dá)情況。收集HSP腎臟損害患者腎活檢標(biāo)本及健康腎組織標(biāo)本，利用免疫組化比較H4R的表達(dá)情況。結(jié)果HSP急性期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面H4R mRNA表達(dá)水高于健康對(duì)照組（P＜0.01）。腎臟受累組外周血單個(gè)核細(xì)胞表面H4R的表達(dá)明顯高于單純皮膚組、非腎病混合組（P＜0.01）。腎臟受累組腎臟組織中H4R表達(dá)呈陽性，以腎小管為主，陽性率明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論H4R可能參與了HSP的急性期發(fā)病，且與HSP患者的腎臟受損有關(guān)。腎臟H4R的高表達(dá)可能影響HSP的病程及預(yù)后。

組胺H4受體，過敏性紫癜，腎臟損害

組胺H4受體是組胺受體家族中最新的成員［1］，主要分布于人體免疫系統(tǒng)的各類細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞等），在人體的多種自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病及各類炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，組胺H4受體在腎臟的髓襻部有表達(dá)，并參與了糖尿病腎病的發(fā)?。?］。過敏性紫癜（Henoch-Sch?nlein purpura，HSP）作為兒童及青少年中最為常見的系統(tǒng)性血管炎性病變之一，合并的腎臟損害是影響該病預(yù)后的重要因素。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)：組胺H4受體參與了HSP的急性發(fā)病過程。本文通過比較HSP患者外周血及腎臟組織H4R的表達(dá)情況，初步探討H4R在HSP中作用。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象126例HSP患者來自2012年6月—2014年7月在上海長海醫(yī)院就診的患者，其中男60例，女66例，均為病程在1周內(nèi)的首次發(fā)病，年齡為2.5～15歲，平均（9.85±4.73）歲。所有患者在入院前4周內(nèi)均未使用任何抗過敏藥物、糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒性藥物；受試對(duì)象采血前24 h未使用任何藥物；病程中出現(xiàn)腎損害者共42例，其中接受腎臟活檢13例。健康對(duì)照組：94例，外周血來自我院體檢者。男52例，女42例；5例對(duì)照腎組織標(biāo)本取自手術(shù)切除的正常腎組織，并經(jīng)病理證實(shí)腎臟形態(tài)正常。HSP的診斷符合1990年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。

1.2主要試劑PCR引物設(shè)計(jì)與合成（Invitrogen公司），兔抗人anti-H4R（Abcom公司），PV9000試劑盒，DAB顯色試劑盒（上海生工生物工程有限公司），人淋巴細(xì)胞分離液（上海生工生物工程有限公司），RNA提取試劑（武漢博士德生物工程有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑（Biotnt公司）

1.3研究方法

1.3.1外周血H2R及H4R mRNA的檢測抽取患者治療前外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，在2 h內(nèi)用密度梯度離心法分離并提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，異丙醇法濃縮RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行Real-timePCR合成，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，再用定量PCR儀進(jìn)行定量PCR檢測。見表1。

表1　目標(biāo)基因及內(nèi)參基因的引物序列

1.3.2免疫組織化學(xué)染色檢測H4R在腎臟組織中的分布在B超引導(dǎo)下細(xì)針穿刺獲得病理組織，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋切片，制成HE片，并標(biāo)記兔抗人H4R多克隆抗體，經(jīng)DAB顯色后閱片。評(píng)價(jià)方法：選5個(gè)高倍鏡（×400）視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比：0為陰性，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。以上兩者乘積＞3分為陽性［6］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，F(xiàn)檢驗(yàn)驗(yàn)證方差齊性，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HSP患者外周血中H4R mRNA的表達(dá)根據(jù)不同臨床表現(xiàn)，將急性期HSP患兒分為單純皮膚組、非腎病混合組以及腎臟受累組。結(jié)果顯示：各型HSP患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞H4R mRNA表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組（P＜0.01）；腎臟受累組H4R mRNA表達(dá)水平高于單純皮膚組以及非腎病混合組（t=5.151，2.822；P=0.000 2，0.009），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2HSP急性期患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞H4R mRNA水平

2.2HSP患者腎臟組織中H4R的表達(dá)在腎臟病理組織中發(fā)現(xiàn)，腎臟受累組中腎小管上皮細(xì)胞胞漿可見彌漫性細(xì)顆粒狀棕黃色著色，彌漫，及少許腎小球系膜細(xì)胞胞漿可見明顯著色，陽性表達(dá)率為84.6%，而健康對(duì)照組中僅少許腎小管上皮細(xì)胞胞漿淡染，陽性率為0%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 10.879，P=0.001），見圖1。

圖1HSP患兒腎臟組織中H4R的表達(dá)（免疫組化染色×400）

3　討論

H4R作為新發(fā)現(xiàn)的一類組胺受體，其生物學(xué)功能與之前發(fā)現(xiàn)的組胺受體有明顯的不同。其主要廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞，并對(duì)多種細(xì)胞起到趨化調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞膜上的H4R活化步驟是調(diào)節(jié)Th極化的關(guān)鍵，H4R可以通過抑制DC產(chǎn)生IL-12p70［7］，上調(diào)IL-10、IL-16、IL-6、ICAM-1等多種炎癥因子及趨化因子［8］，從而促進(jìn)Th細(xì)胞向Th2型漂移［9］。在H4R介導(dǎo)下，可以通過作用于DC促進(jìn)人和小鼠Th2細(xì)胞極化，從而引起嗜酸性粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的聚合，并促使其遷移［10］。在哮喘小鼠體內(nèi)，通過特異性抗體JNJ7777120阻斷DC表面的H4R，或者敲除H4R基因，可以明顯地減少嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及IgE水平［11］。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過阻斷過敏患者體內(nèi)DC表面的H4R，可以明顯地抑制抗原特異性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答［12］。說明H4R在多種炎癥反應(yīng)中起到免疫調(diào)控作用。

在對(duì)HSP患者外周血中H4R的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比后，筆者發(fā)現(xiàn)急性期HSP中H4R mRNA的表達(dá)較健康對(duì)照組明顯升高。我們推測當(dāng)H4R活化，通過作用于DC，引起多種細(xì)胞因子及趨化因子水平的改變，并進(jìn)一步影響T細(xì)胞的分化，導(dǎo)致TH1下調(diào)，TH2優(yōu)勢活化，從而參與了HSP急性期的發(fā)病。通過對(duì)不同臨床表型的HSP進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)腎臟受累的HSP患兒外周血H4R的表達(dá)要高于單純皮膚組及無腎臟受累的混合組。由于腎臟改變是影響HSP病程及預(yù)后的關(guān)鍵，而H4R可作用于免疫細(xì)胞表達(dá)多種趨化因子及黏附分子［8］，并使其從血液遷移至炎癥局部［13］。因此我們進(jìn)一步觀察了腎臟組織中的H4R的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)急性期HSP患兒腎臟組織中H4R呈明顯的高表達(dá)，并且主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞，而在對(duì)照組中，僅有少量腎小管細(xì)胞淡染。提示H4R與HSP患者的腎臟受損有關(guān)。

目前常規(guī)的腎臟病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中多以有無細(xì)胞增殖、新月體，以及新月體的百分比為標(biāo)準(zhǔn)。近年來的研究表明腎小管及腎間質(zhì)的損傷是影響紫癜性腎炎患者預(yù)后的重要因素之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，髓袢壞死、內(nèi)皮細(xì)胞增生及間質(zhì)區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤等腎小管間質(zhì)改變多與腎小球新月體形成，腎小球系膜增生，腎小球硬化等密切相關(guān)［14］，且腎小管-間質(zhì)損害與否可影響與腎臟病理分級(jí)有相關(guān)性［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP腎臟損害組外周血H4R的表達(dá)高于其他臨床表型，而腎活檢亦發(fā)現(xiàn)腎臟損害患兒H4R表達(dá)呈陽性，且主要表達(dá)于腎小管。提示H4R在腎臟的高表達(dá)可能與HSP的病程及預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，筆者分析外周血單個(gè)核細(xì)胞上的H4R可能通過作用于DC、嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，引起多種細(xì)胞因子及趨化因子水平的改變，參與急性期HSP免疫功能紊亂發(fā)生發(fā)展。而表達(dá)于腎臟局部的H4R被活化后，表達(dá)上調(diào)，激活腎臟固有細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，參與組織損傷；促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤及趨化。但H4R在HSP中具體的調(diào)節(jié)通路，在不同腎臟病理類型中的表達(dá)情況仍有待進(jìn)一步研究。

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Expression of Histamine H4 Receptor in Peripheral Blood Mononuclear Cells and Kidney of HSP Patient

Lei Lei，Jiang Jinjin，Zhou Lin，Gu Jun
Changhai Hospital Affiliated to the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China

ObjectiveIn order to detect the expression of histamine H4 receptor（H4R）in peripheral blood mononuclear cells and kidney of HSP Patients and to explore its role in the pathogenesis of HSP.MethodsRT-PCR was employed to detect the expression of H4R mRNA in peripheral blood mononuclear cells from 126 patients with HSP and 96 healthy controls. Immunohistochemical staining was employed to detect the expression of H4R renal tissue in 15 HSP patients and 6 healthy controls.ResultsThe level of H4R mRNA from peripheral blood mononuclear cells in HSP patients was significantly higher than that in controls（P＜0.01）.The level of H4R mRNA from PBMC in the level of H4R mRNA from peripheral blood mononuclear cells in HSP patients was significantly higher than skin group and non-renal involved group（P＜0.01）.H4R mainly expressed in the human renal tubules of renal involved group，and the positive rate was 86%.While the positive rate of controls were 0.00%（P＜0.01）.ConclusionH4R may be involved in the acute phase of HSP and associated with the renal injury.The H4R high expression of renal may affect the prognosis of HSP.

Histamine 4 receptor；Henoch-Sch?nlein purpura；Renal involvement

R729

A

1672-0709（2016）03-0133-03

上海市衛(wèi)計(jì)委青年基金項(xiàng)目。編號(hào)：20134y194

顧軍，E-mail：gujun79@163.com

2015-12-20）