酶法制備花生粕醒酒多肽

寧慶鵬，王常青*，方 甜，白云云，陳 彤（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

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酶法制備花生粕醒酒多肽

寧慶鵬，王常青*，方 甜，白云云，陳 彤
（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

摘 要：為更合理有效地利用花生粕資源，制備具有醒酒作用的花生粕多肽，本實驗以Alcalase AF 2.4L蛋白酶酶法制備花生粕醒酒肽，經(jīng)分級分離后，通過體外和動物實驗驗證其醒酒效果。結(jié)果表明，花生粕醒酒肽制備最佳工藝條件為：酶解時間3 h、酶解溫度35 ℃、pH 9.5及料液比1∶30（m/V）。該條件下乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）激活率及多肽得率均較高。經(jīng)分級分離后，分子質(zhì)量在1 000～3 000 D的多肽對ADH激活作用最強，激活率為30.47%。G25凝膠色譜分析表明，花生粕多肽中小于3 000 D的多肽占89.55%，ADH激活率為29.25%。動物實驗證明，花生粕多肽對小鼠有顯著的防醉醒酒作用。小鼠血液乙醇含量測定結(jié)果表明，高劑量的花生粕多肽在60～90 min內(nèi)能顯著降低小鼠血液中的乙醇含量。

關(guān)鍵詞：花生粕；醒酒肽；蛋白酶；乙醇脫氫酶激活率

引文格式：

寧慶鵬， 王常青， 方甜， 等.酶法制備花生粕醒酒多肽［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 173-177.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613031. http://www.spkx.net.cn

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花生粕是花生果經(jīng)浸出或壓榨提取油脂后的副產(chǎn)品［1-2］，其中粗蛋白含量為50%～55%，粗脂肪含量為3%～5%，粗纖維含量為4%～7%，此外還含有豐富的黃酮類物和多種礦質(zhì)元素［3-4］，可開發(fā)利用價值較高。在花生粕中，總氨基酸占總蛋白含量的39.65% ，其中必需氨基酸占總蛋白含量的10.85%［5-6］，是一種營養(yǎng)價值較高的植物性蛋白資源。但目前我國各地的花生粕主要被用于飼料和肥料，尚未得到合理利用。隨著我國食品工業(yè)與綠色循環(huán)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展要求，花生粕的開發(fā)與利用受到人們越來越多的重視。近年來的研究表明，小分子的多肽極易被人體吸收，有些多肽還具有一定的生物活性，如以玉米為原料制備的醒酒多肽［7-9］，以沙棘籽制備的抑菌多肽［10］等。目前已有關(guān)于花生粕抗氧化肽的研究報道［11-13］，但未見到用花生蛋白或花生粕制備醒酒肽的研究報道。本實驗用花生粕為原料酶法制備醒酒多肽，研究了該醒酒肽的酶解工藝條件，并進(jìn)行醒酒肽的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）激活率實驗和小鼠醒酒實驗，以期為開發(fā)花生粕的新型醒酒產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生粕購于青島長壽食品有限公司，粗蛋白含量為55.42%。

Alcalase AF 2.4L蛋白酶（酶用量為10 U/mg pro）諾維信生物技術(shù)有限公司；ADH（300 U/mg）、氧化性輔酶Ⅰ 上海源聚生物科技有限公司；肌紅蛋白、胸腺肽、桿菌肽酶、還原性谷胱甘肽（均為分析純） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Sephadex凝膠色譜系統(tǒng)、UVD-680-3紫外檢測儀 上海金達(dá)生物科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申升科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴提取器 國華電器有限公司；卷式超濾-納濾膜組件 北京安德膜分離技術(shù)工程有限公司；SC-3614低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生粕多肽的制備

花生粕粉末過100 目篩后，加入5 倍（m/V）的清水浸泡提取4 h，4 000 r/min離心棄上清液除水溶性蛋白，取沉淀再加2 倍（m/V）的清水，水洗3 次，然后將得到花生粕沉淀低溫烘干備用。取水洗干燥后的花生粕沉淀，按料液比為1∶25（m/V）加入清水，根據(jù)蛋白的含量加入Alcalase AF 2.4L（酶用量為5 000 U/g pro），在酶適宜的條件下酶解2 h。酶解結(jié)束后沸水浴使酶失活，冷卻至室溫后，調(diào)節(jié)pH值至中性，4 000 r/min離心10 min，取上清酶解多肽液濃縮備用［14-16］。

1.3.2 花生粕多肽得率的測定

根據(jù)GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》［17］測定酶解后水溶性蛋白含量和總蛋白含量；根據(jù)QB/T 2879—2007《海洋魚低聚肽粉測定》［18］中三氯乙酸沉淀法測定酶解前蛋白含量。

1.3.3 ADH激活率的測定

采用瓦勒-霍赫法［19］測定花生粕多肽對ADH的激活作用。按下式計算ADH酶活力。

式中：A340 nm為340 nm波長處每分鐘吸光度的增大值；Ew為每毫升酶液中含酶量/（mg/mL）；6.2為還原型輔酶Ⅰ（NADH）的克分子吸光系數(shù)；3.2為反應(yīng)液的總體積/mL。在規(guī)定條件下每分鐘還原l μmol NAD+時所需酶量定義為U。按下式計算ADH激活率。

式中：E樣品為樣品反應(yīng)液的酶活力/U；E空白為空白反應(yīng)液的酶活力/U。

1.3.4 酶解條件的單因素試驗

以多肽得率和ADH激活率作為評價指標(biāo)，分別進(jìn)行酶解時間（1、2、3、4、5 h）、酶解pH值（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）、酶解溫度（20、30、40、50、60 ℃）和料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）的單因素試驗。

1.3.5 酶解條件的正交試驗設(shè)計

為了得到高ADH激活率的花生粕多肽，以單因素試驗為基礎(chǔ)，選取適宜的酶解溫度、酶解時間、酶解pH值以及料液比進(jìn)行L9（34）正交試驗。

1.3.6 花生粕多肽的超濾分級與分離

選用截留分子質(zhì)量為5 000、3 000、1 000 D的超濾膜，得到分子質(zhì)量為＞5 000、3 000～5 000、1 000～3 000、＜1 000 D的4 個組分。將所得的4 個組分多肽和原酶解液分別真空濃縮到相同總氮含量后，取樣進(jìn)行分子質(zhì)量分析和ADH激活率分析。

1.3.7 不同分子質(zhì)量花生粕多肽的分布

采用Sephadex G-25凝膠色譜分析，Marker為肌紅蛋白（17 000 D）、胸腺肽（3 108 D）、桿菌肽酶（1 486 D）和還原性谷胱甘肽（307 D），檢測波長為220 nm。以Marker的分子質(zhì)量對數(shù)（lgMw）作為橫坐標(biāo)，洗脫體積（Ve）作為縱坐標(biāo)繪制曲線，得到回歸方程：Ve=－64.718 lgMw+350.320。根據(jù)峰面積歸一法和方程計算不同分子質(zhì)量多肽的分布及含量［20-21］。

1.3.8 小鼠的防醉和醒酒翻正反射實驗

1.3.8.1 防醉實驗

參照文獻(xiàn)［22］將灌胃醉酒的小鼠仰臥至四肢朝上，保持姿勢30 s作為翻正反射消失的指標(biāo)。取40 只體質(zhì)量為（20±2）g雄性昆明小鼠，在（25±3） ℃、相對濕度（50±10）%的封閉環(huán)境中飼養(yǎng)1 周，實驗前12 h禁食不禁水，隨機(jī)分為4 組：乙醇模型組，花生粕多肽低、中、高劑量組。市售解酒藥建議攝入量為20.2 mg/d，實驗動物給藥量根據(jù)人體攝入量的5、10、20 倍，得到花生粕多肽低、中、高劑量為100、200、400 mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計，下同），乙醇模型組小鼠灌胃劑量為0.1 mL/10 g的生理鹽水，實驗組小鼠灌胃0.1 mL/10 g劑量的花生粕多肽溶液，30 min后所有小鼠均灌胃相同劑量的酒精含量為56 mL/100 mL的白酒。記錄各組給酒后翻正反射消失時間和翻正反射恢復(fù)時間及小鼠醉酒只數(shù)。

為了驗證方法的可行性，本文討論了3種不同的設(shè)計例子。第一個例子是在四邊形陣列天線內(nèi)沿正方形產(chǎn)生電場分布。為此，引入8個輔助偶極子組成的接收天線陣列，偶極子天線陣列沿著正方形電場均勻分布。相鄰偶極子天線之間的距離為80 mm(約0.67λ，λ是自由空間中的波長)。通過求解式(3)，可以得到四邊形天線陣列最優(yōu)的激勵分布，如表1的第二列所示。圖6比較了電場分布模擬結(jié)果和測試結(jié)果，兩者吻合較好。

1.3.8.2 醒酒實驗

方法與實驗指標(biāo)與1.3.8.1節(jié)相同，區(qū)別在于小鼠先灌酒后灌胃樣液。

1.3.9 小鼠血液中乙醇含量的測定

取體質(zhì)量為（20±2） g雄性小鼠，隨機(jī)分為3 組：乙醇模型組和花生粕多肽低、高劑量組（100、400 mg/（kg·d）），每組25 只。各組先灌樣液，實驗組灌胃0.1 mL/10 g樣液，乙醇模型組灌胃0.1 mL/10 g生理鹽水。30 min后，3 組均灌胃0.1 mL/10 g劑量的56 mL/100 mL的白酒，在灌胃30、60、90、120、150 min時眼眶取血，參照血液酒精含量的檢驗方法GA/T 842—2009《血液酒精含量的檢驗方法》［23］中頂空氣相色譜法測定血液中乙醇含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

單因素與正交試驗重復(fù)3 次，除去異常值，取平均值作為結(jié)果。數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件處理，正交試驗結(jié)果采用方差分析，醒酒與防醉實驗采用t檢驗分析，結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

由圖1可知，隨酶解時間延長，多肽得率與ADH激活率在前3 h增長迅速，3 h后增長變緩，故選3 h為正交試驗的基礎(chǔ)條件。酶解溫度為40 ℃時，多肽得率與ADH激活率均達(dá)到最大值，所以選取40 ℃為正交試驗的基礎(chǔ)條件。而多肽得率和ADH激活率在pH 7.0～8.0間迅速上升，pH 9.0～11.0間迅速下降，pH 9.0時多肽得率及ADH激活率均比其他條件時要高，因此選擇pH 9.0作為下一步正交試驗的條件。而料液比在1∶25時酶解多肽得率和ADH激活率均較高，繼續(xù)增加料液比多肽得率和ADH激活率提高緩慢，故選取為正交試驗的基礎(chǔ)條件。

2.2 酶解條件的正交試驗結(jié)果

表 1 酶解條件的正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Orthogonal array designarrangement andcorrespondingexperimental results for the optimization of hydrolysis conditions試驗號 A酶解時間/h B酶解溫度/℃ C酶解pH D料液比（m/V） 多肽得率/% ADH激活率/% 1 1（2.5） 1（35） 1（8.5） 1（1∶20） 32.81 11.37 2 1 2（40） 2（9.0） 2（1∶25） 35.45 9.30 3 1 3（45） 3（9.5） 3（1∶30） 41.21 15.44 4 2（3.0） 1 2 3 47.67 17.51 5 2 2 3 1 33.65 7.27 6 2 3 1 2 48.77 13.35 7 3（3.5） 1 3 2 47.32 13.47 8 3 2 1 3 49.03 9.29 9 3 3 2 1 36.53 8.58 k112.04 14.12 11.34 9.41 k213.04 8.95 11.80 12.04 k310.45 12.46 12.39 14.08 R 2.59 5.17 1.05 4.67

正交試驗的9 個試驗條件的平均多肽得率為41.38%，ADH的平均激活率為11.73%。由表1可知，4 個因素對ADH激活率影響次序為：B（酶解溫度）＞D（料液比）＞A（酶解時間）＞C（酶解pH值）。正交試驗以多肽的ADH激活率為主要指標(biāo)進(jìn)行分析，最終得到制備的最佳酶解工藝條件為A2B1C3D3，即酶解時間3 h、酶解溫度35 ℃、酶解pH 9.5及料液比1∶30。驗證實驗表明，該條件下所制備的多肽的ADH激活率為18.25%，高于正交試驗表中的各試驗號，此時多肽得率為40.05%也在較高水平。由方差分析可知（表2），酶解溫度和料液比對ADH激活率影響顯著，而酶解pH值和時間對ADH激活率影響不明顯（P＞0.05）。

注：*.差異顯著（P＜0.05）。

2.3 花生粕多肽分離及分子質(zhì)量分布分析

表 3 不同種類花生粕溶液的ADH激活率對比結(jié)果Table 3 Comparison of percentageADH activation by peanut meal protein，peanutmeal proteinhydrolysateanditsultrafiltration fraction ＜3000D樣品 花生粕蛋白未酶解液 未分級原酶解液 ＜3 000 D濾出液ADH激活率/% 2.36 20.41 29.25

表 4 各級花生粕多肽的分子質(zhì)量分布Table 4 Molecularweightdistributionof peanut meal peptides樣品 指標(biāo) ＞5 000 D 3 000～5 000 D 1 000～3 000 D＜1 000 D分級分離液 ADH激活率/% 7.24 30.47 5.53未分級原酶解液 多肽分子質(zhì)量分布/% 35.27 8.80 42.41 13.52 ＜3 000 D濾出液 多肽分子質(zhì)量分布/% 6.79 3.66 60.12 29.43

由表3、4可知，花生粕蛋白未酶解液的ADH激活率為2.36%，可能是由于花生粕蛋白中含有部分游離氨基酸，而分子質(zhì)量大于5 000 D的多肽未表現(xiàn)出ADH激活作用，分子質(zhì)量在1 000～3 000 D的多肽對ADH的激活率最高為30.47%，分子質(zhì)量在3 000～5 000 D與小于1 000 D的多肽ADH激活率較小，分別為7.24%和5.53%。為了簡化分離工藝，實驗選取小于3 000 D的分離液進(jìn)行ADH激活率的測定和G25凝膠色譜分析。由圖2可知，該分離液中具有高A D H激活率的1 000～3 000 D的多肽純度從42.41%提高到了60.12%，ADH激活率也由原酶解液的20.41%上升到29.25%，省去了多級分離的繁瑣步驟，且激活率較高，為開發(fā)與生產(chǎn)花生粕醒酒肽提供了依據(jù)。

2.4 小鼠翻正反射實驗結(jié)果

2.4.1 防醉實驗

注：**.與模型組相比差異極顯著（P＜0.01）；*.與模型組相比差異顯著（P＜0.05）。表6同。

由表5可知，低劑量組對于延緩小鼠醉酒和縮短醉酒時間有一定作用，但作用不顯著（P＞0.05）。中劑量組與高劑量組對于延緩醉酒及縮短醉酒時間，分別表現(xiàn)為顯著差異（P＜0.05）和極顯著差異（P＜0.01），說明劑量與防醉之間有一定的依存關(guān)系，同時也顯示了該多肽具有防醉酒作用。

2.4.2 醒酒實驗

表 6 醒酒實驗結(jié)果Table6 Sobering effect of peanutmeal peptides on drunken mice組別 小鼠只數(shù) 醉酒只數(shù) 解酒時間/min模型組 10 10 277.96±19.05花生粕多肽低劑量組 10 10 238.52±12.39花生粕多肽中劑量組 10 10 204.55±17.94**花生粕多肽高劑量組 10 10 190.46±20.39**

由表6可知，與模型組比較，低劑量組不具有顯著的醒酒作用。而中、高劑量組的醒酒作用均表現(xiàn)為極顯著性差異（P＜0.01），說明當(dāng)劑量達(dá)到200 mg/（kg·d）時，該多肽具有良好的醒酒效果，繼續(xù)加大劑量并不能顯著提高醒酒效果。

2.5 小鼠血液中乙醇含量

如圖3所示，各組動物在灌胃乙醇60 min后，血液中乙醇含量達(dá)到最大值，隨著時間的延長，乙醇被機(jī)體代謝，使血液中的乙醇含量逐漸下降。花生粕多肽低劑量組中血液乙醇含量下降趨勢與模型組相近，t檢驗表明兩組間無顯著差異性（P＞0.05）。而花生粕多肽高劑量組在灌胃后，乙醇含量始終明顯低于模型組，在30、120 min處血液中乙醇含量表現(xiàn)出顯著降低（P＜0.05），在60、90 min時，乙醇含量極顯著降低（P＜0.01）。說明高劑量花生粕多肽在酒后60～90 min的時間段內(nèi)醒酒效果最好。

3 結(jié) 論

有研究表明，具有ADH激活率作用的多肽能夠在肝臟中產(chǎn)生穩(wěn)定的輔酶（NAD+），提高ADH的活性，促進(jìn)三羧酸循環(huán)，乙醇代謝為乙醛或乙酸，從而降低血液中乙醇的含量［24-25］。本研究采用Alcalase AF酶解花生粕蛋白制備出有ADH激活作用的醒酒肽，并確定了該多肽的最佳制備工藝條件為：酶解時間3 h、酶解溫度35 ℃、酶解pH 9.5及料液比1∶30；在此條件下制備的多肽得率為40.05%，ADH激活率為18.25%。由超濾分離分段得到分子質(zhì)量在3 000 D以下的多肽組分，比未分級的多肽原液ADH激活率顯著提高，到達(dá)了29.25%。凝膠色譜的分析表明，在3 000 D以下的超濾分離液中，1 000～3 000 D的多肽組分占60.12%，小于1 000 D的多肽占29.43%，其共占總質(zhì)量的89.55%。小鼠醒酒和防醉實驗表明，該多肽在200 mg/（kg·d）的劑量下有良好的醒酒和防醉作用。在灌酒后的60～120 min的時間段內(nèi)，對于降低血液中乙醇含量有顯著作用。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613031

中圖分類號：TS255.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0173-05

收稿日期：2015-09-10

作者簡介：寧慶鵬（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)與功能食品開發(fā)。E-mail：2427988759@qq.com

*通信作者：王常青（1956—），男，教授，學(xué)士，研究方向為食品生物技術(shù)與功能食品開發(fā)。E-mail：wcq@sxu.edu.cn

Preparation of Polypeptides with Sobering Effect from Peanut Meal by Enzymatic Hydrolysis

NING Qingpeng， WANG Changqing*， FANG Tian， BAI Yunyun， CHEN Tong
（College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Abstract:For more reasonable and effective utilization of peanut meal resources， we investigated the preparation of polypeptides with sobering effect by enzymatic hydrolysis of peanut meal with Alcalase AF 2.4L.Polypeptide fractions were separated and their sobering effect was evaluated in vitro and in animals.The results showed that the optimal hydrolysis conditions for preparing polypeptides with sobering effect were determined to be 3 h hydrolysis at 35 ℃ and pH 9.5 with a solid-to-solvent ratio of 1:30 （m/V）.Under these conditions， the percentage activation of alcohol dehydrogenase （ADH） and peptide yield were significantly improved.The fraction with molecular weight in the range of 1 000-3 000 D had the highest activating effect on ADH， with a percentage activation of 30.47%.G25 gel permeation chromatographic analysis showed that the yield of peanut meal peptides with molecular weight less than 3 000 D was 89.55%， giving a percentage activation of ADH of 29.25%.Animal experiments proved that the peanut meal polypeptides could significantly prevent alcoholism and sober up drunken mice.They at high dosages could significantly reduce blood alcohol content in mice in 60-90 min.

Key words:peanut meal； peptide with sobering effect； protease； percentage activation of alcohol dehydrogenase