杜仲對兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清中ET-1和eNOS的影響*

柏魯寧　浩育盈　暢　濤　侯　文　范曉璇　羅　衛(wèi)　張　毅

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦外科(咸陽 712000)

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杜仲對兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清中ET-1和eNOS的影響*

柏魯寧浩育盈?暢濤侯文范曉璇羅衛(wèi)張毅

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦外科(咸陽 712000)

摘要目的：探討杜仲對兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清中ET-1和eNOS的影響及其意義。方法 ：48只日本大耳白兔隨機分為模型組和杜仲組，每組又分為第3天組、第5天組、第7天組及第10天組,每小組6只，采用枕大池二次注血法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型, 按Endo標準對實驗動物進行評分，通過放射免疫法動態(tài)測定血清中ET-1和eNOS的變化。結(jié)果： 與模型組比較，杜仲組動物神經(jīng)功能評分較低，杜仲組血清中ET-1水平較低，而eNOS水平較高，并且在造模后第3天，第5天，第7天差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 杜仲能降低兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清中ET-1水平，而增加eNOS的水平，改善實驗動物的神經(jīng)功能評分。

主題詞蛛網(wǎng)膜下腔出血/中醫(yī)藥療法杜仲/治療應(yīng)用動物實驗兔

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoidhemorrhage，SAH)是一種臨床常見的急癥，其死亡率和致殘率一直高居不下，SAH后引起的腦血管痙攣(Cerebralvascularvasospasm,CVS)是不良預(yù)后的主要原因[1]。目前, 西醫(yī)對SAH后CVS的治療，主要包括尼莫地平、氧自由基清除劑、內(nèi)皮素受體抑制劑、他汀類及抗炎藥物等。這些藥物在一定程度上改善了CVS, 提高了SAH的預(yù)后，然而這些藥物目前大多僅僅局限于動物實驗中[2]。杜仲是我國傳統(tǒng)中藥材，具有擴張動脈血管、降壓、抗氧化、抗炎等作用[3]，但是否能緩解SAH后CVS，目前文獻報道較少。在本研究中，我們采用兔枕大池二次注血法建立CVS模型,動態(tài)觀察CVS病理過程中血漿中內(nèi)皮素1(Endothelin-1ET-1)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的變化及杜仲對其的影響，為CVS的治療提供新思路。

1材料與方法1.1實驗分組和造模日本大耳白兔48只，體重2.5～3.2Kg，平均2.8±0.62Kg,雌雄不限，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供。將實驗動物隨機分為2大組：模型組和杜仲組各24只，每組又分為第3天組、第5天組、第7天組及第10天組,每小組6只。分別在第2次注血后第3天，第5天，第7天，第10天經(jīng)耳中央動脈抽血2ml后快速處死。

模型的建立參照文獻[4]，造模成功后，模型組常規(guī)喂養(yǎng)，杜仲組在常規(guī)喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，每日杜仲煎劑5ml/Kg灌胃2次。

1.2標本處理經(jīng)兔耳中央動脈取血2ml,置于預(yù)先加入10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)30ul和抑肽酶40ul的試管內(nèi),混勻,在4°C,3000r/m離心10min,分離上清液,放于-80°C的冰箱內(nèi)保存。測定前,把標本在室溫或冷水中復(fù)融,再次4°C,3000r/m離心5min,取上清液測定,分離上清液按照ET-1、eNOS試劑盒說明進行測量。

1.3神經(jīng)功能評分觀察建模后第3天，第5天，第7天，第10天神經(jīng)缺損癥狀進行功能性評分。按Endo標準[5]將兔神經(jīng)功能障礙分為4 級。

2結(jié)果2.1神經(jīng)功能評分模型組和杜仲組都出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，而且在造模后第5天最為嚴重，第10天還有輕度神經(jīng)功能障礙，兩組神經(jīng)功能評分的比較第3天、 第5天、 第7天小組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

2.2血清ET-1水平 兩組血清ET-1水平在第2次注血后5d達到最高，至第7天開始下降，但杜仲組血清ET-1水平較模型組低，與模型組比較，杜仲組第3天、 第5天、 第7天小組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。而血清eNOS水平在第2次注血后5d降到最低，至第7天開始升高，但杜仲組血清eNOS水平較模型組高，與模型組比較，杜仲組第3天、 第5天、 第7天小組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表3。

表1　各組動物的神經(jīng)功能評分

注：與模型組比較，△P<0.05

表2　SAH后各組動物血清ET-1的變化

注：與模型組比較，△P<0.05

表3　 SAH后各組動物血清eNOS的變化

注：與模型組比較，△P<0.05

3討論SAH是臨床常見的一種出血性卒中類型，其死亡率和致殘率一直高居不下，SAH后引起的CVS是不良預(yù)后的主要原因[1]。近年來對SAH后的病理機制進行了大量的實驗和臨床研究，其可能的機制主要包括溶血產(chǎn)物的刺激、血管內(nèi)皮細胞功能障礙、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管壁炎癥反應(yīng)及細胞凋亡等[6]，比較公認的觀點是SAH后血管內(nèi)皮細胞功能障礙是引起CVS的主要原因。

ET-1是血管內(nèi)皮細胞分泌的主要縮血管物質(zhì)之一, 由212個氨基酸殘基組成, 最終由皮素轉(zhuǎn)化酶將其剪切成具有活性的成分，其生物效應(yīng)通過2種亞型的受體(ETA、ETB)介導(dǎo)，ETA受體主要位于血管平滑肌細胞, 具有介導(dǎo)血管收縮和增殖作用，對腦血管的痙攣起著決定性作用[7-8]。近年來，大量的臨床和實驗研究表明，SAH后血清中ET-1含量增高，內(nèi)皮素受體的拮抗劑、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶的抑制劑可以抑制ET-1含量的增高，并能改善腦血管痙攣[9]。

NO是最主要的血管舒張因子之一，是由一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,NOS)催化L-精氨酸而生成的，NOS有三種亞型，其中eNOS主要分布于血管內(nèi)皮細胞，其催化釋放的NO主要維持血管的舒張狀態(tài)[10]。腦血管中NO的主要要作用是松弛血管平滑肌細胞，NO激活了cGMP依賴的蛋白激酶, 經(jīng)過細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 引起肌球蛋白輕鏈脫磷酸、鉀離子通道激活, 伴隨電壓依賴的鈣離子通道的關(guān)閉, 最終導(dǎo)致血管平滑肌細胞的松弛。SAH后eNOS下調(diào)，而且功能受到抑制，導(dǎo)致NO的水平降低及其舒血管效應(yīng)的缺失在CVS中起重要作用[7]。

本實驗結(jié)果表明，與模型組比較，杜仲組動物神經(jīng)功能評分較低，杜仲組血清中ET-1水平較低，而eNOS水平較高，并且在造模后第3天，第5天，第7天差異有統(tǒng)計學(xué)意義。杜仲作為中藥在我國已有悠久的歷史，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》中都有記載，味甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)?，F(xiàn)代研究表明其具有擴張動脈血管、降壓、抗氧化、抗炎等作用[11]。根據(jù)本文結(jié)果推測，在SAH后的CVS發(fā)展過程中，杜仲能增加兔血清eNOS含量，降低ET-1，減輕腦血管痙攣改善實驗動物的神經(jīng)功能癥狀。杜仲具有多種藥理作用，包含多種生物活性物質(zhì)，其有效的單體和緩解CVS的進一步機制還有待深入研究。

參考文獻

[1]VanGijnJ,KerrRS,RinkelGJ.Subarachnoidhaemorrhage[J].Lancet， 2007, 369(9558):306-318.

[2]宋錦寧,安吉洋. 蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷及神經(jīng)保護治療的研究進展[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2013，34(6):695-703.

[3]馮晗,周宏灝,歐陽冬生.杜仲的化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2015,20(6):713-720.

[4]柏魯寧,周雄波,趙曉平,等. 一種兔腦血管痙攣模型的建立[J]. 汕頭大學(xué)學(xué)報，2008,21(4):199-201.

[5]CarpiA，NicoliniA，AntonelliA，etal.Cytokinesinthemanagementofhighriskoradvancedbreastcancer：anupdateandexpectation[J].CurrCancerDrugTargets，2009,9(8):888-903.

[6]KamilG,MervynDI,RickM,etal.Effectofendothelinreceptorantagonistsonclinicallyrelevantoutcomesafterexperimentalsubarachnoidhemorrhage:asystematicreviewandmeta-analysis[J].JournalofCerebralBloodFlow&Metabolism, 2015, 35(7):1085-1089.

[7]趙旭東, 史繼新.蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣發(fā)病機制及治療的研究進展[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2010,23(2):218-222.

[8]劉昊,王海濤.大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血腦基底動脈內(nèi)皮素受體表達的變化 [J].陜西醫(yī)學(xué),2009，38(4):402-404.

[9]CiureaAV,PaladeC,VoinescuD,etal.Subarachnoidhemorrhageandcerebralvasospasm-Literaturereview[J].JournalofMedicineandLife,2013,6(2):120-125.

[10]李鳴華,姚鑫.內(nèi)皮素-1、一氧化氮和一氧化氮合成酶在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的作用機制探討[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,2007,34(4):389-392.

[11]王志宏，彭勝，雷明盛,等 .杜仲主要生物活性研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013，25(9): 1302-1309.

(收稿2016-03-28；修回2016-04-19)

通訊作者?

【中圖分類號】R743.35

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.074

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2011K12-74)