加味苓桂術(shù)甘方對(duì)酒精性脂肪肝防治作用的實(shí)驗(yàn)研究*

晁　旭　李　莉　王越月　王國(guó)全　杜　靜 　鄭旭銳

趙家榮　安慶靈　陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)

?

加味苓桂術(shù)甘方對(duì)酒精性脂肪肝防治作用的實(shí)驗(yàn)研究*

晁旭△李莉▲王越月△王國(guó)全杜靜△鄭旭銳

趙家榮安慶靈陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)

摘要目的：研究加味苓桂術(shù)甘方對(duì)酒精性脂肪肝防治作用。方法：SD雄性大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只。50只給予15%乙醇灌胃，同時(shí)飼喂高脂飼料，制備酒精性脂肪肝大鼠模型。模型組動(dòng)物給予生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物給予不同劑量的加味苓桂術(shù)甘湯和乙醇灌胃。通過(guò)觀(guān)察和分析大鼠一般情況、肝臟指數(shù)、肝臟組織病理形態(tài)、血清肝功能和血脂含量等指標(biāo)，研究加味苓桂術(shù)甘方對(duì)酒精性脂肪肝防治效果。結(jié)果：與模型組比較，加味苓桂術(shù)甘方干預(yù)酒精性脂肪肝動(dòng)物模型后，行為有明顯改善。病理分析顯示，加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量組肝臟脂肪變性和炎癥明顯減輕。血清肝功能檢測(cè)結(jié)果顯示，加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量組動(dòng)物用藥后血清ALT、AST、 TG、TC 和 FFA 水平均明顯下降。結(jié)論：加味苓桂術(shù)甘方對(duì)酒精性脂肪肝具有顯著的防治作用。

主題詞脂肪肝，酒精性/中西醫(yī)結(jié)合療法苓桂術(shù)甘湯/治療應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大鼠

酒精性脂肪肝(Alcoholicfattyliverdisease,AFL) 是指由于長(zhǎng)期酒精攝入過(guò)量而導(dǎo)致的肝臟疾病[1]。隨著人們生活水平的提高，我國(guó)酒精性脂肪肝患者急劇增長(zhǎng)[2]。研究顯示，我國(guó)飲酒人群中80%以上的重度飲酒者患有一定程度的酒精性脂肪肝，其中10%～35%可發(fā)展為酒精性肝炎，10%～20%可發(fā)展為酒精性肝硬化。AFL在早期是可以逆轉(zhuǎn)的。經(jīng)戒酒和治療后，肝損害可逐漸得以改善[3]。如果不及時(shí)治療，演變?yōu)楦卫w維化則不可逆轉(zhuǎn)[4]。因此，在積極戒酒之外尋找療效可靠的藥物就顯得尤為重要。

脂肪肝在中醫(yī)上歸屬于“脅痛”、“肥氣”、“肝著”、“痰濁”、“積聚”的范疇。嗜酒食肥甘厚味，傷及脾胃；加之久臥久坐，體豐痰盛，或情志失常，長(zhǎng)期憂(yōu)思郁怒，感受濕熱疫毒等，均可導(dǎo)致肝失疏泄，脾失健運(yùn)，水濕停聚，痰濁郁結(jié)，氣滯血瘀，最終形成濕痰瘀阻互結(jié)，痹阻肝臟脈絡(luò)而成。

加味苓桂術(shù)甘方是用于臨床的治療酒精性脂肪肝的方劑，效果良好[5]，但對(duì)其機(jī)理尚未進(jìn)行深入研究。本研究采用酒精性脂肪肝大鼠模型為研究對(duì)象，通過(guò)觀(guān)察給藥前后動(dòng)物肝臟組織病理形態(tài)，檢測(cè)大鼠給藥前后肝重比、肝功能、血脂含量，探討加味苓桂術(shù)甘顆粒對(duì)酒精性脂肪肝的治療作用。

1材料 1.1藥品與試劑加味苓桂術(shù)甘方由石山楂、決明子、澤瀉、茯苓、蒼術(shù)、荷葉、桂枝、甘草、丹參、桃仁、姜黃、川芎和葛花13種中藥材組成。本研究中所有藥材均購(gòu)自陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定。藥物稱(chēng)好后，水煎制成混懸液，-4℃冰箱保存?zhèn)溆?。Spague-Dawlay(SD)大鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2酒精性脂肪肝大鼠模型的制備SD雄性大鼠60只，隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組，模型組加味苓桂術(shù)甘方大劑量組、加味苓桂術(shù)甘方中劑量組、加味苓桂術(shù)甘方小劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，10只正常對(duì)照組動(dòng)物飼喂常規(guī)飼料。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1～3d，另外50只大鼠每天按15ml/Kg體重的劑量給予含乙醇15%(體積分?jǐn)?shù))的白酒灌胃；從第4天起每天按15ml/Kg體重的劑量給予含乙醇52%(體積分?jǐn)?shù))的白酒灌胃。同時(shí)，50只大鼠飼喂富含脂肪的飼料(普通飼料與豬油比例為85∶15，每公斤飼料給予硫酸亞鐵15g)，自由飲水，連續(xù)6周。

2實(shí)驗(yàn)分組與給藥正常對(duì)照組動(dòng)物，1d1次蒸餾水水灌胃，每次4ml，自由進(jìn)食。模型對(duì)照組，給予酒精性脂肪肝模型大鼠1d1次生理鹽水灌胃，每次4ml，自由進(jìn)食。加味苓桂術(shù)甘顆粒小劑量組，給予酒精性脂肪肝模型大鼠灌胃加味苓桂術(shù)甘湯劑，每次4ml(濃度為0.5g/ml)，1d1次，自由進(jìn)食。加味苓桂術(shù)甘顆粒中劑量組，給予酒精性脂肪肝模型大鼠灌胃加味苓桂術(shù)甘湯劑灌胃，每次4ml(1g/ml)，1d1次，自由進(jìn)食。加味苓桂術(shù)甘顆粒大劑量組，給予酒精性脂肪肝模型大鼠灌胃加味苓桂術(shù)甘湯劑灌胃，每次4ml(2g/ml)，1d1次，自由進(jìn)食。陽(yáng)性對(duì)照組，給予酒精性脂肪肝模型大鼠每天按20ml/Kg體重的劑量灌服美他多辛溶液，1d1次，自由進(jìn)食。另外，除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物在給予加味苓桂術(shù)甘湯劑灌胃的同時(shí)，隔天按15ml/Kg給予含乙醇體積分?jǐn)?shù)為52%(體積分?jǐn)?shù))白酒灌胃1次；同時(shí)飼喂富含脂肪的飼料。白酒與味苓桂術(shù)甘湯劑分別在上午和下午灌服，連續(xù)6周。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1大鼠行為學(xué)等大體情況觀(guān)察 每日觀(guān)察并記錄動(dòng)物皮毛顏色、反應(yīng)能力和活動(dòng)情況等，每隔3天稱(chēng)量動(dòng)物1次，并記錄數(shù)據(jù)。

3.2大鼠肝臟指數(shù)計(jì)算連續(xù)給藥6周完后，所有動(dòng)物處死后，摘取全部肝臟，分別稱(chēng)量動(dòng)物體重和肝臟重量，然后計(jì)算肝臟指數(shù)。

3.3肝臟組織病理形態(tài)學(xué)分析肝組織用生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干水分，放入10 %的甲醛溶液固定。然后，每個(gè)肝臟大約取0.2cm3組織，石蠟包埋后，進(jìn)行連續(xù)切片，每張切片的厚度約為2μm；烤片后，經(jīng)過(guò)脫蠟、梯度酒精脫水、蘇木素和伊紅染液染色、酒精梯度脫水和封片等過(guò)程后，制備HE組織切片。在光學(xué)顯微鏡下放大400倍觀(guān)察組織切片，分析肝組織的壞死狀況。

3.4大鼠給藥前后血清肝功能檢測(cè)取大鼠靜脈血2ml，3000r/min，離心0.5h后，取血清; 然后用生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的含量。

3.5大鼠給藥前后血脂含量檢測(cè)2ml大鼠血液放入試管傾斜靜置2h后, 2000r/min離心10min，取上清液得血清。然后，按照血脂檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、脂肪酸(FFA)的含量。

3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4結(jié)果4.1 各組大鼠總體情況正常組大鼠活動(dòng)敏捷，毛發(fā)有光澤，緊貼皮膚，鼻、唇清潔濕潤(rùn)，大小便正常，體重自然增加，未發(fā)現(xiàn)死亡動(dòng)物。模型組動(dòng)物反應(yīng)遲鈍，嗜睡，飲食逐漸減少，第5周以后出現(xiàn)毛發(fā)干枯、蓬松且易脫落，鼻、唇有分泌物。與模型組相比較，加味苓桂術(shù)甘方小劑量組動(dòng)物行為無(wú)明顯區(qū)別；中劑量和大劑量組動(dòng)物前4周反應(yīng)和模型組動(dòng)物類(lèi)似，后期顯著改善。

4.2大鼠給藥前后肝重比與正常組比較，模型組大鼠的肝臟指數(shù)顯著增加；與模型組比較，加味苓桂術(shù)甘方各劑量組動(dòng)物用藥后大鼠肝臟指數(shù)均有所改善，其中中劑量和大劑量組大鼠肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1　加味苓桂術(shù)甘方對(duì)AFL大鼠肝臟指數(shù)的影響(n=10)

注：相對(duì)于對(duì)照組，△P<0.01；相對(duì)于模型組，▲P<0.05

4.3肝臟組織病理形態(tài)學(xué)分析HE染色顯示，正常組肝臟內(nèi)無(wú)明顯脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射排列(圖 1,A)。AFL模型組動(dòng)物肝臟彌漫大量脂肪變性，細(xì)胞體積增大，呈現(xiàn)大量空泡，炎癥明顯(圖 1,B)。加味苓桂術(shù)甘方小劑量動(dòng)物肝臟也有一些空泡，匯管區(qū)域伴有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖 1，C)。加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量組肝臟空泡顯著減少，脂肪變性和炎癥明顯減輕(圖 1，D、E)。

4.4給藥前后血清肝功能變化與正常組比較，AFL模型組大鼠血清中ALT、AST的水平明顯升高。與AFL模型組比較，加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量組動(dòng)物藥物干預(yù)后血清中ALT、AST水平顯著降低(P<0.01)(表 2)。

4.5給藥前后血脂含量變化結(jié)果顯示，與正常組比較，AFL模型組大鼠血清中TG、TC和FFA水平均明顯升高；與AFL模型組比較，加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量組動(dòng)物藥物干預(yù)后血清中TG、TC和FFA水平顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2　加味苓桂術(shù)甘方對(duì)AFL大鼠血清肝功能的影響(n=10)

注：相對(duì)于對(duì)照組，△P<0.01；相對(duì)于模型組，▲P<0.05 ，◇P<0.01

組 別劑量(mg/Kg)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FFA(mmol/L)正常對(duì)照組/1.86±0.23▲2.14±2.47▲0.48±0.12◇模型對(duì)照組/2.54±0.22△3.22±0.56△1.38±0.47△加味苓桂術(shù)甘方小劑量組102.28±1.233.24±0.891.23±0.47加味苓桂術(shù)甘方中劑量組202.12±0.46▲2.32±0.57▲0.63±0.23▲加味苓桂術(shù)甘方大劑量組401.94±0.76▲2.21±0.76▲0.52±0.25◇美他多辛組201.88±0.49▲2.18±0.48▲0.51±0.24◇

注：相對(duì)于對(duì)照組，△P<0.01；相對(duì)于模型組，▲P<0.05 ，◇P<0.01

5討論隨著我國(guó)人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，酒精性肝病的發(fā)病率逐年增高。研究表明，女性每日酒精飲用量超過(guò)10～20g，男性超過(guò)20～40g即可形成酒精性肝病[5]。酒精性脂肪肝可進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化和肝硬化，對(duì)于身體有嚴(yán)重危害。如果對(duì)于酒精性脂肪肝進(jìn)行早期干預(yù)，可降低肝纖維化和肝硬化發(fā)生的幾率。

加味苓桂術(shù)甘方由石山楂、決明子、澤瀉、茯苓、蒼術(shù)、荷葉、桂枝、甘草、丹參、桃仁、姜黃、川芎和葛花13種中藥材組成。方中茯苓、澤瀉、蒼術(shù)健脾滲濕為君藥；桂枝通陽(yáng)化氣，桃仁、紅花和姜黃活血行氣化瘀，川芎、赤芍養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，使肝氣條達(dá)，血脈通暢，為臣藥；山楂消食化積、散瘀行滯，決明子清肝明目，潤(rùn)腸通便，為佐藥；葛花解酒醒脾。甘草調(diào)和諸藥為使藥。全方共奏化痰解毒，逐瘀化積之功。

研究結(jié)果顯示，加味苓桂術(shù)甘方干預(yù)酒精性脂肪肝動(dòng)物模型后，中劑量和大劑量組動(dòng)物前4周反應(yīng)和模型組動(dòng)物類(lèi)似，后期行為有明顯改善。病理分析顯示，加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量組肝臟脂肪變性和炎癥明顯減輕。血清肝功能檢測(cè)結(jié)果顯示，與AFL模型組比較，加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量可顯著降低大鼠血清中ALT、AST水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，本研究結(jié)果也顯示，加味苓桂術(shù)甘方各劑量組大鼠血清TG、TC和FFA水平均有明顯下降。綜上所述，加味苓桂術(shù)甘方對(duì)酒精性脂肪肝具有顯著的防治作用，但其具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]SusmanS，DentCW，SkaraS，etal．Alcoholicliverdisease(ALD)：anewdomainforpreventioneffort[J]．SubstUseMisuse，2002，37(14)：1887-1904．

[2]Neusehwander-TetriBA.CaldwellSI-LNonalcoholicsteatohepatitis：summaryofanAASLDsingletopicconference[J].Hepatology，2003，37(5)：1202-1219．

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.酒精性肝病診療指南[J].肝臟，2006,1：66-68．

[4]牛術(shù)仙, 仲云，李勇.肝脂清治療酒精性脂肪肝大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2011,21(2)：97-97.

[5]黃蜂.加味苓桂術(shù)甘顆粒治療酒精性脂肪肝痰瘀互結(jié)證30例[J].陜西中醫(yī)，2012，33(2)：180-182.

[6]AminiM,RunyonBA.Alcoholichepatitis2010:aclinician'sguidetodiagnosisandtherapy[J].WorldJGastroenterol，2010,16: 4905-4912.

(收稿2016-04-02；修回2016-04-24)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R575.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.071

LingguiZhugandecoctiononpreventionandtreatmentofalcoholicfattyliver
ShaanxiUniversityofChineseMedicine(Xianyang712046)
ChaoXu

ABSTRACTObjective: To examine the effect of LingguiZhugan decoction on prevention and treatment of alcoholic fatty liver. Methods:60 male Spague-Dawlayrats were randomly divided into 6 groups with 10 rats in each group. 50 rats were fed with high fat diet and ethanol fed to establish the experimental model of alcoholic fatty liver. The animal model group were administered saline, and the animals of experimental group were treated with different doses of Linggui Zhugan and ethanol gavage. General conditition, liver index, liver pathology, hepatic function and blood lipid contents of rats were to observed and analysied to investigate the effect of LingguiZhugan decoction on prevention and treatment of alcoholic fatty liver. Results:Compared with the model group, behaviors of animals of nonalcoholic fatty liver disease model group treated with LingguiZhugan decoction have significantly improved. Pathological analysis showed that the liver steatosis and inflammation of animalstreated with LingguiZhugan decoction at large dosage and medium dosage significantly reduced. Serum liver function test results show that ALT, AST of serum in groups of animals treated with LingguiZhugan decoction at large dosage and medium dosage were significantly decreased .Also TG, TC and FFA levels were significantly decreased in groups of animals treated with LingguiZhugan decoction at large dosage and medium dosage. Conclusion: LingguiZhugan decoction has significant preventive effect on alcoholic fatty liver.

KEY WORDSFatty liver, alcoholic / integrated Chinese traditional and western medicine therapyLing Gui Zhu Gan Tang/therapeutic usesAnimal experimentation Rats

*陜西省咸陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014K04-02)

△陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽(yáng) 712000)

▲上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(上海201966)