強(qiáng)直性脊柱炎與HLA-B27基因亞型的相關(guān)性研究

王　華，甄拴平，黨麗君，張樹(shù)琪

(陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科　721001)

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強(qiáng)直性脊柱炎與HLA-B27基因亞型的相關(guān)性研究

王華，甄拴平，黨麗君，張樹(shù)琪

(陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科721001)

摘要:目的探討不同人類(lèi)白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)基因亞型與強(qiáng)直性脊柱炎(AS)的相關(guān)性。方法采集骨科、針灸風(fēng)濕科門(mén)診及住院患者靜脈全血,應(yīng)用基因分析法定性檢測(cè)HLA-B27，其中HLA-B27陽(yáng)性的AS確診患者380例，并選取HLA-B27陽(yáng)性健康對(duì)照組50例，同時(shí)通過(guò)序列特異性引物PCR(PCR-SSP)技術(shù)檢測(cè)AS患者和健康對(duì)照組的HLA-B27基因亞型。結(jié)果380例AS患者中，檢出HLA-B2704亞型217例(57.1%)，HLA-B2705亞型143例(37.6%)，HLA-B2707亞型11例(2.9%)，HLA-B2711亞型9例(2.4%)；50例HLA-B27陽(yáng)性健康對(duì)照組中，檢出HLA-B2706亞型23例(46.0%)，HLA-B2709亞型21例(42.0%)，HLA-B2704亞型4例(8.0%)，HLA-B2705亞型2例(4.0%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。結(jié)論寶雞地區(qū)AS患者HLA-B27基因亞型以B2704和B2705為主，與寶雞地區(qū)漢族人群AS的發(fā)病呈強(qiáng)相關(guān)；B2706及B2709為該地區(qū)保護(hù)亞型。

關(guān)鍵詞:強(qiáng)直性脊柱炎；HLA-B27；PCR-SSP;亞型

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種自身免疫疾病，目前尚未明確病因，認(rèn)為屬于遺傳性疾病。AS是一種以骶髂關(guān)節(jié)炎及中軸關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯穆匝仔匝尻幮约怪P(guān)節(jié)病。AS致殘率高，早期診斷對(duì)患者的治療非常重要。人類(lèi)白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)的檢測(cè)有助于AS的診斷，在我國(guó)90%以上的AS患者HLA-B27呈陽(yáng)性[1]，同時(shí)HLA-B27存在多個(gè)等位基因，不同亞型的分布有著地域和人種的差別。筆者選取了寶雞地區(qū)HLA-B27陽(yáng)性AS患者及健康人進(jìn)行HLA-B27基因亞型檢測(cè)，探討本地區(qū)主要致病亞型及可能的保護(hù)亞型，以期為本地區(qū)AS的防治提供有用的依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2010年1月至2014年7月本院骨科、針灸風(fēng)濕科門(mén)診及住院患者，均為寶雞及周邊地區(qū)漢族個(gè)體，其中HLA-B27陽(yáng)性的AS確診患者380例(符合1984年AS紐約修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)[2])，男247例，女133例，男女比例1.86∶1，平均(35.00±8.37)歲；健康對(duì)照組50例，均為寶雞地區(qū)漢族HLA-B27 陽(yáng)性健康人個(gè)體之間無(wú)血緣關(guān)系，男33例，女17例，男女比例1.94∶1，平均(34.00±6.40)歲。兩組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑PCR儀器購(gòu)自杭州博日，HC-2517高速離心機(jī)購(gòu)自安徽中佳公司；JY600C電泳儀購(gòu)自北京君意公司，全血DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自臺(tái)灣貝索公司。BAG HISTO HYPE HLA-B27 Hight試劑盒和EXTRA-GENE試劑盒由德國(guó)BAG公司提供，上海培清JS-300凝膠圖像分析儀，Gene Quant Pro型DNA濃度測(cè)定儀。

1.3方法

1.3.1應(yīng)用序列特異性引物PCR(PCR-SSP)定性檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞HLA-B27清晨空腹抽取患者及健康對(duì)照組靜脈血1.0 mL，EDTA抗凝，各項(xiàng)操作及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.3.2HLA-B27基因亞型測(cè)定采用PCR-SSP技術(shù)檢測(cè)HLA-B27陽(yáng)性患者及健康對(duì)照人群HLA-B27亞型的DNA。(1)DNA模板的制備：采用EXTRA-GEN試劑盒(鹽析法)，濃度>50 ng/μL，A260/A280的比值為1.6～2.0。(2)PCR擴(kuò)增：使用BAG HISTO HYPE HLA-B27 Hight試劑盒(可檢測(cè)HLA-B2701至B2743亞型)，PCR反應(yīng)體系的配制和PCR擴(kuò)增反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(3)凝膠配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g的瓊脂糖溶解于100 mL 0.5×TBE溶液(濃度為2.0%)。(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析：準(zhǔn)確吸取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入電泳槽內(nèi)瓊脂糖凝膠中，采用150 mV電壓電泳10 min，然后用JS-300凝膠圖像分析儀照相，最后用BAG HISTO HYPE HLA-B27 Hight格局分析表進(jìn)行HLA-B27亞型分型結(jié)果的判定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，各組HLA-B27陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

HLA-B27陽(yáng)性AS患者年齡分布情況，見(jiàn)表1。AS患者及健康對(duì)照組HLA-B27基因亞型檢出情況，見(jiàn)表2。AS患者及健康對(duì)照組HLA-B27基因亞型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。

表1　　HLA-B27陽(yáng)性AS患者年齡分布情況

表2　　AS患者及健康對(duì)照組HLA-B27基因亞型檢出情況[n(%)]

3討論

目前AS確診主要是依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。成年患者AS的診斷主要依賴(lài)于詳細(xì)的病史和細(xì)致的體格檢查，臨床表現(xiàn)為腰、骶及下肢關(guān)節(jié)疼痛，晚期患者脊柱僵硬、活動(dòng)受限，甚至引起其他組織的傷害，嚴(yán)重影響患者的生活[3]；對(duì)于有慢性炎性背痛的青少年，特別是缺乏足夠的骶髂關(guān)節(jié)炎影像學(xué)證據(jù)時(shí)，HLA-B27檢測(cè)就顯得尤為重要。AS患者遍及世界各地，其總體發(fā)病率約為7.3/100 000，在我國(guó)AS發(fā)病率約為0.3%，多見(jiàn)于中青年男性，且AS致殘率高，故早期確診并及時(shí)治療對(duì)患者非常重要。

本研究中，11～20、21～30、31～40歲的HLA-B27陽(yáng)性率分別為38.6%、34.5%、33.1%，顯著高于其他年齡段，且這些青壯年人群的臨床癥狀和體征普遍不夠典型，大多數(shù)缺乏足夠的骶髂關(guān)節(jié)炎影像學(xué)證據(jù)。因此，對(duì)本地區(qū)疑似AS患者應(yīng)盡早檢測(cè)HLA-B27，有助于青壯年AS患者的早期診斷和針對(duì)性治療，同時(shí)結(jié)合AS家族史對(duì)于AS的預(yù)防具有積極的意義。盡管HLA-B27有助于AS診斷，但HLA-B27也可能出現(xiàn)于銀屑病性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和腸性關(guān)節(jié)炎等疾病，因此，臨床上對(duì)于不典型病例有必要進(jìn)行HLA-B27基因亞型檢測(cè)，這樣有利于AS與上述疾病的鑒別診斷。

目前認(rèn)為HLA-B27與AS可能有以下關(guān)系[4]：HLA-B27為AS的致病菌或者感染因子受體；HLA-B27與外來(lái)的抗原反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原耐受性；HLA-B27增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞活性；HLA-B27為免疫應(yīng)答基因，與機(jī)體是否容易感染起決定性因素。

資料顯示，HLA-B27有81個(gè)亞型，分別命名B2701～B2782(B2722等位基因后被刪除)。B2705為分布最廣的亞型，可能是其他基因的祖基因，即其他基因是由其進(jìn)化而來(lái)[5],本研究采用的分型方法可檢測(cè)HLA-B2701～B2743共43個(gè)亞型，涵蓋了大多數(shù)的常見(jiàn)基因亞型。

研究顯示，AS的患病率與HLA-B27的出現(xiàn)頻率和種族分布差異緊密相關(guān)，約90%的AS白人患者HLA-B27呈陽(yáng)性，而在非洲黑人和日本人中，幾乎不存在AS和HLA-B27相關(guān)性(HLA-B27的陽(yáng)性率低于1%)。同時(shí)不同HLA-B27亞型有著不同的地域和人種分布特點(diǎn)[6]。在世界范圍內(nèi)，除了西非的塞內(nèi)加爾、岡比亞外，B2705和AS及相關(guān)的脊柱關(guān)節(jié)病有明顯相關(guān)性。B2702主要存在于白種人，中東猶太人和北非人；B2704、B2706、B2707只在東方人種中發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)也以B2704最多見(jiàn)，約占55%，是主要的HLA-B27亞型，但B2704的分布頻率在東方各民族間又存在一定差異[6]，究其原因，主要受HLA-B27易感性因素或地理環(huán)境因素差異的影響。

有報(bào)道認(rèn)為，B2705、B2704、B2702亞型與AS的發(fā)生呈正相關(guān)，B2703、B2708、B2709、B2707與AS的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[7-9]，而B(niǎo)2706亞型則被普遍認(rèn)為是AS的保護(hù)性基因。本研究結(jié)果顯示，寶雞地區(qū)HLA-B27陽(yáng)性患者亞型分布依次為B2704、B2705、B2707、B2711，且B2704亞型占57.1%，B2705亞型占37.6%。50例HLA-B27陽(yáng)性健康對(duì)照組檢出4種亞型：HLA-B2706亞型23例(46.0%)，HLA-B2709

亞型21例(42.0%)，HLA-B2704亞型4例(8.0%)，HLA-B2705亞型2例(4.0%)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。證實(shí)本地區(qū)AS患者中HLA-B27主要亞型分布為B2704亞型與B2705亞型，且B2704亞型為優(yōu)勢(shì)亞型；而B(niǎo)2706亞型及B2709亞型僅見(jiàn)于HLA-B27 陽(yáng)性健康者，提示B2706亞型及B2709亞型為本地區(qū)保護(hù)亞型。

綜上所述，通過(guò)對(duì)寶雞地區(qū)HLA-B27陽(yáng)性的患者及健康對(duì)照人群HLA-B27分型研究，發(fā)現(xiàn)了本地區(qū)HLA-B27基因主要致病亞型和可能的保護(hù)亞型，對(duì)于癥狀體征不典型患者和疑難患者的診斷和鑒別診斷具有一定價(jià)值。但由于檢測(cè)病例數(shù)量有限，未能涉及本地區(qū)HLA-B27基因動(dòng)態(tài)表達(dá)量與AS患者疾病活動(dòng)指數(shù)的相關(guān)性，后續(xù)將進(jìn)一步開(kāi)展這方面的工作，為本地區(qū)AS的防治提供必要的探索。

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作者簡(jiǎn)介：王華，女，主管檢驗(yàn)技師，主要從事臨床免疫學(xué)及微生物學(xué)檢驗(yàn)研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.021

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)14-1954-03

(收稿日期：2016-01-19修回日期：2016-03-22)

Study on correlation between ankylosing spondylitis and HLA - B27 subgenotype

WANGHua,ZHENShuanping,DANGLijun,ZHANGShuqi

(DepartmentofClinicalLaboratory,BaojiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Baoji,Shaanxi721001，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the correlation between different HLA-B27 subgenotype and ankylosing spondylitis(AS).MethodsThe whole venous blood was collected from the outpatients and inpatients of the orthopedics,acupuncture and rheumatism departments and HLA-B27 was qualitatively detected by using the gene analysis method.Among them,380 cases of AS were HLA-B27 positive,and 50 cases of HLA-B27 positive were selected as the healthy control group.Then the HLA-B27 subgenotypes were detected by using the sequence specific primers PCR(PCR-SSP) technology.ResultsAmong 380 cases of AS,217 cases (57.1%) of HLA-AS B2704 subgenotype,143 cases (37.6%) of HLA-B2705 subgenotype,11 cases (2.9%) of HLA-B2707 subgenotype and 9 cases (2.4%) of HLA-B2711 subgenotype were detected out;among 50 cases of HLA-B27 positive in the healthy control group,23 cases (46.0%) of HLA-B2706 subgenotype,21 cases (42.0%) of HLA-B2709 subgenotype,4 cases (8.0%) of HLA B2704 subgenotype and 2 cases (4.0%) of HLA-B2705 subgenotype were detected out,the differences between the two groups were statistically significant (P=0.002).ConclusionThe subgenotypes of HLA-B27 among the AS patients in Baoji area are dominated by the genotype B2704 and B2705,which is strongly correlated with the occurrence of AS among Han population in Baoji area;B2706 and B2709 are the protective subgenotypes in this area.

Key words:ankylosing spondylitis；HLA-B27；PCR-SSP；subtype